全 文 ：第 27 卷 第 6 期 作　物　学　报 V o l. 27, N o. 6
2001 年 11 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA N ov. , 2001
杂交油菜“蜀杂 6 号”特异序列扩增标记 (SCAR)建立及其在杂
种鉴定中的应用Ξ
干　滟　曾凡亚ΞΞ　赵　云　王茂林
(四川大学生命科学学院, 四川成都 610064)
提　要　用 100 个随机引物对“蜀杂 6 号”父、母本进行RA PD 扩增, 选出 5 个能在父、母本中产生多
态性扩增的引物。在杂种 F 1 代中验证它们的特异性和稳定性, 从中筛选出能从杂种 F 1 代中稳定扩增
“蜀杂 6 号”父、母本特异标记的随机引物 GE204 和 GE222, 并对它们扩增的父、母本特异标记片段进
行克隆和测序。根据测序结果设计的特异序列扩增引物, 将“蜀杂 6 号”的父、母本RA PD 标记转化为
序列特异的 SCA R 标记。通过对“蜀杂 6 号”父、母本和 300 个杂种 F 1 代单株的父、母本特异序列扩增
标记 (SCA R )的检测, 建立了用 SCA R 2PCR 检测杂交油菜“蜀杂 6 号”杂种纯度的方法, 并逐一对照大
田杂种一代生产种的表现型, 验证了本方法的可靠性。
关键词　杂交油菜; 杂种纯度; 分子标记; RA PD; SCA R
D evelopm en t of SCAR M arkers to Authen tica te the Hybr id Seed L ots
of Shuza No. 6 (B rass ica nap us L. )
GAN 2Yan　ZEN G Fan2Ya　ZHAO Yun　W AN G M ao2L ing
(Colleg e of L if e S cience, S ichuan U niversity , Cheng d u 610064, Ch ina)
Abstract　　F ive p rim ers, w ith w h ich po lym o rph ism bands cou ld be am p lif ied betw een tw o
DNA poo ls of the paren ts of hyb rid rapeseed, Shuza N o. 6, w ere screened ou t from 100
RA PD p rim ers. T hen these five p rim ers w ere u sed to am p lify the to ta l DNA s of F 1 to
determ ine their specif icity and stab ility. Severa l m aterna l2specif ic and paterna l2specif ic DNA
bands w ere am p lif ied w ith GE204 and GE222, in the DNA poo ls of Shuza N o. 6 and its
paren ts. respect ively In o rder to convert the RA PD m arkers in to m o re stab le SCA R
(Sequence characterized am p lif ied reg ion ) m arkers, the m aterna l2specif ic m arker GE204500
and paterna l2specif ic m arker GE222300 w ere cloned and sequenced respect ively. W hen SCA R
p rim ers designed acco rd ing to the sequences of GE204500 and GE222300 w ere m ixed and u sed to
am p lify DNA s of Shuza N o. 6 and its paren ts, tw o dist inct ive bands, one of w h ich w as
m aterna l2specif ic and the o ther w as pa terna l2specif ic, appeared in a ll hyb rid p lan ts, bu t on ly
one paren t2specif ic band in m aterna l o r pa terna l p lan ts. T he reliab ility of th is resu lt w as
confirm ed by the pheno types of hyb rid seed lo ts in the field.
Key words　　B rassica nap us; H yb rid seed pu rity; M o lecu lar m arker; RA PD; SCA RΞΞΞ 通讯联系作者, E2m ail: fyzeng@ scu. edu. cn
收稿日期: 2000208202, 接受日期: 2001201215
Received on: 2000208202, A ccep ted on: 2001201215四川省农业生物技术育种攻关资助项目

当前, 我国杂交油菜得到了广泛的推广种植, 用于生产杂交种的雄性不育材料主要有细
胞质不育 (CM S) 和细胞核不育 (GM S) 两类。生产中利用的细胞质不育系在相对低温条件下
易出现微量花粉[ 1 ]; 而细胞核不育系虽不育彻底, 但制种时必须在开花前拔除母本中约一半
的可育株, 如果拔除不及时和不彻底, 母本行中将发生兄妹交。所以, 两种杂交制种途径都
存在杂种率不稳定的因素, 在杂交种种子应用于生产之前, 常常要确定杂种纯度[ 2 ]。
近年来, 植物基因组的分子标记和应用这些标记鉴定农作物品种的新技术取得了迅速的
发展[ 3～ 5 ] , 其中的RA PD (R andom am p lif ied po lym o rph ic DNA , RA PD )技术[ 6, 7 ]由于具有操
作简单, 成本低等优点, 已被用到作物品种和杂种纯度鉴定之中[ 8～ 10 ]。本研究利用RA PD 技
术建立了“蜀杂 6 号 ”两亲本的特异分子标记, 并根据油菜杂种纯度鉴定的实际需要, 将其转
化为更为稳定可靠的 SCA R (Sequence characterized am p lif ied reg ion) 标记, 结合已建立的油
菜单株DNA 快速提取技术[ 10 ] , 能在数天之内准确地检验出“蜀杂 6 号”杂交种子样品的杂种
率。
1　材料和方法
1. 1　植物材料
甘蓝型油菜 (B rassica nap us)“蜀杂 6 号”杂种 F 1 代, 母本细胞核雄性不育系 156AB 中的
不育株 (156A )、可育株 (156B ) , 父本 86Y17, 以及与 156AB 亲缘关系较近的细胞核雄性不育
系 207AB 等实验材料均采自本校试验地。用于建立标记研究的杂种 F 1 代为手工制种, 由课
题组配制; 用于大田验证的 F 1 代为生产用种, 由四川省种子公司提供。
1. 2　化学试剂
本研究所用的 100 个 102m er 随机引物购自美国 Genem ed Syn thesis 公司, T aq DNA 聚
合酶, dN T P, 地高辛非放射性标记试剂盒, PCR 引物等其它试剂分别购自美国 Gibco2BRL
公司, 德国宝灵曼等公司。
1. 3　总D NA 的提取
油菜单株总DNA 的提取采用本课题组已建立的油菜单株总DNA 微量快速提取方法[ 10 ]。
1. 4　RAPD 扩增
RA PD 扩增反应采用已建立的条件和体系[ 11 ]。RA PD 扩增产物在 1. 5% 琼脂糖凝胶上电
泳后, 溴乙锭染色, 在凝胶成像系统 (GD S8000, 美国)拍照和分析。
1. 5　Southern 杂交
RA PD 产物经 0. 7% 琼脂糖凝胶电泳、染色、拍照后, 按 Sam b rook 等描述的方法[ 12 ]将
DNA 转移到尼龙膜上, 干燥固定。DNA 探针以从琼脂糖凝胶上回收的特异性RA PD 标记片
段为模板, 按地高辛标记、检测试剂盒要求标记成 RA PD 特异片段探针, 再依次进行杂交、
洗膜和显色[ 12 ]。
1. 6　RAPD 标记片段的克隆及测序
RA PD 产物经 0. 5% 琼脂糖凝胶电泳染色后, 从凝胶上分别切下待克隆的特异性DNA
带, 用多次冻融法回收DNA 片段。回收的DNA 片段由 T 4 DNA 连接酶连入 pU C18 载体,
转化大肠杆菌XL 21 B lue。转化子经X2gal 平板显色后, 直接将白色菌落用载体多克隆位点区
两侧引物作 PCR 扩增, 筛选重组子。重组质粒经与标记的RA PD 特异片段探针分别杂交确
证后, 选出阳性克隆进行测序分析。
3276 期　　干　滟等: 杂交油菜“蜀杂 6 号”特异序列扩增标记 (SCA R ) 建立及其在杂种鉴定中的应用　　　

1. 7　序列特异性引物的设计及 PCR 扩增
根据“蜀杂 6 号”父母本特异性RA PD 克隆片段的测序结果, 分别合成两对序列特异性引
物, 进行 PCR 扩增。PCR 扩增条件为: 94℃变性 2 m in, 30 个循环(94℃ 45s, 59℃ 45s, 72℃
1 m in) , 72℃延伸 5 m in。PCR 扩增产物经 1. 5% 琼脂糖凝胶电泳, 溴乙锭染色后, 拍照分析。
1. 8　F1 代生产用种杂交率的鉴定和验证
在 2～ 3 叶期, 从大田随机抽取“蜀杂 6 号”F 1 代生产种单株 300 株, 挂牌标记后取幼叶提
取单株总DNA。将序列特异性引物 GE204U 500、GE204D 500、GE222U 300和 GE222D 300等量混
合 (0. 2 Λm o löL )后, 按材料与方法中 1. 7 所述条件进行 PCR 扩增, 记录和统计实验结果。在
油菜初花期, 将 PCR 扩增结果与大田植株的育性、株高、叶型等表现型逐一对照, 以验证鉴
定的准确性。
2　结果
2. 1　“蜀杂 6 号”亲本的 RAPD 标记
分别将“蜀杂 6 号”母本不育株 156A 和父本 86Y17 的 12 个单株总DNA 等量混合, 构成
“蜀杂 6 号”母本不育株和父本总DNA 混合样品池。采用同样的方法构成细胞核不育系
207AB 不育株的混合样品池。用 100 个随机引物分别对上述三种总DNA 进行RA PD 扩增,
每种引物至少重复扩增两次。结果有 38 个随机引物在以上三种总DNA 中出现了阳性扩增,
共产生 228 条DNA 扩增带, 它们的分子量在 200～ 2500 bp 之间。其中有 14 个引物在“蜀杂
6 号”父本和母本不育株样品间出现多态性扩增。经过重复扩增, 以及随机选取父、母本各 5
个单株总DNA 分别扩增, 选出了 5 个能在亲本单株总DNA 样品中多态性扩增带稳定, 且差
异清晰的引物 (表 1) , 进一步用于 F 1 代杂种的RA PD 分析。图 1 显示了这 5 个随机引物扩增
结果。“蜀杂 6 号”父、母本RA PD 片段多态性表现出扩增片段分子量的差异。其中, GE204
在父母本的 500 bp 左右各有一条分子量差异极小的DNA 扩增带 (图 1, 204A 和B 泳道箭头
所示) , 它们可在高浓度琼脂糖凝胶 (1. 5% )、低电压和长时间电泳的条件下被分开。同时,
图 1 还显示与“蜀杂 6 号”母本亲缘关系很近的另一个核不育材料 207AB 也可以通过部分引
物的RA PD 带谱加以区别。
表 1　　能显示“蜀杂 6 号”父母本多态性的随机
引物序列及其标记片段特征
Table 1　　The character ization of marker fragmen ts
and sequences of f ive arbitrary pr imers
RA PD 引物编号
N am e of
RA PD p rim er
引物序列
Sequence
RA PD m arker (kb)
母本
Fem ale
父本
M ale
GE204 GA CAA CTA CC 0. 34, 0. 50, 1. 19 0. 48
GE218 AA GCA GA TCC 0. 84, 1. 07
GE222 CCA T T GA TCC 0. 59 0. 30, 0. 62, 0. 93
GE235 T GTA GTCTCC 0. 66, 1. 83
GE242 A GA GGCGTCC 0. 74
　　以“蜀杂 6 号”杂种 F 1 代
10 个单株混合总DNA 和 5 个
单株总DNA 为模板, 用选出
的 5 个 RA PD 引物进行扩增
和筛选。结果表明引物 GE204
可稳定地在 F 1 代杂种中扩增
出两条母本特异的标记片段
GE204500和 GE204340, 其大小
分别为 500 bp 和 340 bp; 引
物 GE222 可稳定地扩增出两
条 父 本 特 异 的 标 记 片 段
GE222620和 GE222300, 其大小分别为 620 bp 和 300 bp。为了确证从 F 1 代杂种中扩增出的父、
母本标记片段是源于“蜀杂 6 号”父、母本DNA 模板, 便于将来检测分子标记, 选择分子量较
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小且父、母本标记有一定差异的标记片段 GE204500和 GE222300作进一步研究。从琼脂糖凝胶
中回收 GE204500和 GE222300片段, 按材料与方法所述进行标记制成探针, 然后分别与引物
GE204 和 GE222 扩增的“蜀杂 6 号”父、母本和杂种 F 1 代RA PD 产物进行 Sou thern 杂交。结
果显示, 探针 GE204500只与母本标记片段 GE204500和 F 1 代杂种中与之对应的 500 bp 扩增带
杂交, 不与其它任何扩增带杂交, 即使在父本中扩增出的与 GE204500分子量极其相似、以至
在 0. 7% 琼脂糖凝胶上很难区分的一条带 (图 22É、Ê 中 204 的M 泳道) 也未与探针杂交, 表
明该片段与 GE204500的DNA 序列不相同; 探针 GE222300只与父本标记片段 GE222300和 F 1 代
中与之对应的 300 bp 扩增带杂交, 不与其它任何扩增带杂交 (图 2Ë )。以上结果说明: 在 F 1
代杂种中扩增出的父、母本特异分子标记片段分别源于两亲本DNA 模板, 且这两条父、母
本标记片段具有较高的特异性。
图 1　　5 个选出的随机引物扩增结果电泳图
F ig. 1　　T he p rofile of RA PD resu lt amp lified w ith five selected p rim ers
A、B、C 道分别是以“蜀杂 6 号”母本、父本和细胞核雄性不育系 207AB 不育株的总DNA 为模板扩增的RA PD 产
物, 上面的数字代表引物编号 (见表 1) , 箭头示多态性扩增带, M 道为 ΚöH indË + E coR É 双酶切分子量标准
RA PD p roducts amp lified w ith DNA s of fem ale (A ) and m ale (B ) paren ts of hybrid rapeseed Shuza N o. 6 and
sterile p lan ts (C) of GM S line 207AB, respectively. T he num bers on the lines are codes of arb itrary p rim ers ( see
tab le 1) and the arrow s indicated the po lymo rph ic bands betw een fem ale and m ale paren ts of Shuza N o. 6. L aneM isΚDNA size m arker digested w ith H indË and E coR É
2. 2　RAPD 标记转化为序列特异的分子标记
为了将父母本的RA PD 标记转化为更加稳定和便于检测的序列特异的 SCA R 分子标记,
分离GE204500和GE222300标记片段并克隆。在每类克隆中分别筛选出 20 个重组子, 经斑点杂
交证实后, 选出阳性克隆各 5 个进行 DNA 序列测定和分析。两个标记片段 GE204500和
GE222300包括两端随机引物在内的全序列长度分别为 499 bp 和 292 bp , 且均为A T 富集的
DNA 序列。经在 GenBank 中同源比较, 未发现任何已知序列与它们有明显的同源性 (另文报
道)。根据 GE204500和 GE222300的序列设计了 2 对序列特异的引物 (表 2) , 用于 SCA R 2PCR
扩增以鉴定杂种。
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图 2　　引物 GE204 和 GE222 的RA PD 扩增产物电泳及杂交结果图
F ig. 2　　T he electropho resis of RA PD amp lified w ith p rim ers GE204 and GE222 and the Southern
hybridization w ith the p robes GE204500 and GE222300
随机引物 GE204 和GE222 的扩增结果 (É ) , 和以GE204500片段 (Ê )、GE222300片段 (Ë ) 为探针的 Southern 杂交
结果。F、M、F1 分别代表“蜀杂 6 号”母本、父本和 F1 代, 箭头指示亲本和杂种中的同源片段。S 为分子量标准
T he arrow s in the p rofiles of electropho resis (É ) and Southern hybridization w ith the p robes, GE204500 (Ê ) and
GE222300 (Ë ) , indicate the m arker2homo logue fragm ents ex ist ing in paren ts and hybrid. L ane F, M and F1 are
fem ale and m ale paren ts and F1 hybrid of Shuza N o. 6, respectively. L ane S is size standard
表 2　　序列特异的 SCAR-PCR 引物设计和预期的扩增结果
Table 2　　D esigned pr imes for SCAR-PCR and the ir predicted PCR products
SCA R 引物a
N am e of SCA R
p rim er
SCA R 引物序列b
Sequence of SCA R
p rim er
SCA R 标记大小
Size of SCA R
m arker
母本
Fem ale
父本
M ale
F1
GE204U 500 GA CAA CTA CCTA T T GA T GA TAA TCC 499 bp + c - +
GE204D 500 CTA CCA GGA T GT G TCAAAA C
GE222U 330 CCA T T GA TCCA TA T A T T TCAA GA 292 bp - + +
GE222D 330 GA TCCCA CAA T GC TA GCCT
　　a. U öD 分别为标记片段的上下游引物。b. 下划线序列为所含随机引物序列。c. + ö- 分别为阳性扩增和无扩增。
　　a. U öD are up stream (5′end) o r dow nstream (3′end) p rim ers of m arker fragm ents, respectively. b. T he underlined
sequences are tho se ancho red to the arb itrary p rim ers on the end of m arker fragm ents. c. + ö- are p redicted po sit ive
o r negative amp lifications w ith the related p rim ers and temp late DNA.
在设计的两对引物中, 引物 GE204U 500和 GE204D 500各包括随机引物 GE204 的 10 个碱
基和 5 个碱基, 它们在母本中只扩增出一条 499 bp 的带, 在父本中无扩增。引物 GE222U 300
和 GE222D 300各包括随机引物 GE222 的 10 个碱基和 5 个碱基, 它们在父本中只能扩增出一
条 292 bp 的带, 在母本中无扩增。将两对引物混合使用时, 在母本植株中只扩增出一条 499
bp 带, 在父本植株中只扩增出一条 292 bp 的带, 但是, 在 F 1 代植株中则能同时扩增出 499
bp 和 292 bp 两条带, 其强度与母本标记带 (499 bp ) 和父本标记带 (292 bp ) 基本相当 (图 3)。
另外, 引物 GE204U 500和 GE204D 500除能在不育系 156 AB 的不育株中扩增出母本的特异性标
记片段外, 还能在不育系的可育株 (156B ) 中扩增出相同的母本特异性标记片段。因此,
GE204500标记既能鉴定 F 1 代中混杂的母本不育系兄妹交后代出现的不育株, 同时也能鉴定出
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兄妹交后代出现的可育株。
图 3　“蜀杂 6 号”亲本及杂种 F1 代生产用种的 SCA R 2PCR 扩增电泳图
F ig. 3　E lectropho retic p rofile of SCA R 2PCR amp lified w ith SCA R p rim ers fo r F1 p lan ts of Shuza N o. 6 and its paren ts
A 道为DL 2000 分子量标准, B , P 道分别为以“蜀杂 6 号”母、父本DNA 为模板, C～O 道为以“蜀杂 6 号”F1 代生
产用种单株DNA 为模板的 SCA R 2PCR 扩增结果。D、H 和 J 为未杂交上的母本兄妹交后代植株。
L ane A : DNA size m arkers, lane BöP: fem aleöm ale paren ts of hybrid rapeseed Shuza N o. 6, lane C to O: individual
F1 p lan ts of Shuza N o. 6. L ane D , H and J rep resen t sibs from fem ale paren t p lan ts.
2. 3　F1 代生产用种杂交率的鉴定和验证
以 GE204U 500、GE204D 500、GE222U 300和 GE222D 300混合引物扩增和分析采自大田的“蜀
杂 6 号”杂种 F 1 代生产种单株 300 株, 其中 54 株只扩增出母本标记带 (499 bp 特异带) , 264
株同时扩增出父、母本标记带 (499 bp 和 292 bp 特异带) , 未发现只有父本标记带 (292 bp 特
异扩增带) 的单株, 显示在杂交一代生产用种中母本植株占 18% , 而杂种有 82%。图 3 显示
了部分单株的扩增结果。在油菜初花期, 将得到的 PCR 结果与大田单株逐一对照 , 发现在
只扩增出母本标记带的 54 株植株中, 有 26 株不育株, 另 28 株为可育株。无论从株型、叶型,
还是从物候期和生长势方面考察, 这 28 株可育株均与不育株相同, 而与大多数的杂种相去甚
远, 故这 28 株可育株是来源于核不育系的兄妹交后代, 而非杂交种。以上结果表明, 本研究
建立的“蜀杂 6 号”父、母本 SCA R 标记鉴定杂种 F 1 代和亲本是准确可靠的。
3　讨论
杂交油菜的纯度鉴定一般是采用夏繁鉴定[ 2 ]。利用RA PD 技术, 可建立快速简便的实验
室鉴定方法, 但RA PD 技术仍具有不够稳定以及分析相对复杂的缺点。L ahogue (1998) [ 14 ]认
为可将RA PD 标记转化为 SCA R 2PCR 标记, 从而增强所获得的RA PD 标记的特异性, 同时
可简化 PCR 分析。本研究获得的 SCA R 2PCR 标记特异性好、稳定性高, 克服了通常的
RA PD 标记不稳定、不易重复等缺点。两对 SCA R 引物在“蜀杂 6 号”父、母本中均只有一条
扩增带, 而在 F 1 代杂交种中则可获得父母本的互补型带谱, 且两标记片段的大小和它们之间
的分子量差距都很适合于 PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳的检测, 能够很直观地将“蜀杂 6 号”
父母本和 F 1 代杂交种区分开。
利用 SCA R 2PCR 对杂种纯度进行检测, 其分析程序简单, 对DNA 没有组织和发育阶段
的特定要求, 结合已有的微量单株总DNA 快速提取方法[ 10, 11 ] , 可实现杂种纯度的快速、稳
定和准确检测。就本研究建立的’蜀杂 6 号”杂交种子纯度快速鉴定方法而言, 能在取得种子
7276 期　　干　滟等: 杂交油菜“蜀杂 6 号”特异序列扩增标记 (SCA R ) 建立及其在杂种鉴定中的应用　　　

后一周之内准确地检验出大批量的杂交种子的杂种率。另外, 利用 SCA R 2PCR 标记鉴定杂交
种子的纯度不仅对防止不合格种子进入销售流通领域具有实用价值, 还可为农作物新品种审
定、保护育成品种的知识产权等提供方法和技术借鉴。
参　考　文　献
1　杨光圣, 傅廷栋. 中国油料, 1987, (3) : 15～ 19
2　Zhao Y, M L W ang, Y Z Zhang. et al. P lan t B reed ing. 2000. 119: 131～ 135
3　张超良, 孙世孟, 金德敏等. 作物学报, 1998, 24 (6) : 718～ 722
4　Bellam y A , F V edel. H Bannero t. P lan t B reed ing. 1996. 115: 128～ 132
5　Kaw chuk L M , J H achey, D R L ynch. Genom e. 1998. 41 (1) : 91～ 95
6　W elsh J , M M cC lelland. N ucl A cid s R es, 1990, 18: 7213～ 7218
7　W illiam s J G K, A E Kubeli, K J L evak N ucl A cid s R es, 1990, 18. 6531～ 6535
8　钱强, 陈洪, 朱立煌等. 中国水稻科学, 1996, 10 (4) : 241～ 242
9　Rom M , M Bar, A Rom et al. P lan t B reed ing. 1995. 114: 188～ 190
10　干滟, 曾凡亚, 赵云等. 四川大学学报, 1999, 36 (5) : 936～ 939
11　干滟, 曾凡亚, 赵云等. 西南农业学报, 1999, 12: 111～ 115
12　Sam brook J , E F F ritsch, T M aniatis. M olecu lar C lon ing: A L abora tory M anua l. 2 ed. N ew Yo rk: Co ld Sp ring
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