全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(6): 1003−1008 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家公益性行业(农业)科研专项(200903035), 国家自然科学基金项目(31171829)和国家“十二五”科技支撑计划项目(2012BAD
19B04)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 曹远银, E-mail: caoyy66@yahoo.com.cn, Tel: 13604000358
第一作者联系方式: E-mail: hanjiandong16@163.com (韩建东); E-mail: moxingyin@163.com (李伟华)
** 同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2011-09-04; Accepted(接受日期): 2012-02-22; Published online(网络出版日期): 2012-03-29.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120329.1117.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01003
小麦抗秆锈病基因 Sr33的微卫星标记
韩建东 1,2,** 李伟华 2,** 曹远银 2,* 宫志远 1 姚 强 1
1山东省农业科学院农业资源与环境研究所, 山东济南 250100; 2沈阳农业大学植物免疫研究所, 辽宁沈阳 110866
摘 要: 小麦抗秆锈病基因 Sr33 对强毒力小种 Ug99 和我国多数小麦秆锈菌小种具有良好抗性。以感病品种
McNair701和来源于 Tetra Canthatch/Triticum tauschii的单基因系 Sr33为亲本, 选用我国流行的小种 34MKG, 对作图
群体 161个 F2单株及其 F2:3家系进行抗性鉴定分析, 利用分离群体集群分析法对位于小麦 1D染色体上的 57对微卫
星引物进行扩增多态性筛选。获得 2 对在亲本及 F2抗、感群体间揭示多态性的共显性标记 Xbarc152 和 Xcfd15, 位
于 Sr33两侧, 与目标基因的遗传距离分别为 2.4 cM和 2.1 cM。
关键词: 微卫星标记; 小麦秆锈病; Sr33; 基因定位
Microsatellite Markers Linked to Stem Rust Resistance Gene Sr33 in Wheat
HAN Jian-Dong1,2,**, LI Wei-Hua2,**, CAO Yuan-Yin2,*, GONG Zhi-Yuan1, and YAO Qiang1
1 Institute of Agricultural Resources and Environment, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China; 2 Institute of Plant Immu-
nology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China
Abstract: Gene Sr33 confers resistance not only to Ug99, but also to most Puccinia graminis f. sp. tritici races in China. A map-
ping population, consisting of 161 F2 plants and F2:3 families derived from the cross between susceptible wheat cultivar
“McNair701” and a Tetra Canthatch/Triticum tauschii line carrying single Sr gene Sr33, were inoculated with Chinese prevalent
race 34MKG to locate this resistance gene using microsatellite markers. A total of 57 microsatellite markers covering chromosome
1D were used in bulked segregation analysis (BSA) based on resistance identification at seedlings stage. Two codominant markers,
Xbarc152 and Xcfd15, were obtained, which were located at both sides of Sr33. The genetic distances of Xbarc152 and Xcfd15 to
the target gene were 2.4 cM and 2.1 cM, respectively. These closely linked markers can be used in marker-assisted selection of
wheat breeding against stem rust disease.
Keywords: Microsatellite marker; Wheat stem rust; Sr33; Gene location
小麦秆锈病(Puccinia graminis f. sp. tritici)对小
麦破坏性极大, 曾在大多数小麦种植国家和地区出
现过毁灭性的流行[1]。对最重要小麦抗秆锈病基因
Sr31 有强毒力的秆锈菌新毒性小种 Ug99 (又称
TTKSK)的出现再次对小麦生产构成威胁[2], 该小种
于 1999年在乌干达被发现, 因此被命名为Ug99; 随
后传入肯尼亚、埃塞俄比亚、也门, 2007 年已经传
播到伊朗 [3]; 在肯尼亚还监测到该小种的变异体 ,
比原小种具有更大的危害性。全球约占 90%种植面
积的小麦品种对 Ug99 不具有抗性, 为此世界粮农
组织专门成立了“博伦厄全球小麦锈病协作网”
(Borlaug Global Rust Initiative, BGRI), 并提出了通
过培育多抗性品种持久控制小麦秆锈病的策略[4]。
BGRI 2011年度研讨会上有关专家指出, Ug99已蔓
延东非和南非全部地区, 逼近亚洲地区, 入境美国
和澳大利亚只是时间问题。
截至目前, 已发现超过 45个小麦抗秆锈病基因,
对病原菌不同小种表现抗性[5], 其中 Sr33 来源于粗
山羊草(Aegilops tauschii), 不但对 Ug99具有抗性[6],
还对我国主要流行的小种 21C3CTH、21C3CFH、
21C3CKH、21C3CKR、21C3CTR、34MKG、34MKH、
34C2MKR、34C2MFG、34C2MFR等也表现良好的
1004 作 物 学 报 第 38卷

抗性[7]。但由于该基因表现中等抗性, 在育种过程中
容易被其他抗性基因的效应掩盖, 导致生产品种中
缺失该基因, 特别是全球性 30多年的小麦秆锈病持
续控制, 致使对抗秆锈病育种关注度不够。张书绅
等[8]对国内 94个小麦抗源品种进行了抗秆锈病基因
的推导, 发现仅有 3个品种(3.2%)含有 Sr33。Sr33为
小种专化性抗性基因, 单基因抗性容易被快速进化
的小种所克服, 实现小麦对秆锈病持久抗性的有效
方法是将多个抗病基因聚合到同一品种中。分子辅
助选择育种可以克服传统育种方法耗时长、聚合基
因检测困难等缺点, 快速准确地获得包含多个目标
基因的育种材料[9]。利用 SSR、DArT、RFLP、RAPD
等技术标记的抗秆锈病基因主要有 Sr2[10]、Sr5[11]、
Sr6[12]、Sr9a[9]、9e[11] 、Sr22[13-15]、Sr24[16]、Sr25[17]、
Sr26[16] 、 Sr31[18] 、 Sr36[4] 、 Sr38[19] 、 Sr39[20] 、
Sr1A/1R[21-22]和 SrR[23]等。Mago 等[22]报道了一个与
Sr33 连锁的 STS 标记 ABC156, 但实用性不好。本
研究旨在利用微卫星技术筛选与 Sr33紧密连锁的标
记, 以供分子辅助育种及小麦种质资源中 Sr33 基因
的筛选。
1 材料与方法
1.1 试验材料
抗病亲本小麦单基因系 Sr33 (Tetra Canthatch/
Triticum tauschii)、感病亲本 McNair701、单基因系
Sr33 与 McNair701 杂交 F1单株自交产生的 F2分离
群体(161株)及 F2:3家系用于遗传分析和标记筛选。
供试小麦秆锈菌单孢菌系 34MKG 对 McNair701 表
现高侵染型 4, 对单基因系 Sr33表现低侵染型(2−)。
以上材料均由沈阳农业大学植物免疫研究所提供。
1.2 抗秆锈性检测和评价
小麦子叶完全展开后, 利用小麦秆锈菌生理小
种 34MKG (毒力公式为 Sr7a, 9d, 9e, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 17, 21, 26, 30, 31, 33, 35, 36, 37, 38 / 2, 5, 6,
7b, 8a, 9a, 9b, 9f, 9g, 16, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 27,
28, 29, 32, 34), 分别对亲本和 161个 F2单株接种鉴
定。为确定 F2单株的基因型, 并且区分纯合和杂合
抗病株, 选取各 F2:3家系中的 16 株接种鉴定, 分析
其分离情况。采用涂抹法接种, 黑暗保湿 16 h后放
于玻璃温室内培养 , 温度保持在 18~21 , ℃ 接种后
15 d 左右, 待发病完全后, 按照 Roelfs[24]的标准观
察记载侵染型。用卡方测验拟合检验抗感分离比。
1.3 微卫星标记分析
采集新鲜的小麦叶片, 按 CTAB 法[25]提取亲本
和全部 161个 F2单株的DNA。选 10份抗病单株DNA
等量混合建立抗病池, 10份感病单株 DNA等量混合
建立感病池, 利用 BSA法[26]快速筛选具有多态性的
引物, 再用所有多态性的引物对 161 个 F2单株筛选
分析, 最后计算该微卫星位点与 Sr33的遗传距离。
目前已将 Sr33 定位在小麦 1D 染色体上, 根据
Roder等[27]和 http://wheat.pw.usda.gov/发表的微卫星
引物序列, 选取 57 对位于 1D 染色体上的微卫星引
物(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)进行
引物筛选。扩增反应体系为 25 μL, 包括 10×buffer
(含 Mg2+) 2.5 μL, 10 mmol L−1的 dNTPs 0.5 μL, 5 µmol
L−1的引物 1 μL, 5 U μL−1 Taq酶 0.2 μL, 30 ng μL−1
模板 DNA 2 μL。反应条件为 94℃预变性 5 min; 94℃
变性 50 s, 50~60℃(退火温度依引物而定)复性 60 s,
72℃延伸 90 s, 35个循环; 72℃延伸 10 min, 4℃保
存。扩增循环在 Hybaid Limited PCR仪上进行。
取 8 μL 甲酰胺凝胶载样缓冲液与 PCR 产物混
合, 95℃变性 5 min后, 置于冰上冷却。将 6%变性聚
丙烯酰胺凝胶在 75 W恒功率下预电泳 30 min, 上样,
保持恒功率 75 W电泳 0.5~3.0 h (视扩增片段长度和
同源片段间相差大小而定)。银染显色[28]后观察照相。
1.4 遗传距离分析及标记的验证
为对 Sr33 等位基因进行遗传分析, 根据扩增结
果将全部 F2 单株分为亲本扩增带型和杂合扩增带
型。通过对 F2和 F2:3分离结果的卡方拟合检验, 确
定抗病基因类型。用 MapMaker3.0 软件计算扩增位
点和目的基因的遗传距离, 用MapDraw软件绘制连
锁图谱。
1.5 差异片段的回收、再扩增及序列测定
采用聚丙烯酰胺凝胶回收试剂盒回收特异性片
段, 再用原引物及原程序扩增回收产物。将 PCR 纯
化产物与载体连接、转化。将所得阳性克隆送由上
海生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.6 标记有效性的验证
选取 41个小麦育成品种和品系用于验证微卫星
标记在辅助选择育种中的有效性, 包括 3个携带 Sr33
的品系、1 个经基因推导可能含有 Sr33 的抗源材料
PM13[8]、3 个小麦秆锈菌繁种材料(无抗性 , 不含
Sr33)、10个不含 Sr33的生产品种及 24个来自单基
因系 Sr33 (Tetra Canthatch/T. tauschii)×Little Club
(LC)的 F2单株(TL1~TL24)。
第 6期 韩建东等: 小麦抗秆锈病基因 Sr33的微卫星标记 1005


2 结果与分析
2.1 亲本和 F2 分离群体的抗性鉴定结果和遗传
分析
单基因系 Sr33 对小麦秆锈菌生理小种 34MKG
表现抗性反应型 2−, 感病亲本 McNair701 表现感
病反应型 4。由于 2个家系未得到种子, 故只鉴定了
159 个 F2单株的基因型, 其中纯合抗病单株 44 个,
杂合抗病单株 77个, 纯合感病单株 38个, 卡方检测
结果表明符合 1∶2∶1的抗感分离比(表 1), 说明单
基因系 Sr33对 34MKG的抗性是由 1对显性基因控
制的。
2.2 分子标记的筛选和遗传连锁分析
利用抗感池筛选到 2个多态性引物, 分别是Xbarc
152和 Xcfd15 (表 2)。用这 2对引物在 161个 F2单
株中进行检测, 发现它们在亲本和纯合抗病、感病
单株中都扩增出 1条特异条带, 在杂合个体中同时存
在 2条特异带(图 1)。
引物 Xbarc152和 Xcfd15对 161 F2单株的检测
结果与 F2:3 家系抗病性鉴定结果一致, 卡方测验结
果显示其分离比也符合 1∶2∶1 (表 1)。连锁分析结
果表明, 这 2 个微卫星标记分别位于抗病基因 Sr33
的两侧, 并且与 Sr33 紧密连锁, 遗传距离为分别为
2.4 cM和 2.1 cM (图 2)。结合 Röder等[27]的报道和
美国农业部谷物基因网站(http://wheat.pw.usda.gov/)
上公布的小麦微卫星图谱, 进一步确定该基因位于
小麦染色体 1DS上。

表 1 单基因系 Sr33 × McNair701 F2群体中 Sr33等位基因及其微卫星标记位点的分离
Table 1 Segregations of gene Sr33 and its microsatellite markers in F2 population derived from the cross of Sr33 single line ×
McNair701
植株数 No. of plants 位点
Locus 纯合抗病 R 杂合抗病 H 纯合感病 S
总数
Total
χ2 (1:2:1)
Sr33 44 77 38 159　 0.61
Xcfd15 43 80 38 161 0.32
Xbarc152 46 75 40 161 1.20
根据 F2:3家系的反应型判断 F2单株的基因型。χ20.05,2 = 5.99。
R: homozygous resistance; H: heterozygous resistance; S: homozygous susceptibility. Genotypes of F2 individuals were determined
according to F2:3 phenotypes. χ20.05,2 = 5.99.

表 2 与抗秆锈病基因 Sr33连锁的微卫星标记引物序列
Table 2 Primer sequences of microsatellites linked to resistance gene Sr33
引物名称
Primer
正引物序列
Forward sequence (5′–3′)
反引物序列
Reverse sequence (5′–3′)
Xbarc152 CTTCCTAAAATCGGGCAACCGCTTGTTG GCGTAATGATGGGAGTGGCTATAGGGCAGTT
Xcfd15 CTCCCGTATTGAGCAGGAAG GGCAGGTGTGGTGATGATCT



图 1 微卫星标记 Xbarc152 (A)和 Xcfd15 (B)在 F2群体中的分离(6%聚丙烯酰胺电泳)
Fig. 1 Segregation patterns of microsatellite markers Xbarc152 (A) and Xcfd15 (B) in F2 population (6% PAGE)
PR: 抗病亲本; PS: 感病亲本; R: 纯合抗病株; S: 纯合感病株; H: 杂合抗病株。
PR: resistant parent; PS: susceptible parent; R: resistant individual; S: susceptible individual; H: heterozygous individual.
1006 作 物 学 报 第 38卷



图 2 Sr33及其紧密连锁微卫星标记在小麦 1DS染色体短臂上
的连锁关系
Fig. 2 Genetic linkage of Sr33 and its adjacent microsatellites
on the short arm of chromosome 1D of wheat
2.3 特异性片段测序
回收引物 Xcfd15 在 Sr33 单基因系中扩增到的
特异带, 以它们为模板按原始的 PCR 条件扩增, 经
琼脂糖凝胶检测, 扩增片段与用亲本为模板的扩增
片段大小一致, 说明特异片段回收成功。该二次扩
增产物经产物纯化试剂盒纯化后用于克隆和测序 ,
序列长为 161 bp, 含有的微卫星序列为(CT)7CG(CT)3
(图 3)。
2.4 标记的有效性验证
标记 Xbarc152和 Xcfd15对 41个小麦品种和品
系的检测结果与实际鉴定结果基本一致(表 3), 在含
有 Sr33 的小麦品系 Tetra Canthatch/T. tauschii、
RL6044、Sr33/Cook*4及 PM13中分别扩增出与 Sr33
连锁的等位标记条带, 在不含 Sr33 的小麦品种中均



图 3 引物 Xcfd15扩增的抗病标记片段的序列特征
Fig. 3 Sequence feature of resistant fragment produced by Xcfd15

表 3 抗病基因 Sr33微卫星标记在不同来源的小麦品种和育种品系中的应用性验证
Table 3 Validation of Sr33-linked microsatellite markers in wheat cultivars and breeding lines derived from diverse genetic origin
品种
Variety
来源
Source
Sr33 Xbarc152 Xcfd15 F2家系
F2 line
Sr33 Xbarc152 Xcfd15
Tetra Canthatch/T. tauschii 加拿大 Canada + + + TL1 + + +
RL6044 加拿大 Canada + + + TL2 ± ± ±
Sr33/Cook*4 + + + TL3 ± ± ±
PM 13 墨西哥 Mexico +/? + + TL4 – – –
McNair 701 美国 USA – – – TL5 ± ± ±
Little Club 美国 USA – – – TL6 – – –
中国春 Chinese Spring 中国 China – – – TL7 ± ± ±
TL8 + ± + 龙麦 28 Longmai 28 中国黑龙江 Heilongjiang, China – – –
TL9 + + +
TL10 ± ± ± 小冰麦 3号 Xiaobingmai 3 中国吉林 Jilin, China – – –
TL11 + + +
TL12 ± ± ± 辽春 19 Liaochun 19 中国辽宁 Liaoning, China – – –
TL13 – – –
TL14 – – – 沈免 85 Shenmian 85 中国辽宁 Liaoning, China – – –
TL15 ± ± ±
TL16 + + + 川麦 44 Chuanmai 44 中国四川 Sichuan, China – – –
TL17 ± ± +
TL18 ± ± ± 绵阳 31 Mianyang 31 中国四川 Sichuan, China – – –
TL19 – – –
TL20 ± ± ± 扬麦 158 Yangmai 158 中国江苏 Jiangsu, China – – –
TL21 + + +
TL22 – ± – 西农 139 Xinong 139 中国陕西 Shaanxi, China
– – –
TL23 ± ± ±
周 19 Zhou 19 中国河南 Henan, China – – – TL24 – – –
华麦 8号 Huamai 8 中国湖北 Hubei, China – – –
F2家系来自 Sr33 (Tetra Canthatch/T. tauschii) × little Club F2群体。
F2 lines originated from Sr33 (Tetra Canthatch/T. tauschii) × little Club F2 population.
第 6期 韩建东等: 小麦抗秆锈病基因 Sr33的微卫星标记 1007


未扩增到此条带, 而且 24 个 F2单株(TL1~TL24)的
抗、感基因型与两引物扩增到的 DNA条带类型结果
基本吻合。说明 Xbarc152 和 Xcfd15 可在育种中实
现对抗秆锈病基因 Sr33的辅助选择。
3 讨论
自 20 世纪 60 年代以来, 我国逐步形成抗秆锈
病品种(基因)布局与菌源基地治理的较为合理的控
病自然体系, 取得了秆锈病持久控制的显著成效。
但是该控病体系如遇到 Ug99 及其变异菌株的侵袭,
将会变得十分脆弱。一是因为这一控病体系以普遍
利用抗病基因 Sr31 (来源于 1B/1R易位片段)为基础,
将受到Ug99的强烈威胁; 二是Ug99在我国堪称“超
毒小种”, 它的联合毒力谱为 Sr5、6、7b、8a、8b、
9a、9b、9d、9e、9f、11、15、17、21、30、31 和
38, Ug99变异体还增加了对 Sr24这一重要抗病基因
的毒力[6]。为避免出现 Ug99在我国流行而造成小麦
生产毁灭性损失, 必须以预防为主。利用主效抗病
基因培育的品种有很强的抗性, 而聚合多个主效基
因将有助于育成持久抗性品种。
粗山羊草(Ae. tauschii)是普通小麦(T. aestivum)
D 染色体组的祖先供体种 [29], 小麦抗秆锈病基因
Sr33和 Sr45就来源于粗山羊草 1D染色体[30-31]。Sr33
基因对小麦秆锈菌表现中等抗性, 在不同的小麦遗
传背景下, 其侵染型可能有所不同, 因此通过基因
表型进行鉴定比较困难; 它虽不是抗性很强的基因,
却具有广谱抗性, 兼抗新小种 Ug99 和我国大多数
小麦秆锈菌生理小种, 与其他抗病基因一起转移到
同一小麦品种中能够表现出对小麦秆锈病的持久抗
性。早期研究将 Sr33定位于 1DL上[32], 但近期研究
发现它位于 1DS上, 且与 Gli-D1位点紧密连锁[33]。
目前, 有关 Sr33 的有效性标记报道较少, 仅 Sam-
basivam等有简单的 Sr33微卫星标记报道(http://ses.
library.usyd.edu.au/bitstream/2123/3267/1/P066.pdf),
未见正式发表文献。2006—2009 年, 我们在这方面
开展了大量标记筛选研究, 最终在 1D 染色体上的
57 对微卫星引物中找到 Sr33 两侧的紧密连锁标记
Xbarc152和 Xcfd15。我们建立的目标基因与标记的
连锁顺序与 Somers 等[34]报道的物理图谱基本一致,
进一步证实 Sr33位于 1DS。
本研究通过 17 个含有和不含 Sr33 的小麦品种
(品系)、杂交组合单基因系 Sr33×Little Club构建的
另一 F2群体, 证实标记 Xbarc152 和 Xcfd15 能够在
对 Sr33进行抗性育种时实现分子辅助选择。小麦抗
秆锈病基因 Sr22、Sr26、Sr31和 Sr33都是抗谱较广
的基因, 对一个抗大多数或所有秆锈菌小种的小麦
品种来说, 通过基因推导的方法很难确定它所携带
的准确抗病基因, 无法判断它含有 Sr22、Sr26、Sr31
和 Sr33 的具体情况, 然而分子标记辅助选择技术可
成功地解决这一问题。目前, 已经获得 Sr22、Sr26、
Sr31[13-16,18]的紧密连锁分子标记。本研究筛选到 2
个与 Sr33 紧密连锁的微卫星标记, 可以在以含有抗
病基因 Sr33为亲本的育种过程中加以利用。
4 结论
选用小麦 1D 染色体上的 57 对微卫星引物, 利
用 Tetra Canthatch/T. tauschii×McNair701 F2群体和
F2:3家系进行分子标记分析和抗病性鉴定, 获得 2个
与 Sr33紧密连锁的共显性标记 Xbarc152和 Xcfd15,
位于 Sr33 的两侧, 遗传距离分别为 2.4 cM 和 2.1
cM。这 2个标记经验证可用于小麦抗秆锈病育种的
分子标记辅助选择。
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