全 文 ：Vol. 29 , No. 4
pp. 496～500 　July , 2003
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 29 卷 第 4 期
2003 年 7 月 　496～500 页
3 个玉米杂交种和亲本 SSR指纹图谱的构建
吴渝生1 ,2 　杨文鹏1 　郑用琏1 , Ξ
(1华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 ,湖北武汉 430070 ; 2云南农业大学农学与生物技术学院 ,云南昆明 650201)
摘 　要 　以 3 个云南省大面积推广的玉米杂交种及其亲本为试材 ,从 96 对 SSR 引物中筛选出 24 对引物 ,这些引物分布
在玉米基因组的 10 条染色体上 ,每对引物可以检测到 1～6 个数目不等的多态性片段 (allele) ,共 97 个多态性片段 ,平均
为 4. 04 个 ,片段大小介于 85～300 bp 之间。在比较分析各试材图谱的基础上 ,探讨了构建品种指纹图谱的统计学方法 ,
建立了适于种子检验中使用的标准 SSR 标记指纹图谱。对随机挑选的 4 个自交系进行了指纹图谱构建的理论与实践验
证。
关键词 　玉米 ; 指纹图谱 ; 种子检验
中图分类号 : S513 　　　文献标识码 : A
Establishment of Fingerprinting for Three Hybrids and Their Parents by SSR Mark2
ers
WU Yu2Sheng1 ,2 　YANG Wen2Peng1 　ZHENG Yong2Lian1 3
(1 National Key Laboratory of Crop Genetics and Improvement , Huazhong Agricultural University , Wuhan , Hubei 430070 ; 2 Faculty of Agronomy and Biotechnology ,
Yunnan Agricultural University , Kunming , Yunnan 650201 , China)
Abstract 　Three maize hybrids and their parents applied in Yunnan were analyzed by SSR marker to establish the standard
DNA fingerprinting for seed test . Twenty2four pair primers out of ninety2six pair primers was distributed on ten chromosomes
in maize genome. One allele to six alleles were detected by each pair primers. There were ninety2seven alleles detected in
total . The average of the allele detected was 4. 04 per pair primer. The band range in size was from 85 - 300 bp . Accord2
ing to the data above2mentioned , the fingerprinting of the maize parents was established and numbered firstly. Then the pa2
per introduced the method to calculate probability for the fingerprinting of each parent , and finally the standard , exclusive
fingerprinting of maize hybrids and their parents was determined to distinguish the truth and falseness of samples in seed
test . And the fingerprinting had be verified by SSR analyzing of 4 inbred lines selected randomly.
Key words 　Maize ; Fingerprinting ; Seed test
　　玉米杂交种和亲本的遗传真实性是种子质量的
重要标志之一 ,它直接影响着玉米生产的产量和质
量。建立快速、标准的玉米种子质量检测的方法已
成为各级政府、种子生产、经营部门和广大农民十分
关注 ,规范市场经济秩序迫切需要的技术之一。传
统的种子质量检验方法有田间性状鉴定和籽粒形态
鉴定 ,它们具有方法简单、快速经济的特点。但是 ,
田间性状鉴定所需周期长 ,耗费大量人力、物力和财
力 ,并且许多性状的表现常受栽培措施及环境因子
的影响 ,影响检测的精确度。籽粒形态鉴定所考查
的性状少、且易受环境条件影响 ,鉴定准确性在一定
程度上受鉴定者经验的制约。利用同工酶和蛋白质
电泳图谱的鉴定技术具有灵敏度高、准确、易操作等
优点 ,但同工酶位点及蛋白质种类有限 ,不能满足种
子纯度和种质资源及育种工作发展的需要[2 ] 。随着
分子生物学技术的飞速发展 ,新的有效的分子标记Ξ基金项目 :教育部西部高级访问学者计划项目资助。
作者简介 :吴渝生 (1964 - ) ,男 ,副教授 ,硕士 ,从事玉米种质改良及生物技术研究和教学工作。E2mail :yusheng2 @public. km. yn. cn。3 通讯作者 :郑用琏 ,教授 ,博士生导师 ,从事玉米种质改良和分子生物学研究与教学。E2mail :yonglian. zheng @263. net。
Received(收稿日期) :2002204209 ,Accepted(接受日期) :2002208220.

方法不断涌现 ,这无疑给作物品种基因型鉴定开辟
了一条新的发展途径。陈一华等对 12 个优良玉米
自交系的 DNA 进行 RAPD 分析 ,获得 RAPD2DNA 指
纹图谱 ,建立了这些自交系计算机化的 DNA 指纹 ,
可用于玉米自交系真伪及纯度鉴定[3 ] ,但是 ,RAPD
反应受条件影响较大 ,稳定性和重复性相对较差。
SSR 标记技术可根据不同作物基因组序列设计特异
引物 ,进行 PCR 扩增 ,它已广泛用于玉米种质资源
鉴定、遗传连锁图谱绘制、目标性状基因的定位以及
自交系遗传变异分析、杂种优势群的划分等[4 ] 。
本研究采用 SSR 标记技术对云南省种植面积
较大的 3 个玉米杂交种及其亲本进行分析 ,构建
SSR2DNA 指纹图谱 ,并使之数字化 ,计算出现相同图
谱的概率 ,建立适用于这些玉米杂交种及亲本遗传
真实性鉴定的指纹图谱和技术体系。
1 　材料与方法
1. 1 　玉米材料
　　云南省种植面积较大的 3 个玉米杂交种及其自
交系会单 4 号 (素湾 1611 ×1073) 、路单 4 号 (木 6 ×
LA8593) 、路单 6 号 (LQ16 ×LA572) ,其他材料是
Mo17、8721、Z3、HZ85、华玉 4 号。以上试材均由云南
省石林县种子公司和华中农业大学提供。所有种子
都通过严格套袋自交或杂交获取。
1. 2 　DNA提取
各取 20 粒供试材料 ,置于培养箱中暗培养 10 d
左右 ,形成黄化苗。用 CTAB 法提取黄化叶片总
DNA[5 ] ,紫外分光光度计检测 DNA 浓度和质量 ,将
DNA 样品浓度稀释至 10 ng/μL , - 20 ℃下保存备用。
1. 3 　SSR分析
PCR 扩增反应体系为 20μL ,其中 1 ×Buffer ,25
mmol/ L Mg2 + ,150μmol/ L dNTP , 013μmol/ L SSR 引
物 ,0175 单位 Taq DNA 聚合酶 ,50 ng DNA 模板。反
应液上加盖 1 滴矿物油。PCR 反应过程包括 :93 ℃
1 min ,1 个循环 ;93 ℃1 min ,58 ℃2 min ,72 ℃2 min ,
共 30 个循环 ;最后于 72 ℃5 min。PCR 扩增产物经
6 %聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,硝酸银染色 ,照相 ,获得杂
交种和亲本的指纹图谱[6 ] 。在相同迁移率位置上的
SSR 扩增产物 ,有带记为 1 ,无带记为 0。
2 　结果和分析
2. 1 　SSR引物的筛选
　　选择均匀分布于 10 条染色体上的 96 对 SSR 引
物对 6 份自交系 DNA 进行多态性分析 ,选出扩增带
型稳定 ,多态性丰富 ,重复性较好的 24 对引物 ,详见
表 1。这些引物分布于玉米基因组的 10 条染色体
上 ,共检测出 97 个 alleles (等位基因) ,每对引物可以
检测到 1～6 个数目不等的等位基因 ,平均为 4. 04
个 ,片段大小介于 85～300 bp 之间。
表 1 玉米自交系中 SSR检测的等位基因
Table 1 The alleles detected by SSR in maize inbred lines
编号 引物 染色体位置 等位基因数 片段大小
No Primer Genomic location Alleles Band range (bp)
1 Bnlg149 1. 00 3 150 - 160
2 Bnlg1083 1. 02 5 190 - 230
15 Bnlg469 2. 02 1 270
20 Bnlg1225 2. 06 2 198 - 200
21 Bnlg1633 2. 07 4 160 - 200
26 Nc030 3. 04 5 85 - 120
28 Phi053 3. 05 5 150 - 196
36 Nc004 4. 03 5 110 - 190
41 Bnlg1189 4. 07 5 210 - 240
50 Bnlg1647 4. 07 5 160 - 215
55 Bnlg1401 9. 02 6 180 - 210
51 Bnlg1885 5. 07 5 255 - 300
63 Phi085 5. 07 4 85 - 105
52 Bnlg2097 6. 01 6 160 - 220
66 Y1SSR 6. 02 4 198 - 240
71 Phi057 7. 01 2 150 - 160
53 Bnlg1305 7. 03 4 160 - 220
54 Bnlg2834 8. 03 4 165 - 180
81 Phi080 8. 09 3 150 - 160
82 Phi033 9. 01 2 230 - 235
89 Phi065 9. 03 5 120 - 145
91 Bnlg1209 9. 05 6 162 - 190
56 Bnlg236 10. 06 3 150 - 270
100 Bnlg1839 10. 07 3 190 - 220
总和 Total 97
平均 Mean 4. 04
2. 2 　亲本的指纹图谱及数字化
根据数理统计学的理论[7 ] ,倘从一个有限总体
按照样本一定的容量随机抽出全部所有可能的样
本 ,其数目可用 N n 公式计算 , N 为总体个体数 , n
794　4 期 吴渝生等 : 3 个玉米杂交种和亲本 SSR 指纹图谱的构建 　　　

为抽出的样本容量即样本所包含的个体数 ,例如 , N
= 3 , n = 2 ,则有 32 = 9 个所有样本。分子遗传学理
论认为[8 ,9 ] , 在 SSR 分子标记座位上的 allele (等位
基因)通常表现为共显性 ,而同一迁移率位点的电泳
带纹则表现为“有”、“无”的显性关系。生物个体的
SSR 指纹图谱是由不同位点上的、不同类型的等位
基因组合而成。等位基因的表型是通过同一个位点
上扩增、电泳的条带的有、无及数量而确定的 ,玉米
自交系间具有的多态性条带数目越多 ,建立的指纹
图谱就越准确。每个自交系指纹图谱出现的概率可
用 1/ 2 n 公式计算 ,式中“2”为同一迁移率位点上的
等位基因“有”、“无”的两种关系 ,数字化处理中用 1
表示“有”,0 表示“无”;“n”为等位基因的数目 ; 2 n
则为检测 n 个等位基因时涉及的所有可能的自交系
个数。
以“素湾 1611”(1 号样品) 为例 ,说明该自交系
亲本指纹图谱概率的计算。在图 1 中 ,引物 21 扩增
的位点是 2107 ,等位基因数目为 4 个 ,出现与该亲本
指纹图谱完全相同的另一张图谱的概率为 1/ 16 ,即
在用该引物扩增任意的 16 份自交系 DNA 而建立的
16 张指纹图谱中 ,会出现 1 张图谱与图 1 中该自交
系的指纹图谱完全相同。引物 41 扩增的位点是
4107 ,等位基因数目为 5 个 ,出现与该自交系指纹图
谱完全相同的另一张图谱的概率为 1/ 32 ,即在用该
引物扩增任意的 32 份自交系 DNA 而建立的 32 张
指纹图谱中 ,会出现 1 张图谱与图 1 中该自交系的
指纹图谱完全相同。余类推。出现与引物 66、71、82
和 100 扩增的该自交系指纹图谱完全相同的另一张
图谱的概率分别为 1/ 16、1/ 4、1/ 4、1/ 8。那么 ,出现
一张与图 1 中 6 对引物同时扩增的该自交系指纹图
谱完全相同图谱的概率为 :1/ 220 = 1/ 1048576 = 915
×10 - 7 ,或者 1/ 16 ×1/ 32 ×1/ 16 ×1/ 4 ×1/ 4 ×1/ 8 =
1/ 1048576 = 915 ×10 - 7。也就是说 ,在用上述 6 对
引物同时扩增 1048576 份自交系 DNA ,会出现 1 张
图谱与图 1 中该自交系的指纹图谱完全相同。可
见 ,同时使用这 6 对引物建立的“素湾 1611”的指纹
图谱 ,出现与之完全相同的另一张图谱的概率十分
的微小 ,可以近似看作零。若与该自交系其余 18 对
引物建立的指纹图谱结合使用 ,那么 ,这个指纹图谱
可以用作这个亲本真伪的鉴定。另外 5 份亲本指纹
图谱的概率计算及使用可以按照上述方法类推而
得。
将筛选到的 24 对引物所扩增的片段数字化 ,使
每一个亲本的指纹图谱都用相应的数字表示 ,构成
亲本的号码 ,如同每一个人的身份证号码一样。表
3 是本研究中 6 个亲本相应的数字化指纹以及出现
相同指纹的概率。
从表 2 可知 ,“素湾 1611”的指纹号码分别由 97
个顺序不同的数字组成 ,出现与它完全相同数字的
概率为 613 ×10 - 30 ,即在 613 ×1030份自交系中 ,只有
1 份自交系具有上述指纹号码。所以 ,这个指纹号
码是该自交系特有的号码 ,它们构成“素湾 1611”标
准的数字化指纹图谱 ,可以用于该自交系的真伪鉴
定。同理 ,其余 5 个自交系的指纹号码构成其相应
的标准的数字化指纹图谱 ,同样可以用于这些自交
系的真伪鉴定。
图 1 玉米亲本不同引物的 SSR 指纹图谱
Fig. 1 The finger printing of maize inbred lines by SSR with different primers
PM:引物 ;M:标准分子量 ,自上而下分别为 300 bp ,200 bp ,150 bp ;1 :素湾 1611 ;2 :1073 ;3 :木 6 ;4 :8593 ;5 :LQ16 ;6 :LA572
PM:Primer ;M:Molecular marker standard ,300 bp , 200 bp , 150 bp from top to bottom respectively ;
1 :Suwan1611 ;2 :1073 ;3 :Mu6 ;4 :8593 ;5 :LQ16 ;6 :LA572
894 　　　作 　　物 　　学 　　报 29 卷 　

表 2 6 个自交系数字化的指纹图谱
Table 2 The numbered finger printing of six maize inbred lines
编号 名称 号码 概率
No. Name Code Prob.
1 素湾 1611 100 - 00001 - 1 - 10 - 0110 - 00100 - 10000 - 01000 - 00010 - 00001 613 ×10 - 30
Suwan 1611 - 000010 - 00001 - 0001 - 100000 - 0010 - 10 - 0011 - 0110 - 000
- 01 - 00010 - 100100 - 000 - 001
2 1073 010 - 01000 - 1 - 10 - 1010 - 10000 - 00101 - 00101 - 00010 - 00010 613 ×10 - 30
- 001000 - 00010 - 1110 - 001101 - 0100 - 01 - 0011 - 0110 - 100
- 01 - 00001 - 010010 - 000 - 010
3 木 6 000 - 00010 - 1 - 10 - 0001 - 01010 - 01000 - 00101 - 10000 - 01000 613 ×10 - 30
Mu 6 - 100000 - 00100 - 1110 - 011000 - 0001 - 10 - 0011 - 0111 - 001
- 01 - 00100 - 001001 - 000 - 001
4 LA8593 001 - 10000 - 1 - 01 - 1010 - 01010 - 00010 - 00000 - 00000 - 00001 613 ×10 - 30
- 000000 - 00001 - 1001 - 000010 - 0100 - 01 - 0011 - 1001 - 001
- 10 - 00010 - 000000 - 000 - 101
5 LQ16 100 - 00001 - 1 - 10 - 0001 - 01010 - 00000 - 11010 - 00100 - 00001 613 ×10 - 30
- 010000 - 00100 - 0001 - 001101 - 0100 - 01 - 0100 - 0000 - 001
- 01 - 10111 - 000000 - 101 - 010
6 LA572 100 - 00100 - 1 - 10 - 0010 - 10000 - 10000 - 01010 - 01000 - 10000 613 ×10 - 30
- 000101 - 00100 - 0110 - 101000 - 1000 - 01 - 1000 - 1110 - 010
- 01 - 01000 - 010010 - 101 - 001
图 2 不同引物自交系的 SSR 指纹图谱
Fig1 2 The fingerprinting of inbred lines by SSR with different primers
PM:引物 ;M:200 bp 标准分子量 ;1 :素湾 1611 ;2 :1073 ;3 :木 6 ;4 :8593 ; 　5 :LQ16 ;6 :LA572 ;7 :Mo17 ;8 :87 - 1 ;9 :Z3 ;10 :HZ85
PM:Primer ;M:200 bp marker :Suwan 1611 ;2 :1073 ;3 :Mu 6 ;4 :8593 ; 　5 :LQ16 ;6 :LA572 ;7 :Mo17 ;8 :87 - 1 ;9 :Z3 ;10 :HZ85
　　为了验证上述的理论推论和指纹图谱的实用
性 ,对随机挑选的 4 个自交系 Mo17、87 - 1、Z3、
HZ85 ,选用 21 号引物和 28 号引物 ,构建其部分指纹
图谱 ,并与已构建的素湾 1611、1073、木 6、8593、
LQ16、LA572 的图谱进行比较分析。如图 2 所示 ,第
7～10 泳道的 Mo17、87 - 1、Z3、HZ85 电泳条带数目
和位置不同 ,都能与本研究中的 6 个自交系区别开
来。验证实验结果进一步证实了本文依据 6 个自交
系 ,97 个 SSR 带纹建立的指纹图谱 ,在理论推论和
实际应用中具有一定的可靠性。
213 　杂交种和亲本的指纹图谱
图 3 结果表明 ,引物 PM41 和 PM51 的指纹图谱
中 ,会单 4 号 ,路单 4 号 ,路单 6 号均表现出较好的
杂种共显性图谱的特征 ,可直接用于杂交种的真伪
质量鉴定。引物能很好地将随机挑选的华玉 4 号杂
交种与其他已测的 3 个云南杂交种区别开来。
994　4 期 吴渝生等 : 3 个玉米杂交种和亲本 SSR 指纹图谱的构建 　　　

图 3 不同引物杂交种和亲本的 SSR 指纹图谱
Fig. 3 The fingerprinting of hybrids and their parents by SSR with different primers
PM:引物 ;H1 :会单 4 号 ;H2 :路单 4 号 ;H3 :路单 6 号 ;H4 :华玉 4 号 ;1 :素湾 1611 ;2 :1073 ;3 :木 6 ;4 :8593 ;5 :LQ16 ;6 :LA572
PM:Primer ;H1 :Huidan No. 4 ;H2 :Ludan No. 4 ;H3 :Ludan No. 6 ;H4 :Huayu No. 4 1 :Suwan 1611 ;2 :1073 ;3 :Mu 6 ;4 :8593 ;5 :LQ16 ;6 :LA572
　
3 　讨论
SSR 分子标记技术是基因组研究中应用较为广
泛的标记系统。SSR 标记的等位基因变异来源于基
因组 DNA 复制时的滑动、不对称交换等原因引起的
重复序列的变化 ,因而表现出高度的多态性 ,同时
SSR 标记相对于其他分子标记具有检测快捷、简便、
稳定的特点。玉米中已鉴定出大约 1800 个 SSRs ,
并已广泛地应用在遗传多型性分析 ,遗传图谱构建 ,
自交系系谱研究 ,杂交优势群划分和 DNA 指纹图谱
的建立上。
在指纹图谱的构建和应用过程中 ,引起育种学
家高度关注的问题是 ,仅对有限试材 ,依据有限引物
扩增的带型 ,所建立的指纹图谱是否具有该品种的
特异性 ? 这一问题的实质乃是在同一物种范围内的
所有基因型材料中 ,出现完全相同的指纹图谱的概
率。本研究选用了具有不同遗传基础的 6 个云南重
要的骨干自交系为试材 ,选择均匀分布于 10 条染色
体上的 96 对 SSR 引物 ,进行多态性分析 ,筛选出扩
增带型稳定 ,多态性丰富 ,重复性较好并分布于玉米
整个基因组的 24 对引物 ,共检测出 97 个等位基因
(alleles) ,每对引物可以检测到 1～6 个数目不等的
等位基因 ,确定出可以区分不同自交系的 97 个位点
的指纹图谱 ,并根据概率论的数理统计原理 ,计算出
在 97 个位点上出现完全相同带型的概率是 613 ×
10 - 30。根据这一理论分析结果 ,在全国所有的玉米
自交系中出现完全相同指纹图谱的可能性极低。当
然任何一个实验室都不可能对我国现有的所有自交
系 ,进行全基因组所有位点的遗传差异的分析 ,显然
这只能是在取得一定数量的研究资料的基础上 ,通
过统计学的理论分析 ,证明某一指纹的“特异性”或
“惟一性”。为了验证本研究结果和分析的可靠性 ,
我们对随机挑选的 4 个玉米材料进行了图谱的验证
研究 ,结果证明了本研究所建立的指纹图谱具有可
靠的理论依据和较好的实用性。由于本研究所检测
到的位点只有 97 个 ,每一位点的等位基因也仅有
1～6个 ,所以在实际应用中如发现两个试材具有相
同的指纹图谱 ,可继续筛选新的 SSR 引物 ,以补充
和扩展现已建立的初步指纹图谱。
References
[1 ] 　Liu J2L (刘纪麟) . Maize Breeding (Second Edition) ( 玉米育种学
(第二版) ) . Beijing :China Agricultural Press , 2002. 141 —150
[2 ] 　Liu H(刘华) , Wang Y2S(王宇生) , Zhang H(张辉) ,Cao Y2S(曹
永生) , Zhou R2H (周荣华) , Jia J2Z (贾继曾) . Preliminary con2
struction and application of gliadin fingerprintings database of Chinese
wheat germplasm. Acta Agronomica Sinica (作物学报) , 1999 , 25
(6) :674 —682
[3 ] 　Chen Y2H(陈一华) , Zhang C2L (张超良) , Wang Z2L (王泽立) ,
Jin D2M(金德敏) , Weng M2L (翁曼丽) , Wang B(王斌) . Comput2
erized identification of DNA fingerprinting of maize seed. Chin J Appl
Environ Biol (应用与环境生物学报) . 2000 ,6 (3) :223 —226
[4 ] 　Li X2H(李新海) , Fu J2H(傅骏华) , Zhang S2H(张世煌) , Yuan
L2X(袁力行) , Li M2S(李明顺) . Genetic variation of inbred lines of
maize detected by SSR markers. Scientia Agricultura Sinica (中国农
业科学) , 2000 ,33(2) :1 —9
[5 ] 　Ausubel F M , Kingston R E , Seidman J G, Struhl K,Brent R ,Moore
D D ,Smith J A. Short Protocols in Molecular Biology(Second Edition)
[精编分子生物学实验指南 (第二版) ] . Beijing : Science Press ,
1998. 37 —38
[ 6 ] 　Sambrook J , Fritsch E F , Maniatis T. Molecular Cloning : A Laborato2
ry Manual (Second Edition) [分子克隆实验指南 (第二版) ] . Bei2
jing : Science Press , 1998. 325 —331
[7 ] 　Nanjing Agricultural University (南京农业大学) . Field Experiment
and Statistics (Second Edition) [田间试验和统计方法 (第二版) ] .
Beijing : China Agriculture Press. 1998 , 51 —54
[8 ] 　Zhejiang Agricultural University(浙江农业大学) . Genetics (Second
Edition) [ 遗传学 (第二版) ] . Beijing : China Agriculture Press ,
1998 , 39 —42
[9 ] 　Xu Y2B (徐云碧) , Zhu L2H(朱立煌) . Molecular Quantitative Ge2
netics(分子数量遗传学) . Beijing : China Agriculture Press , 1994.
55 —91
005 　　　作 　　物 　　学 　　报 29 卷