全 文 ：Vol. 30 , No. 6
pp. 602～607 　June , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 6 期
2004 年 6 月 　602～607 页
实时荧光定量 PCR技术在转基因玉米检测中的应用研究
陈　颖1 , 3 　徐宝梁1 　苏　宁1 　葛毅强2 　王曙光1 Ξ
(1 中国进出口商品检验技术研究所 ,北京 100025 ;2 科技部中国农村技术开发中心 ,北京 100045)
摘　要 　采用实时荧光定量 PCR 技术 ,通过使用特异的引物和探针 ,对玉米中的内源基因 Invertase 和转基因玉米 Mon
810、Event 176 中的外源基因进行了定量检测 ,建立了商业化转基因玉米 Mon 810 ( YieldGard)和 Event 176 (Maximizer)的定
量 PCR 检测方法。该方法的检测灵敏度小于 0. 01 % ,是国际上设定的转基因最低限量的 100 倍。
关键词 　定量 PCR 技术 ;转基因玉米 Mon 810 ( YieldGard) ;转基因玉米 Event 176 (Maximizer) ;转基因检测
中图分类号 :S513
Real2time Quantitative PCR Detection of Genetically Modif ied Maximizer○R Maize
and YieldGard○R Maize
CHEN Ying1 , 3 , XU Bao2Liang1 , SU Ning1 , GE Yi2Qiang2 , WANG Shu2Guang1
(1 China Import and Export Commodity Inspection Technology Institute , Beijing 100025 ;2 China Agricultural Technology Development Centre , Beijing 100045 , Chi2
na)
Abstract 　A reliable and simple Real2time quantitative polymerase chain reaction method for detection of genetically modi2
fied maize with ABI Prism 7 700 was established in this paper. A set of PCR primers and probes was designed specific to
transgenic commercial maize Mon 810 and Event 176. The detection limit is less than 0. 01 % which is 100 times lower than
labeling threshold of European Union.
Key words 　Real2time quantitative PCR ; YieldGard○R Maize Mon 810 ; Maximizer ○R Maize Event 176 ; GMO detection
　　GMO( Genetically Modified Organism) 食品对人类
健康及生态环境的潜在影响日益受到关注 ,转基因
产品标识已成为各国转基因产品监管的重要部分。
已有欧盟、日本、韩国、澳大利亚、新西兰等多个国家
和地区出台了对转基因生物产品实施强制性标签的
制度 ,规定了食品中转基因成分含量的最低标识限
量。挪威是第一个要求对转基因产品进行含量标识
的国家 , 该国对转基因成分的限量标识低限为
2 %[1 ] ;而瑞士与欧盟规定的限量标识低限为
1 %[2 ,3 ] ,韩国、日本、泰国也有相应的转基因限量标
识法规 ,标识低限分别为 3 %、5 %、3 %～5 %。我国
于 2002 年 1 月 5 日颁布了《农业转基因生物标识管
理办法》,该管理办法明确规定对转基因生物的标识
管理就是为了规范农业转基因生物的销售行为 ,引
导农业转基因生物的生产和消费 ,保护消费者的知
情权。因此 ,针对不断商品化的转基因产品建立相
应的定性特别是定量检测方法 ,是进一步加强我国
在转基因产品监管方面的重要技术保障。
实时荧光定量 PCR 技术 ( Real2time Fluorescence
Quantitative PCR Detection)是近年来定量 PCR 技术中
兴起的最新定量检测技术。在该技术体系中 ,除了
有两条普通引物即与目标 DNA 特异序列相结合的
引物外 ,还有一条在 5′和 3′端分别标记了报告荧
光染料基团 (R)和淬灭荧光染料基团 (Q) ,并与 PCR
产物特异片段相结合的寡核苷酸探针。当探针完整
时 ,R 基团发出的荧光被 Q 基团所淬灭 ,一旦探针被
切断 ,淬灭作用消失 ,R 基团发出的荧光就可以被检
测到。在 PCR 反应过程中 ,上下游引物与目标 DNA
的特异序列相结合 ,探针则与 PCR 产物相结合。在
PCR 延伸阶段中 Taq DNA 酶的 5′—3′外切活性将Ξ基金项目 :科技部社会公益研究专项资金项目“进出口食物中转基因成分的检测研究”。
作者简介 :陈颖 (1972 - ) ,女 ,博士后/ 高级工程师 ,北京市朝阳区高碑店北路甲 3 号 (100025) 。Tel : 010285753925 (O) E2mail : yqychen @ya2
hoo. com. cn
Received (收稿日期) :2002212209 ,Accepted(接受日期) :2003208212.

探针水解 ,Q 基团和 R 基团由于探针水解而相互分
开 ,导致报告荧光信号增加。荧光信号的增加可被
检测到 ,它是模板被 PCR 扩增的直接标志。通过采
用一系列已知浓度梯度的标准样品 ,建立标准曲线 ,
即可对待测样品进行定量检测。
转基因玉米 Mon 810 ( YieldGard ○R) 和 Event 176
(Maximizer ○R)是目前商业化的主要转基因玉米品种 ,
他们分别被转入了经过修饰 (钝化)和未经修饰的苏
云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白 CryIA 基因 ,均具有抗玉
米螟的特性。本文通过应用实时荧光定量 PCR 技
术 ,建立以上两种转基因玉米的定量检测方法 ,以期
今后为我国对转基因产品实施定量标识提供有力的
技术支持。
1 　材料与方法
1. 1 　材料
1. 1. 1 　样品 　　转基因成分含量分别为 5 %、2 %、
1 %、015 %、011 %、0 % ( W/ W ) 的转基因玉米 Mon
810 和转基因成分含量分别为 2 %、1 %、015 %、
011 %、0 %( W/ W ) 的转基因玉米 Event 176 均购自
Fluka 公司 (Fluka ,Buchs ,Switzerland) 。
1. 1. 2 　主要试剂 　　DNA 提取试剂盒 Wizard Ge2
nomic DNA Purification Kit 购自美国 Promega 公司 ;定
量反应用配套试剂盒 Taq Man Universal PCR Master
Mix 购自美国 ABI公司。
1. 1. 3 　仪器与设备 　　离心机、涡旋震荡器、恒温
箱、核酸蛋白分析仪 (BIO2RAD) 、定量 PCR 仪 (ABI
Prism 7700) 。
1. 2 　方法
1. 2. 1 　DNA 提取 　　按 DNA 试剂盒所述方法提取
样品 DNA ,经核酸蛋白分析仪测定浓度后 ,将其稀
释为终浓度 50 ng/μL ,备用。
1. 2. 2 　内源基因的定性 PCR 检测 　　玉米内源基
因 IVR 检测的引物如表 1 中所示 ,反应在 50μL 的
反应体系中进行。其中 10 ×buffer 5μL , dNTP (10
mmol/ L) 2μL ,引物 (20μmol/ L) 各 1μL ,模板 DNA
(50 ng/μL) 2μL , Taq 聚合酶 2 U ,扩增条件为预变性
94 ℃3 min ;变性 94 ℃45 s ,退火 60 ℃30 s ,延伸 72 ℃
1 min ,35 个循环 ;后延伸 72 ℃7 min。
1. 2. 3 　实时荧光 PCR 检测
1. 2. 3. 1 　扩增用引物、探针 　定量检测所用引物、
探针[4 ] (见表 1)均由上海生工公司合成。
1. 2. 3. 2 　扩增反应体系及条件 　实时定量 PCR 扩
增采用 ABI 公司提供的试剂盒 ,反应在 25μL 的反
应体系中进行。其中模板 DNA 2μL (50 ng/μL) ,10
μL 2 × Taq Man Universal PCR Mastermix (Applied
Biosystems) ,引物各 015μL (20μmol/ L) ,探针 1μL
(10 mmol/ L) 。扩增反应采用两步法 ,具体条件为 :
预变性 95 ℃ 10 min ;变性 95 ℃ 20 s ,退火 60 ℃ 1
min ,40 个循环。
表 1 　扩增所用引物和探针
Table 1 　Primer pairs and fluorogenic probes used in this study
检测系统
PCR system
引物/ 探针a
Primers/ Probe
序列b
Sequence (5′—3′)
扩增片段大小
Amplicon size
(bp)
内源基因
Endogenous gene
IVR2F
IVR2R GGCCGGATCGTCATGCTCTACTTGGCGTCCGACTTGACCCACT 122
Mon 810 玉米
Mon 810 maize
Mon 8102F
Mon 8102R
Mon 8102FAM CATTTGGAGAGGACACGCTGACGTGACAGTAACAAAGGCAGA(FAM) AAGCTGACTCTAGCAGATCTACCGTCTTCGG(TAMRA) 111
Event 176 玉米
Event 176 maize
Bt 1762F
Bt 1762R
Bt 1762FAM CTCGCTTCCGTGCTTAGCTTATGCACTCGTTGATGTTGGG(FAM) CCGCCGCGGGATCCAACAA(TAMRA) 72
　注 : a ,IVR 玉米转化酶基因 ; b ,引物的 5′及 3′端分别标记了报告荧光染料基团 FAM和淬灭荧光染料基团 TAMRA。
　Notes : a ,IVR , Invertase ; b ,The probes were labeled with 5′2FAM(62carboxyfluorescien) and 3′2TAMRA(62carboxytetramethyrhodamine) .
306　6 期 陈 　颖等 :实时荧光定量 PCR 技术在转基因玉米检测中的应用研究 　　　

1. 2. 4 　定量 PCR 结果计算
1. 2. 4. 1 　标准曲线的制定 　通过对不同转基因含
量的转基因玉米 Mon 810 标准品 (5 % , 2 % , 1 % ,
015 % ,011 % ,0 %) 和转基因玉米 Event 176 标准品
(2 % ,1 % ,015 % ,011 % ,0 %) 的测定 ,计算机软件自
动生成标准曲线 ,纵坐标为 Ct ,横坐标为百分含量
的对数。根据标准曲线所得的线性计算公式 ,将样
品的 Ct 值代入公式 ,即可得到待测样品的转基因成
分的百分含量。
1. 2. 4. 2 　检测低限的测定 　为测定该方法对转基
因玉米的检测低限 ,取等量的 011 %和 0 %的标准品
充分混匀 ,得到 0105 %的转基因标准品 ;取 011 %的
标准品 011 g 与 1 g 的 0 %标准品充分混匀 ,得到
0101 %的转基因标准品。扩增从 015 %、011 %、
0105 %与 0101 %标准品中提取的 DNA ,得到相应的
Ct ,根据标准曲线判断检测方法的灵敏度。
1. 2. 4. 3 　检测方法精密度分析 　重复 10 次检测转
基因成分含量为 2 %、015 %、0105 %的样品 ,根据相
应的标准曲线 ,得到本方法检测的被测样品转基因
百分含量值。对得到的 10 个数据进行统计学分析 ,
评价本检测方法的精密度。
标准偏差 ( S) =
　 [ ( d1 - X) 2 + . . . . . . ( dn - X) 2 ]/ ( n - 1)
变异系数 ( CV) = S/ X ×100 %
X :算术平均值
1. 2. 4. 4 　检测回收率计算 　回收率 ( %) = C1/ C2
×100 %
其中 : C1 = 样品测量所得转基因成分含量的平
均值 ; C2 = 被测样品的实际转基因成分含量。
2 　结果与分析
2. 1 　玉米内源 Invertase 基因的扩增
　　提取出一定数量的高质量 DNA ,是进行转基因
成分 PCR 检测的前提条件。通过检测内源特异参
照基因 (内标基因) ,可以判定 DNA 是否被提取出
来 ,或所提 DNA 是否适合于进行 PCR 扩增 ,从而可
以避免检测结果的假阴性。玉米转化酶基因 Inver2
tase [5 ]是玉米基因组中的一个单拷贝基因 ,被认为是
玉米中的看家基因 ,通常被用作转基因玉米检测的
内源基因。本研究通过采用特异引物首先对转
基因玉米中的内源基因进行了定性 PCR 检测 ,以确
定所提取的 DNA 是否适合于 PCR 扩增。PCR 电泳
显示 :所有样品即转基因成分含量分别为 5 %、2 %、
1 %、015 %、011 %的转基因玉米Mon 810 和转基因成
分含量分别为 2 %、1 %、015 %、011 %、0 %的转基因
玉米 Event 176 均扩增出了 122 bp 的 DNA 条带 ,该
结果表明 ,所提取的 DNA 数量和质量均适合于 PCR
扩增。
2. 2 　标准曲线的建立
在定量检测中荧光信号 (Rn)和临界循环值 (Cy2
cle Threshold , Ct)均可反应扩增的效果。其中 Ct 值
是指每个反应管内的荧光信号 ( Rn) 到达设定的阈
值时所经历的循环数。研究表明 , Ct 值与该模板的
起始拷贝数的对数存在线性关系[6 ] 。Ct 值越小 ,模
板 DNA 的起始拷贝数越多 ; Ct 值越大 ,模板 DNA 的
起始拷贝数越少。根据这一线性关系 ,可通过对转
基因标准样品的检测建立标准曲线 ,将待测样品扩
增得到的 Ct 值代入公式 ,即可得到待测样品的转基
因成分的百分含量的对数。本研究分别对转基因玉
米 Mon 810 和 Event 176 标准品进行了定量检测 ,定
量检测软件自动生成标准曲线 ,其中纵坐标为 Ct
值 ,横坐标为百分含量。检测转基因玉米 Mon 810
标准品得到的标准曲线线性方程为 Y = - 3. 6265 X
+ 24. 535 ,相关系数为 R2 = 019960 ;检测转基因玉米
Event 176 标准品得到的标准曲线线性方程为 Y =
- 2. 604 X + 28. 301 ;相关系数为 R2 = 019910 (图 1 ,
图 2) 。这样 ,将待测样品扩增得到的 Ct 值 ( Y 值)
代入公式 ,再对所得值取反对数即可得到待测样品
的转基因成分的百分含量。
2. 3 　检测灵敏度
实时荧光 PCR 检测的灵敏度即所谓的检测低
限通常可用定量低限 (Limit of Quantization , LOQ) 和
检测低限 (Limit of Detection , LOD) 表示。而检测灵
敏度的高低主要取决于 PCR 反应的 DNA 总量、被检
测作物的基因组大小和每个基因组中所含外源基因
的数目 ,即外源基因的拷贝数[7 ,8 ] 。本研究分别对
不同浓度的转基因玉米Mon 810 和 Event 176 的标准
品进行基因定量检测 ,结果表明转基因玉米Mon 810
和 Event 176 的定量检测低限 (LOD) 均小于 0101 %
(图 3 ,图 4) 。
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图 1 　转基因玉米 Mon 810 标准品定量扩增结果及标准曲线
Fig. 1 　Quantitative detection and standard curve of Mon 810 maize
图 2 　转基因玉米 Event 176 标准品定量扩增结果及标准曲线
Fig. 2 　Quantitative detection and standard curve of Event 176 maize
2. 4 　检测精密度
本实验分别选择了 3 个浓度 (0105 % ,015 % ,
210 %)的转基因玉米 Mon 10 和 Event 176 标准品进
行了多次重复测定 ( n = 10) ,通过统计分析得到了
采用实时荧光 PCR 检测方法检测转基因玉米 Mon
810 和 Event 176 的精密度。从表 2 可知 ,转基因成
分含量为 0105 %、015 %和 2 %的转基因玉米 Mon 810 和 Event 176 标准品的最终实际测得值分别为010512 %、 015086 %、 119518 % 和 010507 %、015027 %、119800 % ;变异系数 119764 %～712648 % ,其回收率分别为 102132 %、101171 %、97159 %和101142 %、100154 %、99100 % ,说明此方法具有良好的准确性和重现性。
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图 3 　转基因玉米 Mon 810 定量检测灵敏度测定结果
Fig. 3 　Sensitivity of quantitative detection of Mon 810 maize
图 4 　转基因玉米 Event 176 定量检测灵敏度测定结果
Fig. 4 　Sensitivity of quantitative detection of Event 176 maize
3 　讨论
3. 1 　定量检测的设计原则
　　DNA 的有无及质量的好坏是 PCR 得以扩增和
获得可靠结果的关键。一般通过内源基因的扩增来
判断 DNA 的纯度 ,以排除不适合的模板及假阴性。
本研究采用玉米基因组中的一个单拷贝基因 Inver2
tase ,通过对其测定实现对 DNA 质量的检测。
实时荧光 PCR 检测中引物和探针的设计是
PCR 扩增获得成功的关键之一。引物和探针首先要
对被检测的基因有很高的特异性。所设计的被扩增
片段通常应在 100～400 bp 之间 ,片段越小定量扩增
的结果就越精确[9 ] 。为了能有效检测转基因玉米 ,
我们收集了国内外大量商品化转基因构建资料 ,结
合文献报道 ,采用了引物与探针的最佳组合 ,使所建
立的玉米实时荧光 PCR 检测方法效率高 ,灵敏度
高 ,重现性好。
606 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

表 2 　转基因玉米 Mon810、Event 176 定量检测方法重复实验结果
Table 2 　Reproducibility and recovery of the measurement of replicate standards
实　验
Experiment
转基因成分检测值 ( %) Quantity ( % of content)
转基因玉米 Mon 810
Genetically modified maize Mon 810
转基因玉米 Event 176
Genetically modified maize Event 176
0105 015 2. 0 0105 015 2. 0
1 010523 014788 2. 1134 010489 014999 2. 0024
2 010493 015351 1. 8543 010519 015193 1. 9927
3 010483 015527 1. 7293 010511 014876 1. 9796
4 010514 014853 1. 8936 010475 015129 2. 0003
5 010478 014932 2. 1232 010512 014953 1. 9682
6 010523 015179 2. 0065 010512 014979 1. 8926
7 010533 015235 1. 8593 010492 015121 1. 9741
8 010526 015053 2. 1341 010532 015071 2. 0112
9 010501 014921 1. 8205 010521 014934 1. 9948
10 010542 015019 1. 9841 010508 015017 1. 9845
平均值 Calculated mean ( %) 010512 015086 1. 9518 010507 015027 1. 9800
标准偏差 Standard deviation 010022 010235 011418 010017 010099 010335
变异系数 Coefficient of variation ( %) 4. 2533 4. 6121 7. 2648 3. 3502 1. 9764 1. 9800
回收率 Recovery rate ( %) 102. 32 101. 71 97. 59 101. 42 100154 99. 00
3. 2 　检测灵敏度和精密度的测定
定量检测要求结果准确与精密 ,因此实验中对
2 种转基因玉米 3 个浓度的 6 个样品分别进行了 10
次的重复实验 ,并对数据进行了 t 检验 (显著性水平
α= 0105)统计分析 ,以保证数据合理 ,方法可靠。如
表 2 所示 ,用本实验建立的荧光定量 PCR 方法测定
6 种样品的转基因成分含量 ,其回收率都在 95 %以
上 ,变异系数在 10 %以下 ,说明本实验建立的方法
准确可靠 ,具有良好的重现性。
通过对含转基因标准品与非转基因标准品的混
合 ,测定了该方法对转基因玉米 Mon 810 与 Event
176 的检测灵敏度 ,实验结果表明 :转基因玉米 Mon
810 与 Event 176 实时荧光 PCR 检测的灵敏度小于
0101 %。鉴于国际上目前设定的转基因限量是本方
法检测灵敏度的 100 倍 ,本研究认为 0101 %的检测
灵敏度已完全能够满足转基因产品检测的需要。
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