全 文 ：华北农学报·2011，26(6) :97 -101
收稿日期:2011 － 07 － 12
基金项目:“十一五”科技支撑项目(2009BADB8B02) ;北京市新世纪百千万人才工程培养资助项目(2008) ;国家农业科技成果转化资金
项目(2010GB2A000003) ;北京市科委项目(D101105046510001) ;北京市农林科学院科技创新能力建设专项(KJCX201101010
－ 9) ;北京市农林科学院科研项目(2010A004)
作者简介:张国裕(1978 －) ，男，山东肥城人，助理研究员，博士，主要从事南瓜生物技术遗传育种研究。
通讯作者:李海真(1965 －) ，女，山西昔阳人，研究员，主要从事南瓜遗传育种研究。
南瓜属 EST-SSR标记的开发及
在杂种纯度鉴定中的应用
张国裕，张 帆，姜立纲，翟伟卜，李海真
(国家蔬菜工程技术研究中心，北京 100097)
摘要:为利用 SSR标记进行快速、准确的南瓜杂交种纯度分析，进行了南瓜 EST-SSR标记的开发。从 NCBI 数据
库下载 1 457 条南瓜属作物 EST序列，去除冗余序列后进行 SSR位点搜索，共得到 215 条含有 SSR位点的 EST序列。
这些 SSR位点包含 111 种重复基元，其中二核苷酸(62 个，占 28． 84%)和三核苷酸(86 个，占 40． 0%)重复类型占主
导地位;重复基元中出现最多的是 CT(21 个，占 9． 77%) ，其次为 TC(13 个，占 6． 05%)和 AAG(12 个，占 5． 58%)。
将 215 个 SSR位点设计成 EST-SSR引物后，随机合成了其中的 43 对引物。利用 4 份遗传背景差异较大的南瓜自交系
对合成的 43 对引物进行扩增效果评价，其中 28 对引物有稳定清晰的扩增产物，占合成引物的 65． 12%。利用这些有
效扩增引物对南瓜属作物商品杂交种进行纯度检测，共获得 13 个杂交组合的特异性检测引物，F1 杂交种的纯度在
79． 2% ～ 100． 0%，与田间检测结果相符。结果表明，利用南瓜 EST 序列开发 SSR 引物具有简单快速、成本低和适用
性好的特点。
关键词:南瓜;EST-SSR;标记开发;杂种纯度
中图分类号:S642． 1 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2011)06 － 0097 － 05
EST-SSR Markers Development from Cucurbita and
Their Use in Purity Testing of F1 Hybrid Seed
ZHANG Guo-yu，ZHANG Fan，JIANG Li-gang，ZHAI Wei-bo，LI Hai-zhen
(National Engineering Research Center for Vegetables，Beijing 100097，China)
Abstract:Expressed Sequence Tags(ESTs)are a source of simple sequence repeats(SSRs)that can be used
to develop molecular markers for genetic studies． The object of the present study is to develop EST-SSR markers
from Cucurbita and uses these markers in quickly purity testing of F1 hybrid seed． The availability of 1457 ESTs for
cucurbita，which documented in GenBank，provided a unique opportunity to develop EST-SSR markers，and 215
SSRs were identified among these non-redundant EST sequences． These SSRs contained 2 － 6 bp nucleotide motifs
including 111 different motif types． The trinucleotide repeat is the dominant type，accounting for 40% with 86 mo-
tifs，and the frequency of occurrence of dinucleotide repeat is 28． 84% with 62 motifs． Among these motifs，CT motif
(21，9． 77%)was the most common type，and then were TC and AAG motifs，accounting for 6． 05% and 5． 58%，
respectively． A total of 215 primer pairs were designed and 43 of them were synthesized and used to determine their
usability by amplification in 4 Cucurbita inbred lines． The results show that 28 of them could successfully amplify，
accounting for 65． 12% of testing primer pairs． Then these primer pairs were used to test the F1 hybrid seed purity
in Cucurbita． Seed genetic purity from 13 combinations ranged from 79． 2% to 100． 0%，which were in high accord-
ance with those from field grow-out trials． Taken together，this study reported an effective and feasible approach to
develop SSR markers for cucurbita，and demonstrated their usefulness in purity testing of hybrid squash seed．
Key words:Cucurbita;EST-SSR;Marker development;Hybrid seed purity
98 华 北 农 学 报 26 卷
SSR(Simple sequence repeat)广泛存在于植物
基因组中，随机分布，重复数目变异大。在众多分子
标记方法中，SSR 标记以其共显性、高度重复性、多
态性丰富、符合孟德尔遗传等优点备受推崇，成为构
建遗传连锁图谱、进行分子标记辅助育种、系谱分
析、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测以及目标性状
分子标记筛选等的理想工具［1］。但是传统的 SSR
标记开发步骤繁琐，极为耗费人力和时间。利用表
达序列标签(Expressed sequence tags，EST)开发 SSR
标记，具有成本低、简单快速、通用性好的特点。近
年来，大量快速增长的 EST序列资源为 SSR标记的
开发提供了新的途径。目前，基于 EST 数据的 SSR
标记已在一些植物如油菜［2］、甘蓝［3］、白菜［4］、黄
瓜［5］和小麦［6］等作物中成功开发和应用，并广泛应
用于作物遗传分析与分子标记辅助育种，取得了很
好的成果。
南瓜属作物按用途主要包括食用、砧木和观赏
三大类型，已经成为我国高效农业的优势作物，种植
面积逐年增加。但由于开发困难，南瓜属作物可利
用的 SSR标记较少，限制了南瓜分子标记及相关遗
传学研究的发展。尽管公用数据库中南瓜属作物的
EST数据不断增加，但国内外至今尚未见利用其
EST序列开发 SSR标记的相关报道。
本研究拟利用 NCBI 数据库中南瓜属作物的
EST序列资源，分析序列中的 SSR 信息，筛选和鉴
定 EST-SSR引物，开发南瓜 EST-SSR 标记，并以这
些标记探索南瓜属 3 个栽培种(中国南瓜、印度南
瓜和西葫芦)不同杂交组合 F1 杂种的纯度快速鉴定
方法。EST-SSR标记的开发将丰富南瓜属作物的分
子标记，为南瓜遗传分析和分子标记辅助育种等研
究奠定基础。
1 材料和方法
1． 1 南瓜属作物 EST数据下载和预处理
从 GenBank (http:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov /
dbEST / index． html)下载南瓜属作物的 1 457 条 EST
序列，并应用软件 Phrap对获得的 EST序列进行片段
重叠分析和聚类，结合人工筛查，去除冗余 EST序列。
1． 2 EST-SSR的定位
应用软件 SSRIT(Simple Sequence Repeat Identi-
fucation Tool)在线分析搜索 SSR位点(http:/ /www．
gramene． org /db /markers / ssrtool) ，筛选标准为:二核
苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重
复类型的最少重复次数分别设置为 5，4，3，3，3 次及
以上。
1． 3 EST-SSR引物设计
应用软件 Primer 5． 0 设计 EST-SSR引物。引物
设计的总体原则为:SSR 序列的开始和结束位置分
别距扩增片段 5和 3端不少于 50 bp;引物长度
18 ～ 24 bp;Tm值 50 ～ 60℃，正、反向引物 Tm值相差
小于 2℃;GC 含量 40% ～ 60%;PCR 扩增产物长度
150 ～ 260 bp;尽量避免引物二级结构与错配的出
现。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
1． 4 DNA提取、PCR扩增及电泳检测
南瓜叶片总 DNA的提取采用 CTAB法［7］，利用
1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA提取质量。PCR反应
体系为 15 μL:模板 DNA 0． 5 μL(30 ～ 60 ng)、10 ×
PCR Buffer 1． 5 μL、dNTP(2． 5 mmol /L)0． 3 μL、Taq
DNA 聚合酶(5 U /μL)0． 2 μL、引物(10 μmol /L)
0． 6 μL、超纯水 11． 9 μL。PCR 反应程序:95℃
3 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35 个循环;最
后 72℃ 5 min。采用 8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶
电泳分离扩增产物，银染后分析条带。
1． 5 植物材料
用于杂交种纯度分析的 13 个南瓜杂交组合材
料，均由北京市农林科学院蔬菜研究中心南瓜课题
组提供。
2 结果与分析
2． 1 南瓜 EST序列中 SSR的特征
在 1 457 条南瓜 EST 序列中，去掉冗余序列后
通过串联重复序列位置的筛查，得到包含 SSR 位点
的 EST序列 215 条，占 EST序列总数的 14． 76%。共
观察到 111种重复基元，在不同重复类型中(表 1) ，
表 1 南瓜 EST-SSR的特征
Tab． 1 Characteristics of the EST-SSR markers in Cucurbita
重复类型
Repeat type
数量
Number
种类
Type
百分比 /%
Proportion
出现频率 /%
Frequency
二核苷酸 Dinucleotide 62 10 28． 84 4． 26
三核苷酸 Trinucleotide 86 39 40． 00 5． 90
四核苷酸 Tetranucleotide 32 28 14． 88 2． 20
五核苷酸 Pentanucleotide 19 19 8． 84 1． 30
六核苷酸 Hexanucleotide 16 15 7． 44 1． 10
6 期 张国裕等:南瓜属 EST-SSR标记的开发及在杂种纯度鉴定中的应用 99
二核苷酸和三核苷酸为优势重复类型，共占重复类
型总数的 68． 84%。其中，三核苷酸重复类型所占
的比例最大(86 个，占 40%) ，二核苷酸重复类型次
之 (62 个，占 28． 84%) ，然 后 是 四 核 苷 酸
(14. 88%)、五核苷酸(8． 84%)和六核苷酸重复
(7. 74%)。出现最多的重复基元是 CT(21 个，占
9． 77%) ，其次为 TC(13 个，占 6． 05%)和 AAG(12
个，占 5． 58%) ，其余重复基元所占比例较小(均低
于 1%) ，SSR的总长度变化为 10 ～ 36 bp。
2． 2 南瓜 EST-SSR引物开发及有效扩增分析
利用软件 Primer 5． 0 将搜索得到的 215 个南瓜
SSR位点设计为 EST-SSR 引物，并随机合成其中的
43 对引物(表 2)。利用 4 份遗传背景差异较大的
南瓜自交系对所获得的引物进行初步的 PCR筛查，
以检测评价引物扩增的有效性。结果表明:有 28 对
引物能够在 4 份自交系中扩增出清晰的条带，占合
成引物的 65． 12%，每对多态性引物检测出的等位
基因有2 ～ 3个。图1示部分引物在4份自交系中
表 2 南瓜属作物 EST-SSR引物信息
Tab． 2 Details of 43 Cucurbita EST-SSR primers
编号
Serial No．
引物名称
Primer name
正向引物序列
Forward primer sequence(5 － 3)
反向引物序列
Reverse primer sequence(5 － 3)
退火温度 /℃
Tm
产物 /bp
Expected size
1 ESSR25 TGAGTATGGGTATGGGGAAG AGCACAGATGGATGAGCG 54 216
2 ESSR35 ATTCTTTGGACATGTGGAGC AATCTGATCCATTCCGAGGT 54 219
3 ESSR42 CATGAAAAATGCGTTTGTCT GAAGATCTCAGGGTCAACGT 54 179
4 ESSR60 TTAAATGCCTTGGATGAGAA GTCGAAGTTGGCATCGTTAA 55 208
5 ESSR61 CGGAACATCTCTGAATCCTG TCACCAGAGATCGAAACGAC 55 199
6 ESSR74 TTGAGACCAAGGAAGTAGTAGC CACCCGTCTCTTTCACCTC 54 231
7 ESSR80 TCTTGATCCCACAGACTTCTC GAACTCAATATTCCTGCACCT 54 193
8 ESSR97 TAATTAAGGCGTGAAATTGG GAAAAGAAACATAAACAGGGC 54 196
9 ESSR100 AGAGAGAGAAAGAGAAAGCGG TTCATGCTCGCAGACCTATC 55 173
10 ESSR103 GAGATTTTCTCAGCGCCCT TTGGCGTTTTGGAGTGAC 56 184
11 ESSR109 TTTTTGATGTGGGGCCTAAG TAACAGAAGGCAAAGGCGG 58 206
12 ESSR113 TAGATGGGTGCAGTCAGTTG CTCTTGATCCAGTAGATTCCG 54 210
13 ESSR116 ACAACTTTTTAGGAGTGGCG AAAAGAATGGCGAAACAGAT 54 229
14 ESSR117 TTTCATCATGGATTTCTGGTTC GGCCCCTACAGCCATACAG 57 195
15 ESSR121 AGTTGCGTGCATGTTACAACT GCATATGTAGCCAACAGCAAC 56 202
16 ESSR127 CGAAGGTAAAGGGAGATTGC GGGCCATTTTCAGATCAAGT 56 196
17 ESSR138 GGATTCAGTGGCAAGTTGG ATCGCACATAAGTTGAACCG 56 236
18 ESSR142 AGGGAGCTGGAACACCAAG CCAATACCCTACGCCTTCAC 57 216
19 ESSR145 TAATATCACCACTTCCACGGG GGCGTTCGCAACACAGTC 57 218
20 ESSR148 CCTCTCCCGAACCGCTT CTCATCCTGGTACTTGCTCTTG 57 163
21 ESSR158 TAGTCCTATCTTCTTGCTCCATTC TGAAGGTGCGACAATGGAT 57 169
22 ESSR160 GGTCTGCTTAATTTGCAATCTC ATCATCAGCGAGTGAGGGTT 56 214
23 ESSR161 AAACATTTTGGTTCGTGGAGAT CGCCGATGTGAGGTGATTC 58 192
24 ESSR165 AACCGACCAAGCCATACG CGGATTGCATCTTTCAAGTCT 56 212
25 ESSR168 CCACCGTCCATCTTGAATC TTATGAGTTCAAGAAGGCGG 55 203
26 ESSR200 TTCTCTGTTTGCCAAGTTGC CTTCCCATGACAAAAGAGCC 56 207
27 ESSR210 CCAGTAGTGGCAGTCAAAGC TTCCGAATAGCAGATAGCAAG 55 251
28 ESSR212 TCAGGCTTCGTGGTGGTATT TGCTCAGTTCCAAGGCTTCT 57 257
29 ESSR8 GGGTTAACTATGGAGTCTGCT CCATCTTCACTTGTTTTTGCT 53 176
30 ESSR20 GGTCTCCAACTGGGTTGTAC ATATTTTCCATTGCGTGTTTA 54 138
31 ESSR23 GTAAGGGGGACTTCACCTGTTT GCTTACTTTTAAAAATGCAGAGAGG 59 180
32 ESSR27 TGCTGCTCCGCTCATCC GATAGATAAAGGGTCCCAATAAGAG 57 216
33 ESSR39 GTTTCATCATGGATTTCTGGT CTACAGCCATACAGGGATAAAT 54 191
34 ESSR54 ACCGCTAAAGTAATAAAACAACCAT TTGCCTGTTACATCTCTCTCTGC 58 197
35 ESSR61 CGGAACATCTCTGAATCCTG TCACCAGAGATCGAAACGAC 55 199
36 ESSR64 GAAGGGCACAAGGAAGGC AGACAGACAGACGCAGAAAGAG 56 199
37 ESSR90 GTTTGTCGGGAAAGAATGTG CTCAAGGATTTCAACAACCAT 54 243
38 ESSR118 GAGAAGAAGCCACTGACGAC CAATGCTTTTAGCTGCTGTC 54 238
39 ESSR123 CTTGAGAGTAGAAACTGACCCAC CTCACAGAGAAAGTAGCGCAG 55 229
40 ESSR130 GGAACGGTCAGTCCCCCT AGATTGGAAGAGGAGAAAGGGT 58 212
41 ESSR151 TCCATCGTTTGTGTTTGTCTC GAACAATCTTAGCTGTGAGATGG 56 212
42 ESSR189 AAACGCGTAAATAGGTCGC TTCATCGATTTGGAAATTGG 56 267
43 ESSR196 CATTTTCAAGCACCTAGTTGG CAAATACATCATCACAACATGGT 55 240
注:1 ～ 28．有效扩增引物;29 ～ 43．没有扩增产物的引物。
Note:1 － 28． Represent primers have product;29 － 43． Represent primers have no product．
100 华 北 农 学 报 26 卷
的扩增结果。另外 15 对引物没有检测到扩增产物，
可能是由于所设计的引物跨越 mRNA 剪切位点或
者引物序列与扩增材料 DNA的序列差异较大，不能
有效匹配等原因造成的。结果表明:设计的 EST-
SSR引物可以作为分子标记进一步应用于南瓜属作
物遗传育种等研究中。
M． DNA标准分子量;EST-SSR引物． ESSR100、ESSR97、
ESSR116、ESSR148、ESSR165、ESSR158、ESSR74。
M． Maker;EST-SSR primers were ESSR100，ESSR97，
ESSR116，ESSR148，ESSR165，ESSR158，and ESSR74．
图 1 EST-SSR引物在 4 份南瓜自交系中的 PCR扩增结果
Fig． 1 Amplification of 7 primers in 4 Cucurbita inbred lines
2． 3 南瓜属作物不同品种杂交种纯度分析
利用特异的分子标记能够简便快速的鉴定商品
杂交种的纯度，提高准确性［8］。本研究利用获得的
28 对有稳定扩增产物的引物对南瓜不同杂交组合
的 26 个亲本(14 个西葫芦亲本、8 个中国南瓜亲本
和 4 个印度南瓜亲本)进行筛查，以获得不同杂交
组合中亲本鉴定的特异分子标记。并利用亲本之间
特异的分子标记进行商品杂种一代(F1)的纯度检
测分析。图 2 为标记 ESSR61 在亲本组合 Z13 × 14
(图 2-A)和标记 ESSR97 在亲本组合 Z39 × 40(图 2-
B)F1 杂种鉴定中的分析结果。EST-SSR 标记能够
有效鉴别杂交种以及来源于母本自交形成的种子。
13个不同杂交组合的杂种纯度分析结果见表 3，F1 杂
种纯度在 79． 2% ～ 100． 0%，这与田间种植鉴定的分
析结果高度吻合。其中，杂交组合 Z23 × 24 与 Z39 ×
40的 F1 杂种纯度较低，分别为 88． 5%与 79． 2%。
M． DNA标准分子量;P1．父本;P2．母本;
F1 ．子代杂交种;黑色箭头表示非杂交种。
M． Maker;P1． Male parent;P2． Female parent;F1 ． Hybrid seeds;
Vertical arrows indicate the contaminating seeds．
图 2 南瓜属作物杂交组合 Z13 ×14 与
Z39 ×40 F1 杂交种的纯度分析
Fig．2 Practical purity test for F1 hybrid seed of combinations
Z13 ×14(A)and Z39 ×40(B)using EST-SSR markers
表 3 南瓜属作物 13 个杂交组合 F1 杂种的纯度分析
Tab． 3 Purity testing of F1 hybrid seed using EST-SSR markers
杂交组合代号
Combinations
code
类型
Type
EST-SSR标记
ESSR
markers
检测种子数 /粒
Number of
testing seeds
杂交种数 /粒
Number of
hybrid seeds
种子纯度 /%
Seed purity
田间检测纯度 /%
Field test
purity
Z3 × 4 西葫芦 ESSR168 189 187 98． 9 99． 1
Z5 × 6 西葫芦 ESSR116 195 191 97． 9 98． 0
Z9 × 10 西葫芦 ESSR80 184 184 100． 0 100． 0
Z11 × 12 西葫芦 ESSR74 193 189 97． 9 98． 1
Z13 × 14 西葫芦 ESSR61 183 179 97． 8 98． 0
Z15 × 16 西葫芦 ESSR80 197 197 100． 0 100． 0
Z17 × 18 印度南瓜 ESSR142 190 190 100． 0 100． 0
Z19 × 20 印度南瓜 ESSR121 189 182 96． 3 96． 5
Z21 × 22 中国南瓜 ESSR148 195 191 97． 9 98． 1
Z23 × 24 中国南瓜 ESSR97 200 177 88． 5 88． 9
Z25 × 26 中国南瓜 ESSR61 204 204 100． 0 100． 0
Z27 × 28 西葫芦 ESSR142 186 186 100． 0 100． 0
Z39 × 40 中国南瓜 ESSR97 197 156 79． 2 79． 5
3 讨论
3． 1 南瓜 EST-SSR的特征
数据库下载的 1 457 条南瓜 EST序列中，有 215
条 EST序列挖掘到 SSR 位点，占 EST 序列总数的
14． 76%，高于大白菜［4］(10． 4%)、甘蓝［3］(6． 0%)、
小麦［6］(2． 1%)等作物 EST 序列中的 SSR 位点丰
度。但也有些研究中 EST 序列 SSRs 出现频率高达
16． 1% ～20． 19%［9，10］。不同研究中 SSRs 出现频率
的差异除了跟作物 EST 序列相关外，还可能与低质
6 期 张国裕等:南瓜属 EST-SSR标记的开发及在杂种纯度鉴定中的应用 101
量和冗余序列的去除严谨程度以及 SSR 位点筛选
时的参数设置有关。基元重复次数的设置是 SSR
位点多少的主要影响因素，相对较宽的搜索条件会
导致含 SSR位点的序列比例增加。
大多数植物的 EST-SSR 以三核苷酸和二核苷
酸重复类型为主［11］，但主导重复基元的类型不同植
物间有所差异。南瓜 EST-SSR 中重复类型最多是
三核苷酸(86 个，40%) ，这与高粱、甘蓝、大白菜等
植物的研究结果一致;其中，AAG 是南瓜三核苷酸
重复类型中出现频率最高的重复基元，这也与甘蓝、
大白菜等作物中 SSR 的分布特点相符［3，4，10］，进一
步证实了双子叶植物中 AAG 重复基元的丰度较高
这一推测［12］。
Morgante等［13］对多种不同植物综合分析后，认
为二核苷酸重复类型中 AG 重复基元所占比例最
高，并在大白菜、大麦、小麦和甘蓝等作物的研究中
得到证实［3］。但南瓜中 CT (21 个，占总数的
9. 77%)重复基元所占比例最高，这表明南瓜属作
物在二核苷酸重复基元的偏好性上有其自身的
特点。
本研究合成的 43 对 EST-SSR 引物中，在南瓜
属作物不同品种间有效扩增引物占 65． 12%，EST
序列较高的保守性使得 EST-SSR 在种与品种间有
较好的通用性，这一特点显著提高了标记的利用价
值，可增加现有标记的数目。但 EST 的保守性也导
致其扩增产物较基因组 SSR 标记多态性低，每对引
物检测出的等位基因只有 2 ～ 3 个。
3． 2 南瓜属 EST-SSR在杂种纯度鉴定中的应用
杂种优势利用是提高作物产量最有效的途径之
一，杂交种已广泛应用于南瓜属作物生产。分子标
记技术因其准确、快速、稳定以及不受环境影响等特
点，已逐步成为作物杂交种检测分析的首选工具。
罗伏青等［14］利用 RAPD 标记探讨了南瓜杂交种子
纯度鉴定的方法，验证了分子标记在南瓜杂交种纯
度鉴定中的准确性。刘泽发和孙小武［15］曾利用
RSAP标记鉴定南瓜杂交种子纯度。限于可利用
SSR标记的数量，目前还没有研究利用 SSR 分子标
记技术进行南瓜属作物杂交种的检测分析。SSR标
记的共显性特点可以将亲本与杂交种区分开，与
RAPD、RSAP等标记相比操作简便、可重复性好、准
确度高。本研究利用 EST-SSR 从种子到检测结果
仅需要 2 ～ 3 d，比田间鉴定(30 ～ 60 d)大大节约了
时间与人力物力投入，结果不受环境及人为因素干
扰，更为精准，在杂交种检测分析中应用前景广阔。
南瓜 EST-SSR 的开发丰富了南瓜属分子标记
数量，有助于南瓜遗传学研究及分子标记辅助育种。
EST-SSR标记在南瓜商业杂交种生产上的应用能更
简便快捷、科学准确地鉴定杂种纯度，促进商品种生
产的科学化与规范化。
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