全 文 ：濒危植物华木莲核基因组微卫星引物开发研究*
熊摇 敏1, 王摇 静1, 张志荣3, 张志勇1,2**
(1 江西农业大学 亚热带生物多样性实验室, 江西 南昌摇 330045; 2 中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家
重点实验室, 北京摇 100093; 3 中国科学院昆明植物研究所, 中国西南野生生物种质资源库, 云南 昆明摇 650201)
摘要: 华木莲 (Sinomanglietia glauca) 是在江西宜春和湖南永顺发现的一种珍稀植物。 为进一步探讨华木
莲群体遗传学特征, 本研究采用 FIASCO 法 ( fast isolation by AFLP sequences containing repeats) 开发了七
对华木莲微卫星引物, 选取华木莲 4 个野生居群 16 个样品对每个位点进行多态性初步检测。 结果发现,
七个微卫星位点的等位基因数目 (NA) 为 2 ~ 7 个, 观测杂合度 (HO) 0. 079 ~ 0. 989, 期望杂合度 (HE)
0. 187 ~ 0. 600。 另外, 使用九个华木莲近缘种对七对引物进行通用性检测, 发现这些引物在醉香含笑中通
用性最低 (28. 5% ), 在观光木中通用性最高 (85. 7% )。 本文开发的多态性微卫星标记将用于华木莲的
繁育系统、 群体遗传学等研究, 同时也将用于木兰科其它近缘种的群体遗传学研究。
关键词: 华木莲; 微卫星; 分子标记; 通用性
中图分类号: Q 78摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2011)05-535-05
The Development of Nuclear Microsatellite Markers for an
Endangered Plant, Sinomanglietia glauca (Magnoliaceae)
XIONG Min1, WANG Jing1, ZHANG Zhi鄄Rong3, ZHANG Zhi鄄Yong1,2**
(1 Laboratory of Subtropical Biodiversity, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China; 2 Key State Laboratory
of Systematic and Evolutionary Botany, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China;
3 China Germplasm Bank of Wild Species / Key Laboratory of Biodiversity and Biogeography,
Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China)
Abstract: Sinomanglietia glauca is an endangered species found in Yichun of Jiangxi Province and Yongshun of Hu鄄
nan Province. To further explore its population genetic characteristics, we developed seven microsatellite markers
from S. glauca using a FIASCO (fast isolation by AFLP sequences containing repeats) method. The number of al鄄
leles (NA) ranged from two to seven in 16 samples of four wild populations. The ranges of observed (HO) and ex鄄
pected (HE) heterozygosities were 0. 079-0. 989 and 0. 187-0. 600, respectively. The transferability of the seven
microsatellite loci was tested upon nine related species of S. glauca within Magnoliaceae. Among which, two (28. 5%,
Michelia macclurei) to six (85. 7% , Tsoongiodendron odorum) loci were successfully amplified. These polymorphic
microsatellite markers could be used to decipher the genetic structure, breeding system and population history of
S. glauca as well as other relatives within Magnoliaceae.
Key words: Sinomanglietia glauca; Microsatellite; Molecular marker; Transferability
摇 微卫星 DNA (microsatellite DNA) 是一类由
少数几个核苷酸 (1 ~ 6 个) 组成的串联重复序
列, 在真核生物核基因组中广泛分布。 由于其具
有多态性高、 共显性、 重复性好、 易于分析等突
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2011, 33 (5): 535 ~ 539
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 3724 / SP. J. 1143. 2011. 11004
*
**
基金项目: 江西省自然科学基金项目 (2009GZN0016); 系统与进化植物学国家重点实验室开放课题; 国家自然科学基金 (30760016)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: pinus鄄rubus@ 163. com
收稿日期: 2011-01-07, 2011-03-03 接受发表
作者简介: 熊敏 (1987-) 女, 硕士生, 主要从事保护遗传学研究。 E鄄mail: xmin_87@ 163. com
出特点 (邹喻苹等, 2001), 自发现以后, 很快
成为一种极具价值的遗传标记 (Weber 和 May,
1989), 广泛应用于居群遗传分析、 濒危植物的
保育遗传与管理 (Kettle 等, 2008)、 数量性状
QTL定位、 分子辅助育种等研究领域 (Lian 等,
2003)。 但基于 PCR和电泳检测的微卫星标记需
要预先知道微卫星位点两侧的 DNA 序列, 用于
设计 PCR引物, 这一缺点使得微卫星标记的应
用受到限制。 近年来, 随着微卫星位点分离技术
的不断改善, 尤其 FIASCO 法 ( fast isolation by
AFLP sequences containing repeats) 的引入, 通
过构建微卫星文库和克隆测序获得微卫星两侧序
列变得越来越容易, 微卫星标记得以在大批物种
中开发出来 (Zane等, 2002)。
华木莲 (Sinomanglietia glauca Z. X. Yu et Q.
Y. Zheng) 是俞志雄等 (1994), 发表的木兰科单
种属植物, 具有重大的研究价值和极高的利用
价值, 被国内外植物学者广泛关注。 吴征镒等
(2004), 在 《中国被子植物科属综论》 中专门
提及该植物在木兰科系统演化中的重要地位。 华
木莲最初仅在江西宜春明月山发现, 种群数量非
常有限, 1999 年被列为我国一级保护植物 (国
家林业局和农业部令, 1999)。 2003 年, 我国林
业工作者在湖南永顺县武陵山调查时发现较大面
积的华木莲 (侯伯鑫等, 2006)。 即使如此, 华
木莲的分布区仍然十分狭窄。
华木莲发表以后, 俞志雄等对其进行了深入
研究, 研究内容涉及细胞学、 解剖学、 生态学、
群体遗传学、 胚胎学等方面 (肖德兴和张津平,
1998; 俞志雄和李志强, 1999; 俞志雄等, 1999;
郭起荣等, 2003; 肖德兴和俞志雄, 2004; 裘利
洪等, 2004), 这些研究为华木莲的保护和合理
利用提供了重要的理论基础。 遗传多样性是物种
长期生存和进化的基础, 华木莲的遗传多样性和
遗传结构也同样受到多位学者的关注。 林新春等
(2003) 和廖文芳等 ( 2004 ) 利用遗传标记
RAPD和 ISSR 对华木莲宜春居群的遗传多样性
和遗传结构进行了初步研究, 发现宜春华木莲遗
传多样性较低。 Zhang 等 (2009) 也利用叶绿体
PCR鄄SSCP标记对江西宜春和湖南永顺两个地区
的居群进行了研究, 结果表明湖南和江西的群体
是两个完全不同的进化显著单元 (Evolutionarily
Significant Units, ESUs)。 这些研究为华木莲遗
传多样性和进化潜力的保护提供了重要的理论基
础。 但是, 三个研究团队采用的分子标记都存在
一些问题, 如 RAPD 和 ISSR 都为显性标记且重
复性不高, 而叶绿体 PCR鄄SSCP 进化速率较低,
不能揭示群体内的遗传变异。 为了进一步揭示华
木莲可能存在的遗传学风险, 如近交和近交衰
退、 生境片段化造成的低水平基因流等, 需要
采用共显性的、 变异量较大的分子标记 (如微
卫星标记, SSR)。 本研究采用了 FIASCO (fast i鄄
solation by AFLP sequences containing repeats) 法
筛选华木莲微卫星引物, 为探讨上述问题提供一
套有效的分子标记。
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料
研究材料采自 4 个野生华木莲群体 (表 1), 每个居
群选 4 个个体, 共 16 个个体。 所有样品采集后用硅胶迅
速干燥, 带回实验室, 保存于-20益冰箱内备用。 通用
性检测选取 9 个华木莲近缘种 (表 2), 材料均取自江西
农业大学校园。 所有样品凭证标本均保存于江西农业大
学亚热带生物多样性实验室。
1. 2摇 实验方法
1. 2. 1摇 DNA 的提取 摇 总 DNA 从硅胶干燥的叶片中提
取, 采用 CTAB法 (Doyle和 Doyle, 1987) 并略加改进。
1. 2. 2摇 酶切并与 Mse I接头连接摇 用内切酶 Mse I酶切基
因组 DNA, 1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测, 切下 200 ~800 bp
表 1摇 华木莲四个野生居群的地理分布和取样数量
Table 1摇 Geographic location and sample size of four wild populations of Sinomanglietia glauca
代号 Code 采集地点Location
样品数
Number
纬度 Latitude
(N)
经度 Longitude
(E)
海拔 Altitude
/ m
YP 湖南省永顺县朗溪乡云盘村大汗溶深湾 4 28毅57. 121忆 110毅17. 398忆 674
XX 湖南省永顺县小溪乡鲁家组柒里 4 28毅52. 051忆 110毅15. 473忆 660
MP 江西省宜春市洪江乡洪江村木枰组曲尺河 4 27毅35. 654忆 114毅21. 059忆 718
YJ 江西省宜春市玉金山 4 27毅34. 367忆 114毅19. 276忆 720
635摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 33 卷
大小的片段。 酶切后的产物连接, PCR 仪内 37益, 2 h
或 21益过夜连接, 65益失活 10 min。
1. 2. 3摇 连接产物预扩增摇 用连有接头的 DNA 片段作为
模板, MseI鄄N primer 作为引物, 进行 PCR 扩增 ( BIO鄄
ER), 反应程序为 94益 预变性 5 min; 94益 1 min; 53益
1 min; 72益 1 min; 14 个循环; 72益 7 min, 1. 5%琼脂
糖凝胶电泳检测。
1. 2. 4摇 探针杂交与磁珠富集微卫星序列 摇 上述扩增产
物 3 份分别与(AG) 1 5 / (AC) 15 / (AAG) 12生物素探针进行
杂交。 杂交过程中平衡磁珠。 在杂交产物中加入处理好
的磁珠 (Promega) 温育, 然后用磁力柱 (Promega) 吸
附, 多次洗涤后, 加入 50 滋L TE溶液在 95益水浴中洗脱
磁珠两次, 留上清液 (里面含有所需 DNA)。 沉降
DNA, 用 MseI鄄N 引物进行扩增, 扩增产物使用 UNIQ鄄10
柱式 PCR产物纯化试剂盒 (上海生工) 纯化。
1. 2. 5 摇 克隆测序 摇 将纯化产物连接到 pGEN鄄T 载体
(Promega) 上转入到大肠杆菌感受态细胞 (Tiangen) 中。
挑取阳性克隆进行测序分析。 DNA 序列用 SSRHunter 软
件对其进行搜索 (Li 和 Wan, 2005), 筛选出含微卫星
的序列。 然后用 Oligo 6. 0 软件在微卫星两翼设计引物。
1. 2. 6摇 检测所设计的引物并对反应条件进行优化摇 从 4
个野生华木莲群体中每个居群随机选取 4 个个体, 对设
计出的引物进行扩增, PCR 反应体系为 20 滋L: 2伊PCR
Mix (Tiangen) 10 滋L, primer R & F (5 滋mol·L-1 ) 1
滋L, 总 DNA (20 ng) 1 滋L, 加水至 20 滋L。 反应程序:
94益 5 min; 94益 40 s; 54 ~ 67益 40 s; 72益 50 s, 35 个
循环; 72益 10 min。 PCR 扩增产物用 8%非变性聚丙烯
酰胺凝胶电泳检测。
1. 2. 7摇 引物通用性检测 摇 以华木莲的 9 个近缘种 (表
2) 为实验材料对筛选出来的 SSR 引物进行 PCR 扩增,
8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物。
1. 3摇 数据分析
采用 GenALEx V. 6. 3软件 (Peakall和 Smouse, 2006)
计算每个位点的等位基因数目 ( NA )、 观测杂合度
(HO)、 期望杂合度 (HE)。 利用 GENEPOP V. 3. 4 软件
(Raymond和 Rousset, 1995) 来计算 28 个居群-位点组
合是否偏离哈迪温伯格平衡 (Hardy鄄Weinberg equilibri鄄
um, HWE) 以及每个位点对是否连锁不平衡 (Linkage
disequilibrium, LD), 用序列化的 Bonferroni ( Sequential
bonferroni correction) 校正显著性水平 (Rice, 1989)。
2摇 结果及分析
本次实验从富集微卫星文库中挑选了 187 个
阳性克隆 (白色菌斑) 进行测序, 得到了 104
(55. 6% ) 条含有非同源微卫星序列。 其中 86条
序列可以用来设计引物, 另外 18 条序列由于重复
序列前后的序列太短, 不能用来设计引物。 选择
58 个重复序列重复次数多的位点进行引物合成,
并进一步检测其扩增结果。 最终筛选出 7 对多态
性较高的引物。 7 对微卫星引物在 16 个个体中共
检测到 28个等位基因, 每个位点的等位基因数目
(NA) 为 2 ~7个, 平均 4 个; 观测杂合度 (HO)
为 0. 079 ~ 0. 989, 平均 0. 515, 期望杂合度
(HE) 为 0. 187 ~ 0. 600, 平均 0. 408 (表 3)。 哈
迪温伯格平衡 (HWE) 检测显示在 28 个居群-
位点组合中有 12 个偏离 HWE (P<0. 05)。 在整
个居群水平上对每个微卫星位点对进行连锁不平
衡 (LD) 检测结果表明, 21 个位点对中有 14
对是显著不平衡的 (P<0. 05)。 但是经过 Bon鄄
ferroni校正后, 0. 05 的显著度被校正到 0. 0024,
21 个位点对中只有 9 对为显著不平衡 (SSR1 和
SSR65, SSR1 和 SSR74, SSR1 和 SSR215, SSR65
和 SSR215, SSR74 和 SSR215, SSR1 和 L78,
SSR65 和 L78, SSR74 和 L78, SSR215 和 L78)。
我们用9个华木莲近缘种对开发出来的 7
对华木莲微卫星引物进行通用性检测。 结果表
明, 这 7对引物在醉香含笑中通用性最低 (2 对,
28. 5%), 在观光木中通用性最高 (6 对, 85. 7%)
(表 2), 在其它物种中能扩增的引物为 3 ~ 5 对。
3摇 讨论
微卫星具有多态性高、 共显性、 重复性好、
易于分析等突出特点, 被认为是群体遗传学研究
的理想标记 (邹喻苹等, 2001)。 随着越来越多
的微卫星标记问世, 微卫星标记技术已经在各研
究领域得到广泛应用。 传统的基因组文库法得到
微卫星阳性克隆的比率很低 (2% ~ 3% )。 FIAS鄄
CO法是一种高效、 省时省力、 成本较低的微卫
星标记开发方法, 这种方法一经公布便得到广泛
应用。 目前, 木兰科中已有少数植物采用 FIAS鄄
CO开发微卫星引物, 如星花木兰 (Magnolia
stellata, Setsuko 等, 2005)、 鹅掌楸 ( Lirioden鄄
dron chinense, Yao 等, 2008)、 显脉含笑 (Mich鄄
elia coriacea, Zhao 等, 2009)、 巴东木莲 (Man鄄
glietia patungensis, 邢冲等, 2010 )、 深山含笑
(Michelia maudiae, Sun等, 2010) 等。 本研究以
高效的 FIASCO 法从濒危植物华木莲中筛选出 7
对重复性好、 多态性高的微卫星引物, 为这一濒
7355 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 熊敏等: 濒危植物华木莲核基因组微卫星引物开发研究摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 2摇 华木莲 7 对微卫星引物在近缘种中的通用性检测结果
Table 3摇 Cross鄄species amplification using seven microsatellite primer pairs developed for Sinomanglietia glauca
种名 Species
引物 Primer
SSR1 SSR65 SSR74 SSR215 L76 L78 L82
白玉兰 Magnolia denudata 鄄 鄄 鄄 鄄 + + +
天女花 Magnolia sieboldii + + + 鄄 + 鄄 +
巴东木莲 Manglietia patungensis 鄄 + + 鄄 + + 鄄
乳源木莲 Manglietia yuyuanensis 鄄 + + 鄄 + 鄄 鄄
含笑 Michelia figo + + 鄄 + + 鄄 +
醉香含笑 Michelia macclurei 鄄 鄄 鄄 鄄 + 鄄 +
鹅掌楸 Liriodendron chinense + + 鄄 鄄 鄄 + +
观光木 Tsoongiodendron odorum + + 鄄 + + + +
乐东拟单性木兰 Parakmeria lotungensis + + 鄄 鄄 + 鄄 +
‘+爷 表示在目的区域有扩增, ‘-爷 表示没有扩增
‘+爷 denotes amplification of a band in the expected size and ‘-爷 denotes no amplification
表 3摇 开发出的 7 对华木莲微卫星引物
Table 2摇 Characteristics of seven microsatellite loci developed for Sinomanglietia glauca
位点
Locus
重复单元
Repeat motif
引物 (5忆-3忆)
Primer Sequence (5忆-3忆) Ta / 益
片段长度
Size range / bp
等位基因数
NA
期望杂合度
HE
观测杂合度
HO
SSR1 (AC)18 F: CCCGATTTGAACAACATTGAR: AAAGTTGCGATTTTGGGAGA 59 181 5 0. 600 0. 989
SSR65 (GT)11 F: TTCTATTTGGAGGGCATTGGR: TGGGCTTATTACAATCATTTTATCC 62 133 4 0. 299 0. 212
SSR74 (AC)18 F: CTTCGAAACCCTTCAACGAAR: AAAGTTGCGATTTTGGGAGA 62 142 6 0. 596 0. 989
SSR215 (CT)15 F: TCAAGAGAGGGATGCCCTAAR: ATCGGCAAAGTGCGATAGAG 67 257 7 0. 457 0. 233
L76 (AG)11 F: CCTTAAACCACCTCATTCCCR: TTGAAATGGGTTGTGTAGCC 64 181 2 0. 187 0. 079
L78 (AG)13 F: GAGTAAGAAATGAAGACGCTCGR: AGTAACAAGCCAATCAGGAGG 66. 5 282 2 0. 223 0. 222
L82 (CT)21 F: CTGAGTAACTTAAGCGGTCTTCACR: GTCCTGAGTAAGGTGGGCTT 54 241 2 0. 491 0. 881
危物种的群体遗传学研究奠定了坚实的基础。
通用性检测结果表明, 华木莲 7 对微卫星引
物在近缘种中扩增效率较低, 一般为 3 ~5 对, 最
低只有 2对 (28. 5%, 醉香含笑), 最高也才 6 对
(85. 7%, 观光木)。 Isagi 等 (1999) 对日本厚朴
(Magnolia obovata) 进行微卫星引物开发, 11 对
微卫星引物在同属种星花木兰 (Magnolia stel鄄
lata)、 皱叶玉兰 (Magnolia praecocissima)、 日本
毛木兰 (Magnolia salicifolia) 中全部都有扩增,
通用性较低的也有 6 对 (54. 5%, 荷花玉兰 Mag鄄
nolia grandiflora)。 总体上高于华木莲微卫星引物
在近缘种中的通用性。 微卫星跨越物种的通用程
度与种间亲缘关系有关 (邹喻苹等, 2001)。 华木
莲形态特殊, 其落叶的特性以及聚合果沿果轴蒴
果状开裂等特征明显区别于近缘的木莲属, 最初
以单种属的形式发表 (俞志雄等, 1994)。 虽然其
属级地位尚存在一些争论 (郑庆衍, 1996), 但华
木莲是木兰科中一个较为特殊的分支应该没有疑
问 (吴征镒等, 2004)。 因此, 华木莲中开发出来
的微卫星引物在木兰科其它物种中通用性较低,
可能在一定程度上反映其系统位置的孤立性。
微卫星引物的开发程序比较复杂、 工作量
大、 成本较高。 如果一套引物能够在不同物种中
应用, 显然可以节省很多人力物力。 虽然华木莲
微卫星引物在近缘种中总体通用性较低, 但在一
些物种, 如观光木中通用性较高, 本研究所开发
的华木莲微卫星引物对这些近缘种的群体遗传学
研究将起到一定推动作用。
835摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 33 卷
致谢摇 江西农业大学国土资源与环境学院研究生田野,
园林与艺术学院本科生罗意、 孟庆霖、 胡菀、 徐琴在实
验方面给予帮助。
也参摇 考摇 文摇 献页
吴征镒, 路安民, 汤彦承, 2004. 中国被子植物科属综论 [M].
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