全 文 ：卤代酶与生物卤化反应进展 ?
耿召良1 ,2 ,3 , 王浩鑫1 , 赵沛基1 , 郝小江1 , 曾 英1
??
(1 中国科学院昆明植物研究所 植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室 , 云南 昆明 650204;
2 中国科学院研究生院 , 北京 100049; 3 贵州省烟草科学研究所 , 贵州 贵阳 550003)
摘要 : 卤化物在生物圈内广泛存在 , 许多天然卤化物广泛应用在药理学领域。根据催化机理 , 催化形成
C-X 键的卤代酶 ( halogenases) 主要分为两大类型 : 卤代过氧化物酶 ( haloperoxidases) 和黄素依赖型卤代酶
( flavin-dependent halogenases) , 另外还有非血红素 Fe (Ⅱ )?α-酮戊二酸盐依赖型卤代酶 ( non-heme FeII?α-keto-
glutarate ( aKG)-dependent halogenases)、甲基卤代转移酶 (methyl halidetransferases) 和氟化酶 (fluorinases) 等。
本文综述了目前已知的卤代酶的发现、分子作用机制和生物催化潜力。近年来 , 卤代酶在生物卤化过程中
的重要生物学功能已经引起了广泛关注。利用组合生物合成、定向进化等现代生物技术合成有价值的天然
卤代衍生物将有广阔的应用前景。
关键词 : 卤代酶 ; 生物卤化 ; 卤化物
中图分类号 : Q 55 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2009) 03 - 269 - 10
Research Development on Halogenases and
Biological Halogenation
GENG Zhao-Liang
1 , 2 , 3
, WANG Hao-Xin
1
, ZHAO Pei-Ji
1
, HAO Xiao-Jiang
1
, ZENG Ying
1 * *
(1 State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China, Kunming Institute of Botany, Chinese
Academy of Sciences, Kunming 650204 , China; 2 GraduateUniversity of Chinese Academy of Sciences,
Beijing 100049 , China; 3 Tobacco Research Instituteof Guizhou, Guiyang 550003 , China)
Abstract: Halogenatedmolecules are widely distributed in the biospherewith a variety of uses in pharmacology . Haloge-
nating enzymes have been identified for the biosynthesis of halogenated compounds by catalyzing the formation of carbon-
halogen bond . According to their different reaction mechanisms, halogenating enzymes are divided into two main groups,
haloperoxidases and flavin-dependent halogenases . In addition, other halogenases including non-heme FeII?α-ketoglutarate
(αKG)-dependent halogenases, methyl halide transferases and fluorinase were recently discovered . This review concen-
trates on the occurrence, mechanism and biocatalytic potential of the halogenating enzymes that are currently known . The
biological importance of halogenatingenzymes in biohalogenation has arousedwideconcern . Meanwhile, usingmodern bio-
technology, for example, combinatorial biosynthesis and directed evolution, the prospects for generatinghalogenated deriv-
atives of valuable natural productswould therefore appear very bright .
Key words: Halogenase; Biological halogenation; Halogen compound
1896 年 , Drechsel ( 1896 ) 从海洋菌株中分
离得到了第一个含卤素的天然产物 3 , 5-二碘酪
氨酸 ( 3 , 5-diiodotyrosin)。但人们一直认为卤化
天然产物在自然界中含量稀少 , 其大量发现是在
近十余年才开展起来的。据统计 , 人们已经从细
菌、真菌、海洋生物、植物、昆虫和哺乳动物等
云 南 植 物 研 究 2009 , 31 (3) : 269～278
Acta Botanica Yunnanica DOI : 10 .3724?SP. J . 1143 .2009.08218
?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : biochem@ mail . kib. ac. cn
收稿日期 : 2008 - 12 - 04 , 2009 - 04 - 02 接受发表
作者简介 : 耿召良 (1978 - ) 男 , 博士研究生 , 主要从事微生物次生代谢研究。E-mail: ZhaoliangGeng@mail . kib. ac. cn ?
基金项目 : 国家自然科学基金重点项目 ( 30430020)
生物体内分离得到 4 500 余种具有广泛结构多样
性的卤化天然产物 (Gribble, 2004) , 其中氯化和
溴化天然产物占大部分。从分布上看 , 溴化物主
要由海洋生物产生 , 大量氯化物多在陆生生物中
发现 ( Zhang等 , 1994; Carter-Franklin and Butler,
2004)。氯化和溴化天然产物相对丰富 , 可能是
因为这两种卤素原子在陆地和海洋代谢有机体微
环境中的含量相对较丰富。
由于天然卤化物在生理和生物化学上具有重
要作用 , 其在药理学上有广泛地应用 , 如氯化物
类的万古霉素 ( vancomycin) , 金霉素 ( chlorotet-
racycline) , 氯霉素 ( chloramphenicol ) , 蝴蝶霉素
( rebeccamycin) , 刺孢霉素 (calicheamycin) 和 am-
bigol A 等 , 可以作为抗生素或抗肿瘤、抗 HIV 药
物等。海洋特殊的生境是许多特异、新颖的生物
活性物质的丰富来源 , 其中很大一部分为有机溴
化物 , 抗真菌抗生素硝吡咯菌素 ( pyrolnitrin) 是
其中的代表化合物 ( Burkholder 等 , 1966 )。在碘
化天然产物中 , 以土壤放线菌产生的抗肿瘤抗生
素 calicheamicin和哺乳动物合成的甲状腺素 ( tet-
raiodothyronine, T4 ) 为人们所知 ( Bergman, 1973;
Fukuzawa and Kurosawa, 1979) 。氯化物 4-chloroin-
dolyl-3-acetic acid和 thienodolin等还可以作为植物
生长调节剂 (Marumo等 , 1968; Kanbe等 , 1993)。
总之 , 有机卤化物已经广泛应用于医药、杀菌
剂、激素、信号分子及有机合成等各个领域。
自然界中存在卤化天然产物 , 揭示了必然存
在可以催化形成 C-X 键的酶。随着人们对卤化
天然产物分离、鉴定和生物合成途径的研究不断
深入 , 更多的甚至是新类型的卤代酶不断被发
现 , 其参与的生物卤化反应机理逐渐被揭示 , 同
时 , 早期的一些错误观点也逐渐被更正。目前 ,
卤代酶主要分为两大类型 : 卤代过氧 化物酶
( haloperoxidases) 和黄素依赖型卤代酶 (flavin-de-
pendent halogenases) , 另外还有非血红素 FeI I?α-酮
戊二酸盐依赖型卤代酶 ( non-heme FeII?a-ketoglut-
arate ( aKG )-dependent halogenases)、甲基卤代转
移酶 (methyl halide transferases) 和氟化酶 (fluori-
nases) 等。虽然人们已经发现了许多卤代酶 , 但
有证据显示自然界中还有其他类型的卤代酶和反
应机理尚未被发现。本文就目前发现的主要卤代
酶及反应机理和生物催化潜力进行综述。
1 卤代酶
人们在 1959 年发现了第一个卤代酶 - 氯代
过氧化物酶 ( chloroperoxidases, CPO) ( Shaw and
Hager, 1961) 。研究早期 , 普遍认为卤代过氧化
物酶是催化生物卤代反应的主要酶类 , 但现阶段
研究表明 , 黄素依赖型卤代酶才是参与卤代反应
的主要卤代酶类 , 因此近代对卤代酶的研究也主
要集中在后者上。另外 , 有许多证据表明黄素依
赖型卤代酶基因在很多 NRPS ( nonribosomal pep-
tide synthetases) 和 PKS ( polyketide synthases) 基
因簇中被发现 (Dorrestein 等 , 2005) , 在许多抗
生素生物合成过程中扮演了后修饰酶的角色。
1 .1 卤代过氧化物酶
人们在研究卡尔里霉素 (caldariomycin) 的生
物合成途径时 , 在 Caldariomyces fumago的细胞提取
物里首次发现了将单氯双甲酮催化为双氯双甲酮的
氯代过氧化物酶 , 并且该反应可以通过分光光度法
加以检测 (Morris and Hager, 1966)。该方法可以不
必确定底物而对酶活性进行研究 , 这种便利性导致
了更多卤代过氧化物酶的发现。其中 , 氯代过氧化
物酶研究最深入 , 可以催化碘、溴和氯元素的卤
化; 溴代过氧化物酶 ( bromoperoxidase) 可以催化
碘、溴元素的卤化; 而碘代过氧化物酶 ( iodoper-
oxidase) 只能催化碘元素的卤化反应 (Morrison
and Schonbaum, 1976) 。氟原子不可能被过氧化氢
氧化 , 所以上述的卤代过氧化物酶不能在含氟代
谢产物生物合成中应用。目前 , 根据辅因子不
同 , 可以将卤代过氧化物酶分为 3 类 : 亚铁血红
素依赖型 , 金属依赖型和无辅因子过氧化氢酶。
1 .1 .1 含亚铁血红素卤代过氧化物酶 含亚
铁血红素的卤代过氧化物酶 ( heme-containing hal-
operoxidases) 可以催化 P450 类型的反应。在早
期 , 研究者用标记的氯化物对 Caldariomyces fum-
ago菌丝体处理获得的可溶性提取物检测到了其
氯化活性。实际上该酶是由两个酶组成 , 其中一
个是葡糖氧化酶 , 以生产另一个酶 , 即氯过氧化
物酶所需要的过氧化氢 , 以完成其对卡尔里霉素
生物合成中间体的氯代作用 (Shaw 等 , 1959 )。
进一步对该酶进行纯化和晶体衍射的研究表明 ,
该酶是一个以原卟啉 IX 为辅基 , 分子量达 42 kD
的单体、胞外血红素糖基化酶 ( Morris and Hag-
er, 1966 ) 。从 Pseudomonas aureofaciens 分离到的
072 云 南 植 物 研 究 31 卷
该类酶 , 如辣根过氧化物酶 ( horseradish peroxi-
dase, HRP)、溴过氧化物酶等 , 其分子量范围为
40～160 kD, 为单酶或异源三聚体不等。
对该酶三维结构的研究表明 , 反应中该酶被
过氧化物氧化 , 形成一个中间反应物Ⅰ , 由该中
间反应物Ⅰ对环境中的卤素离子进行氧化 , 形成
另一个瞬时中间产物Ⅱ , 由于中间产物Ⅱ在低
pH值环境下不稳定 , 导致其分解形成次卤酸
(HOX ; X = Cl - , Br- , 或 I - ) , 由次卤酸作为卤
化反应中真正的卤化剂 ( Lambeir and Dunford,
1983) 。如图 1 所示 , 只有酶反应底物能到达酶
活性位点并恰好与其结合 , 并按照酶催化反应的
程序被卤化 , 而其他底物则由自由次卤酸以非酶
催化的形式进行卤化或氧化。根据该机理 , 形成
的次卤酸能够对其他底物进行非酶催化形式的卤
化或氧化 , 这是该类酶催化的卤化反应之所以缺
乏底物专一性和区域选择性的主要原因。
1 .1 .2 含钒卤代过氧化物酶 Vilter ( 1983 )
首先在褐藻 Ascophyllumnodosum溴代过氧化物酶
研究中发现钒是其必需成份 , Almeida等 (2001)
又分别在红藻、绿藻、地衣和真菌中分离得到了
此类含钒的卤代过氧化物酶 ( vanadium-containing
haloperoxidases) 。从陆生真菌 Curvularia inaequalis
中分离到的含钒氯代过氧化物酶的 X 射线晶体
图 1 Caldariomyces fumago中的含亚铁血红素氯代过氧化物酶推定的反应机理 (参考 Sundaramoorthy 等 , 1998)
注 : 卟啉环未显示 ;“Fe”为亚铁血红素铁
Fig . 1 Proposed reaction mechanism of the heme-containing chloroperoxidase from Caldariomyces fumago
“Fe”is the heme ion; the porphyrin ring system is not shown . ( Sundaramoorthy et al. , 1998)
1723 期 耿召良等 : 卤代酶与生物卤化反应进展
结构第一次对该类酶的钒结合元件及酶活性位点
进行了阐述 (Messerschmidt and Wever, 1996)。该
催化结构域含约 150 个氨基酸 , 其中包括与金属
配位的 His残基 , 同时为了结构稳定的需要 , 还
有数个氨基酸的氢键和钒酸盐的氧原子相连。在
褐藻 ( A. nodosum) ( Weyand 等 , 1999 ) 和 红 藻
( Corallina officinalis) ( Isupov 等 , 2000 ) 中分离的
此类酶的结构已经得到确认。这 3 种卤代过氧化
物酶的同源性很低 , 但在 C 端的金属离子结合位
点和活性中心呈现了高度同源性。
研究者对含钒氯代过氧化物酶反应的分子机
理进行了推测 ( 图 2 ) ( van Pee and Unversucht,
2003; Raugei and Carloni , 2006)。不同质子化状态
的研究表明 , 该酶含有一个部分钒酸盐阴离子
H2 VO4
-
, 一个羟基位于其轴线上 , 过氧化氢攻击
该羟基 , 形成过氧化氢中间体 , 该中间体迅速被
质子化形成一个过氧复合物-HVO2 ( O2 ) , 然后
卤离子和该复合物发生反应 , 产生次卤化钒酸
盐 , 和亚铁血红素卤代过氧化物酶类似 , 形成的
次卤酸作为真正的卤化剂导致了非酶卤化作用 ,
同样导致了该卤代反应缺乏底物专一性和区域选
择性 ( Isupov等 , 2000; Raugei and Carloni , 2006)。
1 .1 .3 过氧化氢酶 早期的研究者从细菌中
分离到一种卤代酶 , 该酶在有过氧化氢存在时可
以表现“卤代过氧化物酶活性”, 但却并非传统
意义上真正的过氧化物酶。研究表明 , 它们没有
血红素辅基 , 也不含任何金属离子 , 应该被归类
于过氧化氢酶 ( perhydrolases)。其一级结构与水
解酶和酯酶有较高的相似性 ( Ozaki 等 , 1995 ) ,
基本都是由分子量为 31 kD 的相同亚单位组成 ,
自然状态下为二聚体或三聚体不等。
在醋酸缓冲液中加入过氧化氢的反应条件下 ,
这类卤代酶能够使单氯双甲酮发生溴代反应
(Picard等 , 1997) , 同时对该类酶进行三维结构研究
的结果揭示 , 它们有一个由 Ser、His和 Asp残基组
成的催化三元体 (Hecht 等 , 1994)。因此 , 推测该
反应机理应该是酶活性位点的 Ser残基和醋酸形成
酯键 , 该酯被过氧化氢氧化形成过氧化乙酸 , 再由
过氧化乙酸氧化卤素离子 , 形成作为真正卤化剂的
次卤酸 , 因此同样没有底物特异性和区域选择性。
该类过氧化氢酶最初被归于卤代过氧化物
酶。但根据酶三维结构及反应机理的研究结果 ,
图 2 推定的含钒卤代过氧化物酶的反应机理 ( 参考 van Pee and Unversucht, 2003; Raugei and Carloni, 2006 )
Fig . 2 Proposed reaction mechanism of thevanadium-containing haloperoxidases (van Pee and Unversucht, 2003; Raugei and Carloni, 2006 )
272 云 南 植 物 研 究 31 卷
现在已经公认它们实际上并没有直接参与卤化物
的生物合成过程 , 其作用方式和过氧化氢酶类
似 , 同时 , 因其含有和α?β水解酶一样的催化三
元体 , 目前将其归类于水解酶家族。
1 .2 黄素依赖型卤代酶
直到 1995 年 , 人们一直广泛认同“卤代过
氧化物酶是催化生物卤代反应的主要卤代酶类”
这一观点。然而 , 随着更多复杂的卤化天然产物
陆续被发现 , 揭示仅仅依靠卤代过氧化物酶显然
是不够的。随着金霉素生物合成基因簇的克隆
(Dairi 等 , 1995) 及随后硝吡咯菌素生物合成途
径被阐明以后 , 一种新类型的卤代酶 - 黄素依赖
型卤代酶 (flavin adeninedinucleotide (FAD )-depen-
dent halogenase) 被发现了 (Hammer等 , 1997)。
Hammer 等 ( 1997 ) 从产生抗真菌化合物硝
吡咯菌素的 Pseudomonas fluorescens中鉴定了两个
相关基因 prnA 和 prnC, 它们分别编码两个对应
的卤代酶 , 其中 PrnA 为色氨酸-7-卤代酶 (Trp-7-
halogenase) , 负责催化色氨酸的碳 7 位发生区域
选择性的氯化作用 ; PrnC 为单去氯氨基硝吡咯
菌素卤代酶 ( monodechloroaminopyrrolnitrin haloge-
nases)。进一步的研究表明 , 另一种被鉴定为黄
素还原酶 ( flavin oxidoreductase) 的蛋白也是必须
的 , 黄素作为 NADH 和 O2 的电子载体 , 可以催
化产生卤代反应实际需要的 FADH2 (van Pee and
Patallo, 2006) , 因此该类酶也被称为 FADH2 依赖
性卤代酶 ( FADH2 -dependent halogenases) 。虽然
在许多重要活性物质 , 尤其是在许多抗生素的生
物合成基因簇中发现了许多该类卤代酶基因 , 但
目前研究者只对其中的少数进行了体外表达的活
性研究 ( 表 1 )。其中 , 最近进行的 hrmQ 的体外
表达及活性检测研究较令人感兴趣 ( Heide等 ,
2008)。 hrmQ是在产生具有抗菌作用的细胞间信
号物质多肽内酯 Hormaomycin的菌株 Streptomyces
griseoflavus W-384 中发现的 , 作者将该基因在产生
具有抑制 DNA 促旋酶活性的抗生素 clorobiocin 的
Streptomyces roseochromogenes var. oscitans DS12.976 的
突变菌株中进行了异源表达和活性检测 , 结果发
现了两个新的 clorobiocin同系物 , 同时表明 HrmQ
的底物可能是一种吡咯-2-羧基-S - ( 酰基转运蛋
白 ) 硫酯 , 这可能是首次用组合生物合成技术使
卤代酶作用于由酰基转运蛋白连接的底物。
在一级结构上 , FADH2 依赖型卤代酶和卤代
过氧化物酶几乎没有相似性。研究表明 , 这类酶
有两个保守区 , 一个位于序列 N 端 , 为 FADH2
的结合位点 ( GXGXXG ) ; 另一个在序 列中间
(GWTWXIP ) , 包含 两个 色氨 酸残 基 ( Hammer
等 , 1999) , 据推测该序列一级结构的相似性与
酶反应底物的专一性有关。根据底物的不同 ,
FADH2 依赖型卤代酶至少可以分为两个亚类 , 第
一亚类底物为吲哚或色氨酸衍生物 , 第二亚类底
物为苯环或吡咯衍生物。值得一提的是 , 生产
FADH2 依赖型卤代酶菌株中的黄素还原酶可以被
其它黄素还原酶 , 如从大肠杆菌中分离到的核糖
核苷酸复合物 ( ribonucleotide reductase complex,
Fre) 等替代 (Keller等 , 2000)。这揭示了黄素还
原酶和卤代酶双组分系统之间并非是专一性的。
一般来说 , 二者之间的氨基酸序列同源性不高 ,
即 使 是 在 卤 代 酶 氨 基 末 端 的 绝 对 保 守 区
(GXGXXG) 也仅在少数黄素还原酶中出现。
虽然从一些抗生素的生物合成途径中已经获
知了很多信息 , 但人们对该类酶反应机理的研究
却一直不尽如人意。最近 , PrnA 等蛋白晶体结
构的相继被揭示 , 为研究 FADH2 依赖型卤代酶
表 1 体外表达研究的 FADH2 依赖型卤代酶
Table 1 Halogenating activity in vitro of the FADH2 -dependent halogenases
卤化物
Halogen compound
FADH2 H依赖型卤代酶
FADH2 -dependent halogenase
表达菌株
Expression strain
参考文献
Reference
pyrrolnitrin PrnA、PrnC Pseudomonas fluorescens Bl915 ,Hammer 等 , 1997 ?
clorobiocin HrmQ Streptomyces roseochromogenes var S. oscitans DS12 ?.976 Heide等 , 2008 I
pyoluteorin PltA Pseudomonas fluorescens Pf-5 ?Nowak-Thompson 等 , 1999
pentachloropseudilin HalB Actinoplanes sp . ATCC 33002 ?Wynands and van Pee, 2004
rebeccamycin RebH Lechevalieria aerocolonigenes Yeh 等 , 2005 ?
pyrroindomycin PyrH Streptomyces rugosporus Zehner 等 , 2005 f
thienodolin Thal Streptomyces albogriseolus Seibold 等 , 2006 s
3723 期 耿召良等 : 卤代酶与生物卤化反应进展
的反应机理带来了新的曙光 (Dong等 , 2005; van
Pee and Patallo, 2006) 。PrnA 蛋白的晶体结构显
示 , 该酶是一个二聚体 , 每个单体都是一个独立
的结构域 , 单体形状类似于一个其中一面粘着一
个“金字塔”的“盒子”, 其中“盒子”为 FAD
结合位点模块 ( FAD binding module) , FAD 结合
于其中的一个凹槽中 , 由两个β-折叠片控制 , 结
构上和单加氧酶———p-羟基苯甲酸酯羟化酶 ( p-
hydroxybenzoate hydroxylase, PHBH) 较类似 ; Cl -
结合口袋 ( Cl - binding pocket) 位于 FAD 异咯嗪
环的 一 面上 , Cl - 位于 口 袋 内 , 并和 苏 氨 酸
(T348) 和甘氨酸 (G349) 残基的氨基氮原子相
连。底物 Trp ( 或产物 7-chlorotryptophan) 以氢键
或盐键的形式和“金字塔”上的氨基酸残基相
连 , 该区域为底物结合位点模块 (substrate bind-
ingmodule)。FAD和 Cl - 被限制于酶的同一位置 ,
但和底物结合位点的距离超过了 10?, 这对于
Cl
- 和底物接合的距离显然太长了。
根据 PrnA 的晶体结构 , 不少研究者提出了
该类卤代酶反应的分子机理 , 代表学者是 van
Pe′e、Walsh 和 Naismith ( Keller 等 , 2000; Dong
等 , 2005; Dorrestein等 , 2005; Yeh等 , 2005) , 但
最近由 RebH 蛋白的结构和反应动力学获得的研
究结果对由 PrnA 暗示的反应机理提出了挑战
(Yeh等 , 2007) 。其中 , 前两者的理论未解决上
述 PrnA 晶体结构中氯离子和底物结合位点之间
10?距离的问题。根据 Naismith 推定的反应机
理 , PrnA 晶体结构中的 FAD 和底物 Trp 之间有
一个通道 , 该通道终止于 Trp 的碳 7 位。反应中
首先是 FAD 和 NADH 产生 FADH2 , FADH2 和 O2
反应形成关键中间产物———氢过氧基黄素中间体
(FAD-OOH) , 位于 FAD 异咯嗪环上的氯离子对
FAD-OOH 发动亲核 攻击 , 形成 羟基化 FAD 和
HOCl , HOCl 沿着上述通道移动 10?的距离接近底
物 Trp, 并对 Trp 的碳 7 位发动亲核攻击 , 形成
Wheland中间体 , 随后发生去质子化形成最终产物
7-chlorotryptophan (图 3)。据推测 , 由保守的 FAD
结合位点形成 HOCl 并参与卤代反应 , 这在所有的
FADH2 依赖型卤代酶反应中均存在。需要指出的
是 , 溶液中自由存在的 HOCl 并不能使 Trp 发生氯
代反应 ( Dong 等 , 2005; Yeh 等 , 2005 ) , 同时 ,
PrnA 结构中的两个重要氨基酸 K79 和 E346 通过
氢键等方式对 HOCl 进行空间控制和相互作用 ,
这是反应中对底物区域选择性卤化的基础。
图 3 色氨酸-7-卤代酶 ( PrnA ) 推定的反应机理 (参考 Dong等 , 2005 ; Yeh 等 , 2005)
Fig . 3 Proposed reaction mechanism of the tryptophan 7-halogenase ( PrnA ) ( Dong et al. , 2005 ; Yeh et al., 2005)
472 云 南 植 物 研 究 31 卷
根据上述机理 , F - 也可以参与类似的卤代
反应 , 但迄今为止没有 Trp等底物被氟化或碘化
的报道。这暗示该类酶不仅表现出了底物专一
性 , 对卤离子也表现了一定的选择性 , 这可能是
因为卤离子的大小或亲核性质强弱的不同所致。
PrnA 除了其天然底物 Trp以外 , 还接受许多吲哚
和苯基吡咯衍生物 , 只是在以色氨酸为底物时 ,
该类酶表现的区域选择性较严格 , 一般对 C-7 位
卤化 , 但最近也有研究者发现合成 pyrroindomycin
B 的卤代酶可以催化生成 5-氯色氨酸产物 ( Zeh-
ner等 , 2005 )。当该类酶与其它底物进行反应
时 , 则对底物的区域选择性不太严格 , 可以在吲
哚或 Trp衍生物的 2 , 3 位进行氯化 (H?lzer 等 ,
2001)。
蓝细菌 Microcystis菌株具有产生多种氯化肽
系列产物的能力 , 是近年研究的一个热点。最近
的研究 表明 ( Cadel-Six 等 , 2008; Frangeul 等 ,
2008) , 催化这些氯化反应的酶和 FAD 依赖型卤
代酶的同源性较高 , 而这些特有的卤代酶基因是
和两个特定的 NRPS 基因簇 ( 分别产生 aerugi-
nosins和 cyanopeptolins 系列产物 ) 紧密相关的 ,
并且正是由于卤代酶基因的缺失或者功能失调造
成了菌株中后续的一系列非氯化肽同系物的产
生 , 而氯化肽同系物的产生与此相反。研究者对
其中一些卤代酶的系统演化进行了研究 , 推测蓝
细菌中这些普遍的卤代酶基因在系统发生上来自
进化中的水平基因转移 , 随后这些基因在蓝细菌
细胞体系中进行复制 , 推测可能是靠这些重复基
因的缺失来调配卤代酶基因在两个 NRPS 基因簇
之间的分配 , 从而解释了蓝细菌 Microcystis菌株
中无规则地产生氯化或非氯化同系物的原因。
1 .3 非血红素 FeIIα-酮戊二酸盐依赖型卤代酶
根据某些卤代天然产物生物合成基因簇的测
序结果 , 在推定的读码框中并没有发现任何卤代
过氧化物酶或 FADH2 依赖型卤代酶的基因 , 这
暗示可能有新类型卤代酶存在。例如 , 在对丁香
霉素 E ( syringomycin E ) ( Grgurina and Mariotti ,
1999) 和抗肿瘤活性物质 barbamide (Sitachitta等 ,
1998) 生物合成研究时 , 同位素标记研究显示前
者的合成源于 Thr, 后者源于 Leu, 将二者的生
物合成基因簇和 FADH2 依赖型卤代酶基因相比
较并没有发现相似性 , 且从合成机理上分析 ,
barbamide的 3 个氯原子可能是通过自由基机制
结合的。barbamide合成基因簇中推定的负责氯
化反应的 BarB1?BarB2 和丁香霉素 E 合成基因簇
的 SyrB2 相似 , 这些蛋白同属于一类新的非血红
素 FeII?α-酮戊二酸盐依赖型卤代酶 ( non-heme
Fe
I I?α-ketoglutarate (αKG )-dependent halogenases)。
该类卤代酶在许多非 核糖体肽 ( non-ribosomal
peptide) 起源的化合物生物合成途径中较常见
( Blasiak等 , 2006; Galonic等 , 2006 , 2007)。
研究者证实了 SyrB2 对应的卤代活性 , 并揭
示了该蛋白的晶体结构 ( Blasiak 等 , 2006)。根据
其三维结构推断 , 该类酶反应的初期首先形成一
个 ClFeIV -oxo的中间体 , 该中间体从底物中提取一
个氢原子而使底物激发产生底物自由基 (substrate
radical) , 同时产生 ClFeII I -OH复合体 , 底物的氯化
是由氯的自由基 (chloride radical )“回弹”所推进
的 (Galonic等 , 2007; Krebs等 , 2007)。
值得一提的是 , barbamide合成基因簇是一
个 PKS-NRPS 杂 合系 统 , 即同 时具 有 PKS 和
NRPS 两种酶系 , 因此其活性产物也是 PKS-NRPS
的杂合系统产物 ( Chang等 , 2002 )。该类型卤代
酶也参与了植物毒素冠毒素 (coronatine) 的生物
合成 (Vaillancourt 等 , 2005)。
1 .4 甲基卤代转移酶
负责合成甲基卤化物的一种特殊类型的酶被
称为甲基卤代转移酶 (methyl halide transferases) ,
但严格来说它们实际上不是“卤化”酶 , 而是
“甲基化”酶。研究者通过对细胞提取液的研究
鉴定了该种甲基转移酶 , 它们可以使 S-腺苷甲
硫氨酸 (SAM) 转移一个甲基到氯离子、溴离子
和碘离子上。目前 , 在真菌和海藻中均已发现了
该类酶。
Svendsen (1994) 从细菌 CC495 中还分离出
一种二硫化物?甲基卤代转移酶。该酶以卤代甲
烷作为唯一碳源和能量来源 , 通过类咕啉连接一
个钴原子 , 以卤代甲烷作为甲基供体 , 以卤离子
作为甲基受体 , 因而具有转移卤原子的活性。甲
基卤代转移酶还参与了刺革菌科真菌 ( hym-
enochaetaceae) 甲基氯 化物的形成 ( Harper and
Kennedy, 1988)。另外 , 甲基氯化物还可以在苹
果木层孔菌 Phellinuspomaceus的苯甲酸甲基酯生
物合成及苯酚和丁酸盐甲基化反应中作为一种甲
5723 期 耿召良等 : 卤代酶与生物卤化反应进展
基供体 (McNally and Haper, 1991)。
1 .5 氟化酶
相比其他卤素 , 氟元素在地壳中含量最丰
富 , 但由于其多以矿物质形式存在而不能为生物
体所用。因此 , 氟化天然产物种类稀少就不足为
奇了。尽管推定的 FADH2 依赖型卤代酶的反应
机理似乎允许氟代反应的发生 , 但关于支持氟化
酶 ( fluorinase) 催化氟代反应的证据并不多。目
前所知的少量氟化天然产物 , 是由一些高等植物
和链霉菌所产生的。
从链霉菌 Streptomyces calvus中分离到的一种
抗生素核杀菌素 ( nucleocidin) 是第一个从微生
物中分离到的有机氟化物。从链霉菌 S. cattleya
中分离到的 5′-Fluoro-5′-deoxyadenosine ( 5′-FDA )
synthase是第一个报道的氟化酶 , 同时研究者发
现该菌株也可以产生氟乙酸盐和 4-氟苏氨酸 , 这
为研究 C-F 键的形成机理提供了便利 ( Sanada
等 , 1986; Schaffrath等 , 2003) 。有意思的是 , nu-
cleocidin的结构和氟乙酸盐并没有相似性 , 似乎
在两种细菌中应该是由不同的氟化酶催化形成
的 , 然而进一步的研究表明 , 合成二者的前体却
很相似。最近通过基因工程手段的研究结果可以
推测 , S. calvus中的核杀菌素和 S. cattleya 中的
氟乙酸盐可能是由相似的反应机理合成的。
2 结语与展望
自然界中的大多数卤化物是通过化学合成的
方式得到的 , 但化学合成的条件要求相对苛刻且
不能精细控制反应过程 , 有可能使很大一部分产
物或副产物危害环境和人类健康。生物体内的卤
代反应则相对温和且可以有程度不一的底物和区
域选择性 , 可以对产物性质进行一定的控制。因
此 , 研究生物卤化反应的途径 , 尤其是 C-X 键
形成的酶学反应机制 , 可能会提供一种便利的合
成卤化有机物的新方法。在过去的几年中 , 人们
对卤代酶的发现和生物卤化反应机理的理解已经
取得了相当大的进步。
目前 , 人们已经发现并研究了许多卤代酶 ,
但遗憾的是对该类酶参与卤代反应的机理却仍然
不甚明了 , 其中体外测量酶活性的主要障碍是对
催化底物结构知识的了解不够。尽管如此 , 近年
来人们已经开始了卤代酶在生物技术方面的应用
研究。利用定向进化技术 ( directed evolution) 通
过区域选择性地作用底物 , 以控制生产系列目标
产物的理论在氯代过氧化物酶中得到了验证
( Rai 等 , 2001 ) 。另 外 , 利 用 组 合 生 物 合 成
(combinatorial biosynthesis) 等手段可以构建一些
生产强生物活性卤代天然产物或其衍生物的生物
突变体 , 这对于有医疗意义的抗生素生产有很大
意义。
现代生物技术的迅猛发展 , 如宏基因组技术
(metagenome)、功能或序列驱动的高通量筛选技
术、定向进化技术等 , 为卤代酶基因的发现、功
能确定及定向结构改造提供了极大便利。最近 ,
也有研究者以遗传算法 ( genetic algorithm, GA )
对优化卤代酶活性进行了有益探索 ( Muffler 等 ,
2007) 。耿召良等 (2009 ) 及 Wang等 ( 2008 ) 采
用 FADH2 依赖型卤代酶的保守区序列设计引物 ,
通过 PCR、亚克隆等方法对其研究组构建的首个
滑桃树 ( Trewia nudiflora) 植物内生菌宏基因组
文库中的 75000 个单克隆 , 通过逐级 PCR 的方法
进行了筛选 , 并对获得的数个卤代酶基因阳性克
隆通过亚克隆和步移测序的方法获得了两个
FADH2 依赖型卤代酶基因全长 63D9Hal、 64E9Hal
(GenBank 注册号: FJ493227 和 FJ493228)。目前正
在对这两个新卤代酶基因继续进行异源表达和体
外活性检测等方面的研究。相信随着人们对卤代
酶的底物结构和反应机理了解的不断深入 , 利用
可以人为控制的生物卤化反应合成有机卤化物 ,
必将在创新药物和先导化合物研究等领域有广阔
的应用前景。
〔参 考 文 献〕
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