全 文 ：第28卷 第2期 作　物　学　报 V ol. 28, N o. 2
2002 年3月　 221～ 226页 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 221～ 226　M ar. , 2002
玉米AFLP 指纹图谱的引物选择研究Ξ
张春庆　贾继增
(中国农业科学院品种资源研究所, 北京, 100081)
摘　要　A FL P 分子标记技术将对玉米品种指纹文库的构建发挥巨大作用, 因此对玉米A FL P 指纹图谱的引物选择研
究具有重要意义。通过研究发现: ①用M seÉ 和 E coR É 酶切后, 酶切位点后第一个碱基 T 占的比例高达30% 左右, 其
次A 占27% 左右, G、C 占的比例较少, 为21% 左右。第二个碱基 T 占27% 左右, A、G、C 分别占24% 左右较均匀。因
此以 T T 选择引物时扩增的谱带较多。②不同引物扩增的谱带的多态性不同, 多态性强的引物组合可分为两类。其一
为多态性主要由一端引物产生的; 其二为多态性由两端共同决定的。对多态性贡献较大的两个引物组合可能产生更高
的多态性。③随引物选择碱基的增加, 扩增的谱带数有所降低。同时增加一个选择碱基, 在M 端增加一个选择碱基较
在 E 端增加一个选择碱基, 谱带数目降低较多。④在多态性较高的2+ 2引物组合中, 增加第3个选择碱基, 可选出多态
性更强的引物组合。⑤选择多态性强的引物组合可按如下程序: 第一步选择2～ 4组亲缘关系相近的材料6～ 12个。第二
步, 将两端碱基相同的2+ 2引物组合 (16对)全部选择扩增, 以筛选有多态性的2+ 2引物组合。第三步, 重组有多态的2
+ 2引物, 以筛选多态性较强的2+ 2引物。第四步, 将多态性较强的2+ 2引物一端分别增加第3个选择碱基, 筛选多态
性高谱带质量好的2+ 3或3+ 2引物组合。根据这一程序, 选出M GA EGA G和M GAA EGA两引物组合, 扩增谱带多态性强、谱
带数目多、且质量好, 可作为玉米A FL P 指纹的高多态引物。⑥杂交种的指纹包含了双亲的所有带型, 即双亲有差异
的谱带在 F 1代同时表现。
关键词　玉米; 指纹; A FL P; 引物选择
中图分类号: S513. 032　　　文献标识码: A
Studies on the Pr imers for AFL P F ingerpr in ts of M a ize
ZHAN G Chun2Q ing　J IA J i2Zeng
(C rop Germ p lasm Institu te, Chinese A g ricultural A cad em y , B eij ing 100081, China)
Abstract　A FL P m ark techn ique w ill p lay an importan t ro le in constructing cultivar fingerp rin t database of
m aize, so selecting suitable p rim ers fo r A FL P fingerp rin ts of m aize is very importan t. Study results show ed as
fo llow s: ①T he percen tages of first bases after digested by M seÉ and E coR É w ere about 30% for T 27% for
A and 21% for G and G respectly. T he percen tages of second basesw ere about 27% for T , 24% for A , G and
C respectly. So, the amp lification bands w ere m uch more w h ile to use p rim ers w ith T T selective bases. ②
D ifferen t p rim ers brough t about differen t po lymorph ism. H igh po lymorph ic p rim er com binations could be
divided in to two k inds, one of w h ich m ain ly brough t in to po lymorph ism by one end p rim er, ano ther one of
w h ich did it by two end p rim ers. M uch more po lymorph ism could be p roduced by recom binations of p rim ers,
w h ich con tributed m uch to po lymorph ism. ③T he bands decreased w ith adding selective bases. T he bands
decreased m uch more w h ile adding one selective base at M end than at E end. ④H igh ly po lymorph ic p rim er
com binations could be selected from the p rim ers added th ird selective base to 2+ 2 p rim ers that could bring
about h igh po lymorph ism. ⑤Selecting h igh ly po lymorph ic p rim er com binations m igh t fo llow th is p rocedure:
first. selecting 6～ 12 m aterials about 2～ 4 group s w h ich have close genetic relations; secondly, selecting
po lymorph ic 2+ 2 p rim ers th rough selective amp lification w ith all sam e 2+ 2 p rim ers at two ends; th irdly,
recom binating po lymorph ic 2 + 2 p rim ers to choose h igh ly po lymorph ic 2 + 2 p rim er com binations; then,Ξ 基金项目: 国家九õ五攻关课题资助 (962014201206)
作者简介: 张春庆, 男, 山东临朐, 教授, 博士, 遗传育种专业主要从事种子科学与技术研究, 目前在山东农业大学农学院工作。
Received on (收稿日期) : 2001203222, A ccep ted on (接受日期) : 2001204219

selecting m uch more po lymorph ic 2+ 3 or 3+ 2 p rim er com binations by adding one selective base at end of 2+
2 p rim ers. M GA EGA G and M GAA EGA w ere selected by above2m entioned p rogram , W h ich would p roduce more
bands. h igh po lymorph ism and h igh quality bands, and could be used as standard p rim ers of m aize A FL P
fingerp rin ts. ⑥F ingerp rin ts of hybrids con tained all bands of double paren ts.
Key words　M aize; F ingerp rin t; A FL P; P rim er selection
　　玉米是世界上第3大粮食作物, 在我国有2千万
公顷, 常年用种量约7. 5亿 kg, 是我国北方种子行
业最大的支柱作物, 研究其品种指纹同样具有重要
的价值。虽然已研究成功 NAU 2PA GE 和 AU 2
PA GE 技术[ 1 ] [ 2 ] , 可用于玉米品种蛋白指纹的研
究, 但其谱带较少 (20～ 29条) , 难以满足对大量玉
米材料品种指纹的研究。A FL P 技术 (Zabeau 和
V os, 1994, 1995) [ 5 ]是一种非常有效的分子标记技
术, 前人多将这一技术应用在水稻 (Cho 等1996, J.
Zhu 等1998) [ 4 ]、大麦 (Becker 等, 1995)、大豆 (L in
等1996)、甜菜 (A n van den B roecke 等1998) [ 3 ]等作
物的性状标记、遗传作图及生物多样性研究等方
面, A FL P 在品种指纹方面的研究目前还报道较
少, 针对这一问题, 本文对制作玉米A FL P 指纹图
谱的引物选择进行了研究。选出了制作玉米品种指
纹的高多态引物组合, 同时证明, 在玉米引物选择
中所采用的研究方法和程序是非常有效的, 可用于
其它作物品种指纹研究中A FL P 引物的选择。
1　材料与方法
1. 1　材料
本文采用了两个亲缘关系相近的群, 其一为
330系统包括自330 (来源 oh43×可利62)、晋穗54
(自330变异) , KH 2 (来源587×自330)、粤1322 (来
源于B 73×330)、6333 (来源于自330×B 67)、材602
72 (来源于自330×门可B ) ; 其二为黄早4系统, 包
括黄早4、塘四平头、84 (来源于W 641A ×黄早4)、
黄早4215 (来源于黄早4变异株)、文黄31413 (源于
文青131×黄早4)、黄4052 (来源于许052×黄早4)。
这些材料均由中国农科院品种资源所玉米室提供。
如果选出的引物不仅系统间能区分, 同时系统内也
能很好的区分, 那么这些引物在玉米的A FL P 指纹
的绘制时, 肯定多态性很高。利用选出的引物对随
机收集的41个玉米材料的A FL P 指纹进行测定, 以
检验引物的多态性。这41个玉米材料: 龙单13、龙
抗11、K10、通单2号、SC122、自330、扎单201、鹤
马、木6、晴三、SSE232、晴72925、新玉6、南75、
103A、苏玉1、苏8021、黄早4、苏玉5、黄杂 (1)、
SL 2166、白单13、N 259、丹705、白单9、杂 C546、
吉818、丹玉13、E28、丹玉21、黄42823、478、515、
掖单13、丹340、掖单19、52106、832、楚单5号、
M 017、楚201。
1. 2　方法
DNA 的提取采用酚一氯法提取幼苗 DNA。
A FL P 采用 Key gene 2. 1版和银染方法。用M sel和
EcoR 1内切酶及相应接头 (adap ter) 和引物体系。酶
切连接后用M oo Eoo 预扩增, 然后用两端碱基相同
的2+ 2引物M AA EAA、M AC EAC、M A G EA G、M A T EA T、
M CA ECA、M CC ECC、M CGECG、M CT ECT、M GA EGA、M GC
EGC、M GGEGG、M GT EGT、M TA ETA、M TCETC、M TGET G、
M T T ETT对12个材料进行选择扩增、电泳、银染、然
后对肉眼可辨的谱带进行统计。①计算各种引物组
合扩增的带纹平均数及变异系数。②统计酶切位点
后第1个碱基和第2个碱基的百分率。i、j 代表A、
C、G、T 四个碱基; N ij表示两端以 ij 作为选择碱基
对12个材料扩增的平均带数。③统计12个材料的总
的多态性谱带的数目、第1群 (自330系统) 的多态性
谱带数目及第二群 (黄早4系统)的多态性谱带数目。
第1个碱基的百分率 P i = ∑N ij × 100∑∑N ij
　　第2个碱基的百分率 P j = ∑N ij × 100∑∑N ij
　　根据以上统计结果进一步分析酶切位点后的碱
基变化规律, 设计碱基组合验证谱带的变化规律。
选择多态性强且谱带多、质量好的引物组合作为玉
米品种指纹绘制的引物。
2　结果分析
2. 1　2+ 2引物选择扩增结果
两个选择碱基的引物共有16种 (4×4) 分别是:
AA、A C、A G、A T、CA、CC、CG、CT、GA、GC、
GG、GT、TA、TC、T G、T T , M se É 酶切端和
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E coR É 酶切端组合共有256种 (16×16) , 对256种引
物组合全部测定可以分析得出M se É 酶切端和
E coR É 酶端第1和第2碱基的变化规律, 但这种试验
是不现实的。在本研究中, 从256种2+ 2引物组合
中选出了1ö16即16种, 两端选择碱基相同的引物作
为样本, 如M AA EAA、M AC EAC等, 用这些结果只能
分析两端酶切位点后两个碱基的变化规律, 但不能
分析每端的碱基变化规律。测定结果见表1, 进一
步计算得表2。
由表1可以看出: ①不同引物组合扩增谱带多
态性不同, M GA EGA组合多态性较高, 12个材料31条
多态性谱带; 其次为M TA ETA 和M CA ECA , 分别有17
和16条多态性带。M GA EGA 和M TA ETA 可将12个品种
全部分开, 其它一些引物组合多态性较低。②两组
样品中自330组 (来自330有亲缘关系的样品)的多态
性高于黄早4组, 说明黄早4组的各样品亲缘关系更
加接近。③在玉米材料中以 T 为第1选择碱基的引
物组合扩增的带数多于以A 为第1选择碱基的组
合。以 G、C 为第一碱基的组合扩增的带数目较少。
④以 G 为第一选择碱基的引物扩增的谱带的变异
系数较大, 平均10. 89, 而以A 和 T 为第一选择碱
基的引物组合扩增的谱带变异系数较小。
从表2可以看出: ①以M se I 和 E coR I 酶切后,
第一个碱基 T 占的比例最高, 30% 左右, A 次之,
27% 左右, G、C 占的比例相对较少, 两组样品差异
不大。②第2碱基的以 T 最多, 27%。A、C、G 占的
比例较为均衡。所以样品在选择扩增时两端以 T T
为引物的组合扩增的带数最多。
2. 2　引物组合与扩增谱带多态性的关系
在前一部分结果中可以看出, 一些引物组合扩
增出的谱带多态性较差, 如M A T EA T、M CCECC等; 有
些引物组合扩增出的谱带多态性较高, 如M GA EGA、
M A G EA G、M TA ETA、M CA ECA 等。在多态性较高的引
物组合中, 两端的引物与扩增谱带多态性有什么关
系呢? 哪一端引物对谱带多态性贡献大呢? 在第一
部分的试验设计中是分析不出来的, 需要采用替代
试验分析部分引物组合中各端引物与扩增谱带多态
性的关系。部分引物组合扩增结果见表3。
由表3结果分析得出: ①将M GA EGA 与M TA ETA
两组合的引物交换, 组成M GA ETA 和M TA EGA 引物组
合, 扩增结果发现M GA ETA 多态带数3条, 较交换前
两种引物组合多态性 (两组引物多态性平均为24条)
降低幅度较大, M TA EGA 多态数为13, 其多态性少有
降低。说明在M GA EGA和M TA ETA 引物组合中, M GA、
ETA 对多态性贡献较小, M TA、EGA 相对贡献较大;
②将M GA EGA 与M A G EA G两组合的引物交换, 组成
M GA EA G和M A GEGA 引物组合, 扩增多态带数分别为
19和35, M GA、EA G多态性较交换前平均20. 5条多态
带少有降低, M A GEGA多态性提高幅度较大。表明在
M A GEA G中的多态性是由两端引物共同决定的。③
将M GA 与多态性较差 (表1) 组合中 EA T和 ECC , 组合
成M GA EA T M GA ECC引物组合, 扩增出谱带多态性仍
较差, 进一步证明M GA 在M GA EGA 组合中对多态性
贡献较小的结论。
由以上分析可得出: 将多态性较高的引物组合
可分为两类, 其一为多态性主要由一端引物产生如
M GA EGA 引物组合中 EGA ; 其二为多态性由两端引物
共同决定, 如M GA EA G。对多态性贡献较大的两引
物组合可能产生高的多态性, 如M A G EGA , 多态性
较差的两引物组合其多态性仍然较差, 如M GA EA T
M GA ECC等。
2. 3　高多态性引物的选择
由2. 2部分发现在2+ 2引物组合中M GA EGA 和
M A GEGA 多态性较高, 多态谱带分别为31和35, 12个
试验材料均可得到区分, 为了进一步提高多态性水
平, 分析第3个选择碱基对多态性的影响。
将多态性较高的2+ 2引物组合中的M GA EGA 的
E 端增加第3个选择碱基, 组成M GA EGAA、M GA EGAC、
M GA EGA G、M GA EGA T引物组合; M 端增加第3个选择
碱基, 组成M GAA EGA、M GACEGA、M GA GEGA、M GA T EGA
引物组合。将多态性较高的2+ 2引物组合中的M A G
EGA 的 E 端增加第3个选择碱基, 组成M A G EGAA、
M A GEGAC、M A GEGA G、M A GEGA T; M 端增加第3个选择
碱基组成M A GA EGA、M A GCEGA、M A GGEGA、M A GT EGA。
扩增结果见表4。
由表4可得出: ①增加第3个选择碱基后扩增的
谱带数有所降低。表1和表3中19对2+ 2引物组合扩
增出的谱带平均为94. 3, 表4中16对3+ 2 (或2+ 3)
引物组合扩增出的谱带平均为75. 6, 较2+ 2引物组
合谱带数减少19. 8%。②在3+ 2和2+ 3引物组合中
8组3+ 2引物组合扩增谱带数平均59. 3, 8组2+ 3引
物组合扩增谱带数平均91. 9, 3+ 2引物组合较2+ 3
引物组合扩增谱带少35. 5%。③增加第3个选择碱
基 后, 谱 带 的 多 态 性 有 些 组 合
较原2+ 2引物组合有所提高, 有些组合有所降低。
3222期　　　　　　　　　　　　　　张春庆等: 玉米A FL P 指纹图谱的引物选择研究　　　　　　　　　　　　　　　　


表4　高多态性引物选择
Table 4　H ighly polymophic pr imer selection
M GA EGAA M GA EGAC M GA EGA G M GA EGA T M GAA EGA M GACEGA M GA GEGA M GA T EGA
Band m ean of to tal m aterials 92. 6 88. 6 125. 7 120. 8 75. 8 46. 7 60. 9 45. 6
V ariation Coefficieut of to tal m aterials 2. 18 2. 33 3. 75 8. 06 4. 73 4. 92 8. 54 3. 03
Polymorphic bands of to tal m aterials 22 26 47 28 42 13 20 6
Polymorphic bands of Zi330 group 16 16 36 23 32 6 17 4
Polymorphic bands of Huangzao 4 group 8 4 21 13 26 4 10 3
M A GEGAA M A GEGAC M A GEGA G M A GEGA T M A GA EGA M A GCEGA M A GGEGA M A GTEGA
Band m ean of to tal m aterials 82. 08 87. 6 62. 3 75. 4 53. 7 47. 3 71. 8 72. 8
V ariation Coefficient of to tal m aterials 1. 83 1. 86 2. 66 4. 21 4. 79 7. 05 3. 81 3. 62
Polymorphic bands of to tal m aterials 27 24 17 31 24 23 43 33
Polymorphic bands of Zi330 group 16 20 12 25 17 17 36 30
Polymorphic bands of Huangzao 4 group 16 12 6 16 6 7 25 22
图1　用M GA EGA G和M GAA EGA 扩增的玉米A FL P 指纹
F ig. 1　A FL P fingerp rints of m aize w ith M GA EGA G、M GAA EGA p rim ers
并非所有的引物增加选择碱基后的组合多态性都变
高, 如M GA EGA 的 E 端增加第3个选择减基后, 有3
个引物组合的扩增谱带的多态性有所降低, 有一个
组合M GA EGA G变高。④在这些试验的引物组合中
M GA EGA G、M GAA EGA和M A GGEGA 多态性较高, 谱带数
较多, 谱带质量较高。前两个引物组合最好如图1,
可作为玉米品种指纹图谱绘制高多态引物。
2. 4　M GAEGAG和M GAAEGA引物组合的多态性检测
利用选择出的多态性高、谱带数目多且质量好
的引物组合M GA EGA G和M GAA EGA , 对随机收集的14
个杂交种及26个自交系的A FL P 指纹进行测定。结
果发现: ①所收集的样品 (14个杂交种和26个自交
系) 相互之间谱带指纹均有差异, 多态性非常强。
在26个自交系间M GA EGA G有101条多态谱带, M GAA
EGA 有81条多态谱带, 在14个杂交种间分别有35条
和40条多态谱带。进一步证明所筛选的引物组合在
玉米品种指纹研究和品种检测上是非常有效的。②
亲本与杂交种之间均可较好地区别, 杂交种的指纹
包含了双亲的所有带型, 即双亲有差异的谱带在
F1代同时表现。
3　讨论与结论
利用A FL P 技术进行进化、种间和种内亲缘关
系等方面的研究时, 绝大多数引物组合多态性较
强, 所以一般不存在引物选择问题。但在作物品种
A FL P 指纹图谱的绘制中, 由于亲缘关系较近, 引
5222期　　　　　　　　　　　　　　张春庆等: 玉米A FL P 指纹图谱的引物选择研究　　　　　　　　　　　　　　　　

物的选择是非常关键的。在玉米A FL P 指纹图谱的
引物选择中发现: ①酶切后两个碱基的比例, 不同
材料之间有一定差异, 但总的变化符合该作物的变
化趋势。②2+ 2引物中有的组合多态性较强, 有的
多态性较差。引物组合中有的两端同时起作用, 有
些引物组合一端对多态性贡献较大, 对多态性贡献
较大的引物组合在一起其多态性较高, 反之多态性
较低。③按照如下方法选择多态性强的引物组合证
明是非常有效的: 第一步选择亲缘关系相近的材料
6～ 12个; 第二步将两端碱基相同的2+ 2引物组合
(16对)全部选择扩增, 以筛选有多态性的2+ 2引物
组合; 第三步有多态性的2+ 2引物重组, 以筛选多
态性较强的2+ 2引物; 第四步将多态性较强的2+ 2
引物一端分别加第3个选择碱基, 筛选多态性高、
谱带质量好的2+ 3或3+ 2引物组合, 作为某种作物
指纹绘制的标准引物组合。这种选择过程较随机筛
选, 目的性强, 选择效率高。
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