全 文 ：Vol. 30 , No. 1
pp. 92～94 　Jan. , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 1 期
2004 年 1 月 　92～94 页
研究
简报 外源 NO 供体对小麦叶片中顺乌头酸酶活性和 H2 O2 含量的影响
张文利　沈文飚 3 　叶茂炳　徐朗莱 Ξ
(南京农业大学生命科学学院 ,江苏南京 210095)
Effects of Exogenous NO Donor on Aconitase Activity and Content of Hydrogen
Peroxide in Wheat ( Triticum aestivum L. ) Leaf
ZHANG Wen2Li , SHEN Wen2Biao 3 , YE Mao2Bing , XU Lang2Lai
( College of Life Sciences , Nanjing Agricultural University , Nanjing 210095 , Jiangsu , China)
　　最近的初步研究表明 ,NO 可能也是一种新的植物生长
调节物质 ,且调节效应部分与 NO 对活性氧 ( reactive oxygen
species ,ROS) 代谢的调控有关 [1～3 ] 。顺乌头酸酶 (aconitase ,
EC4. 2. 1. 3)催化顺乌头酸生成柠檬酸或异柠檬酸的可逆反
应 ,在 NO 信号转导的非 cGMP 途径中 ,顺乌头酸酶也是 NO
的一个重要靶酶 ,其活性可被 NO 和 H2O2 抑制 [4～6 ] ;在动物
中顺乌头酸酶胞浆同工酶被 NO 抑制后即转变成与 mRNA
结合的铁调节蛋白 (iron2regulatory protein , IRP) ,并通过调节
体内铁蛋白 (ferritin)和转铁受体 (transferrin receptor ,TfR) 蛋白
基因的表达来维持体内铁稳态 [5 ,7 ] 。在植物体内的研究也发
现 ,NO 和 H2O2 同样可以抑制烟草叶片中顺乌头酸酶活
性 [5 ] 。最近 ,我们的实验也揭示 NO 供体亚硝基铁氰化钠
[Na2 Fe (CN) 5NO·2H2O ,sodium nitroprusside ,SNP]和 H2O2 对离
体小麦叶片顺乌头酸酶也具有一定的抑制作用 [6 ] 。
迄今为止 ,有关 NO 对植物连体叶片中顺乌头酸酶活性
和 H2O2 含量的影响仍不十分清楚。本文以扬麦 158 为材料
对此进行了研究 ,并结合 NO 和 H2O2 对初步纯化的小麦叶
片中顺乌头酸酶的直接抑制现象 ,探讨了 NO 和 H2O2 这两
种植物信号分子在一定条件下对话 (cross talk) 的可能性 ,从
而为进一步研究植物顺乌头酸酶在植物 NO 信号转导途径
中的作用建立基础。
1 　材料与方法
1. 1 　材料与培养
　　实验材料为小麦品种扬麦 158 ( Triticum aestivum L. cv.
Yangmai 158) ,种子浸种催芽后在实验室内盆钵栽培或大田
栽培 ,生长至三叶一心期和五叶一心期时 ,幼苗植株直接用
于各种实验处理和生化测定。
1. 2 　试剂
NO 供体 SNP和专一性清除剂 carboxy222phenyl24 ,4 ,5 ,52
tetramethylimidazoline (cPTIO) 均为 Sigma 产品 ,过氧化氢酶
(CAT)购自上海生工 ,水杨酸 (SA) 和过氧化氢 (H2O2 ,浓度为
30 %)均为国产分析纯。
1. 3 　体外处理及测定指标
1. 3. 1 　顺乌头酸酶活性测定和初步纯化 　参照前文 [6 ] 方
法。
1. 3. 2 　体外处理 　首先分别用 0. 25 mmolΠL SNP、0. 25 mmolΠ
L H2O2 处理从五叶一心期小麦叶片中初步纯化的的顺乌头
酸酶液 15 min 和 5 min ,然后将处理过的酶液分成两份 ,一份
不处理 ,另一份分别加 0. 5 mmolΠL 的 NO 清除剂 cPTIO 或足
量的 CAT ,接着分别测定顺乌头酸酶活性的变化。
1. 3. 3 　H2O2 含量测定 　参照阮海华 [1 ]等的方法测定。
1. 3. 4 　柠檬酸含量测定 　参照 Ettinger[8 ] 等的方法 ,并稍作
修改。其中称取小麦叶片按 1∶5 ( WΠV) 加入 10 %的三氯乙
酸 (TCA) ,以 12 000 ×g 离心 20 min ,取 4. 00 mL 上清液用于
柠檬酸含量测定。
1. 3. 5 　总可溶性蛋白质含量测定 　按 Bradford[9 ]方法 ,以牛
血清蛋白 (BSA)为标准蛋白。
2 　结果与讨论
2. 1 　自然老化过程中小麦叶片顺乌头酸酶活性和 H2 O2 含
量的变化Ξ作者简介 :张文利 (1970 - ) ,男 ,安徽人 ,硕士 ,从事植物生物化学研究 ,现为中国科学院遗传研究所博士研究生。 3 通讯作者 (Author for
correspondence) :沈文飚。
Received(收稿日期) :2002209223 ,Accepted (接受日期) : 2003201223

选取五叶一心期小麦等量的不同叶位叶片 (其中第一叶
已经开始发黄 ,第二、三、四叶在外观上差异不大) ,测定的结
果显示 ,不同叶位叶中顺乌头酸酶活性随着叶片中内源
H2O2 含量的上升而呈现下降趋势 ,第二叶的内源 H2O2 含量
比第四叶中高近 1 倍 ,而顺乌头酸酶活性的受抑率接近 30 %
(图 1) 。在叶片的自然衰老过程中 ,随着活性氧的产生和清
除能力平衡的破坏 ,H2O2的生成量开始超过被清除量 ,结果
H2O2 含量增加 ,而 H2O2 本身是有较强的氧化能力的 ,所以
它可使小麦离体 [6 ]和连体叶片中的顺乌头酸酶氧化失活。
图 1 不同叶位叶中的顺乌头酸酶活性与
内源 H2O2 含量的关系
Fig. 1 Relationship between the activities of aconitase and the
endogenous H2O2 content in different leave positions
Ⅰ:第一叶 , Ⅱ:第二叶 , Ⅲ:第三叶 , Ⅳ:第四叶 , Ⅴ:第五叶
Ⅰ:the first leave , Ⅱ:the second leave , Ⅲ:the third leave ,
Ⅳ:the fourth leave , Ⅴ:the fifth leave
2. 2 　SNP对小麦叶片中顺乌头酸酶活性、柠檬酸与 H2 O2 含
量的影响
2. 2. 1 　SNP对小麦叶片顺乌头酸酶活性和柠檬酸含量的影
响
分别用不同浓度 SNP喷施三叶一心期的小麦叶片后 ,顺
乌头酸酶活性也呈现时间和浓度依赖性的受抑制 ,与我们以
前离体叶片处理的结果相似 [6 ] 。以处理 2 d 和 4 d 的结果为
例 (图 2A) ,1 mmolΠL SNP 处理 2 d 的顺乌头酸酶活性降低
12 % ,处理 4 d 的丧失 17 % ;而 0. 5 mmolΠL SNP处理 2 d 仅抑
制 5 % ,4 d 的抑制 14 %。同时 ,内源柠檬酸含量也呈现不同
程度积累的趋势。例如 1 mmolΠL SNP处理 2 d 的内源柠檬酸
含量增高约 2. 5 倍 ,4 d 的是 1. 4 倍 ;0. 5 mmolΠL SNP处理 2 d
的内源柠檬酸含量上升 1. 3 倍 ,4 d 的是 1. 2 倍 (图 2B) 。显
示 ,小麦叶片中内源柠檬酸含量随着顺乌头酸酶活性的下降
而升高。
2. 2. 2 　SNP 对小麦叶片中内源 H2O2 含量的影响
SNP抑制小麦叶片中顺乌头酸酶活性的同时 ,还可诱导
三叶一心期小麦叶片中内源 H2O2 的累积。图 3 显示 0. 5
mmolΠL SNP处理 2 d 的内源 H2O2 含量上升 11 % ,4 d 的内源
H2O2 的累积量增高 0. 4 倍 ;1 mmolΠL SNP 处理 6 d 的叶片中
H2O2 含量上升 50 % ,第 8 天的上升近 1 倍。这可能与外源
NO 对植物叶片 CAT和抗坏血酸过氧化物酶 (ascorbate peroxi2
dase , APX)的抑制 [10 ]而使内源 H2O2 积累有关。图 1 的结果
表明 ,小麦叶片在自然老化过程中随着内源 H2O2 含量的上
升 ,内源顺乌头酸酶活性也呈现下降趋势 ,而我们前文的结
果也显示离体小麦叶片中的顺乌头酸酶对外源 H2O2 也很敏
感 [6 ] ,暗示 SNP产生的 NO 除直接作用于连体小麦植株叶片
中顺乌头酸酶外 ,也不排除可能通过诱导内源性 H2O2 积累
而间接对顺乌头酸酶活性发生抑制作用。
2. 3 　NO 和 H2 O2 对初步纯化的小麦叶片中顺乌头酸酶活
性的影响
SNP是一种常用的 NO 供体 ,NO -2 是其代谢产物之一。
研究发现 ,0. 25 mmolΠL 的 SNP 处理初步纯化的顺乌头酸酶
液 15 min 时 ,顺乌头酸酶活性受抑约 10 % ,以后未加 cPTIO
的顺乌头酸酶活性随着 SNP处理时间的延长而逐渐降低 ,其
中处理 60 min 的活性被抑制近 25 % ,而加入 cPTIO 的基本维
持在对照的 90 %左右 (图 4A) 。同样 ,0. 25 mmolΠL H2O2 处理
5 min 略微抑制处理初步纯化的顺乌头酸酶液 ,进一步加入
足量的 CAT以清除酶液中的 H2O2 ,发现顺乌头酸酶活性基
本保持不变 ,不加 CAT 的顺乌头酸酶活性受抑程度逐渐增
加 (图 4B) 。这些表明 ,具有氧化性的 NO 和 H2O2 对小麦叶
图 2 SNP对小麦叶片中顺乌头酸酶活性和柠檬酸含量的影响
Fig. 2 Effects on SNP treatments on the activities of aconitase ( A) and levels of the endogenous citric acid ( B) in wheat leaves
Aconitase activity in the control was 12. 3 (ΔA240·mg - 1 protein·min - 1)
39　1 期 张文利等 :外源 NO 供体对小麦叶片中顺乌头酸酶活性和 H2O2 含量的影响 　　　

片初步纯化的顺乌头酸酶活性的抑制可能是直接的 ,NO 对
连体小麦叶片中顺乌头酸酶活性的抑制 (图 2A) 也可能是这
样的 ,且不是 NO -2 或 SNP本身影响之果。
在植物体内 ,NO 和 H2O2 这二种信号分子之间在一定条
件下可以对话 ,最终形成级联信号网络 ,使各自的信号途径
得已放大 [11 ] 。NO 除作为信号物质参与植物抗病外 ,对盐胁
迫引起的植物伤害和正常的生长发育也具有明显的调节作
用 [1～3 ] ,而顺乌头酸酶除作为 NO 等氧化还原物质的靶酶介
导其在植物体内的信号作用外 (图 2A 和 4) ,还可导致细胞内
柠檬酸浓度的升高 (图 2B) 。
图 3 SNP对连体小麦叶片内源性 H2O2 含量的影响
Fig. 3 Effects of SNP on endogenous hydrogen
peroxide content in wheat leaves
图 4 NO 和 H2O2 对初步纯化的小麦叶片中顺乌头酸酶活性的影响
Fig. 4 Effects of NO( A) and H2O2( B) on the activities of partially purified aconitase , which were treated with
SNP and H2O2 combined with cPTIO( A) and CAT( B) respectively
Aconitase activity of the control was 18. 3 (ΔA240 mg - 1 protein min - 1)
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