全 文 ：拟南芥SDIR1基因转录的选择性剪接*
武晓璐,汤晓倩,于丽霞,姚有林,鄢暋波**
(西南林学院园林学院,云南 昆明暋650224)
摘要:采用PCR及RT灢PCR法分别克隆了拟南芥SDIR1基因的DNA和cDNA序列。根据序列比对分析
结果,发现了3种不同的转录本,提示SDIR1基因的转录中存在选择性剪接。3种转录本的长度分别为
822bp、691bp和666bp,依次命名为:SDIR1灢822、SDIR1灢691、SDIR1灢666。与SDIR1基因的DNA序
列及已报道的SDIR1cDNA序列比较,除转录本SDIR1灢822包含了完整的编码序列外,其余2种转录本的
编码序列都存在不同长度的缺失。其中,SDIR1灢691缺失了131bp的片段:第2外显子3曚端缺失33bp,
第3外显子53bp全部缺失,第4外显子5曚端缺失45bp;转录本SDIR1灢666缺失了156bp的片段:第3
外显子3曚端缺失18bp,第4外显子5曚端缺失138bp。进而随机挑取101个克隆子对三种转录本的表达比
例进行初步分析,结果表明3种分子的比值为SDIR1灢822暶SDIR1灢691暶SDIR1灢666= 26灡00暶1灡33暶1灡00,
反映出SDIR1基因不同转录本在拟南芥中的相对表达量。
关键词:SDIR1基因;选择性剪接;拟南芥
中图分类号:Q78暋暋暋 暋暋暋文献标识码:A暋暋暋暋暋暋暋暋文章编号:0253灢2700(2010)02灢141灢06
AlternativeSplicingofSDIR1Genein
Arabidopsisthaliana(Cruciferae)
WUXiao灢Lu,TANGXiao灢Qian,YULi灢Xia,YAOYou灢Lin,YANBo**
(FacultyofLandscapeArchitecture;SouthwestForestryColege,Kunming650224,China)
Abstract:SequencesofDNAandcDNAofSDIR1geneinArabidopsisthalianawereisolatedbyusingPCR
andRT灢PCR.ThealignmentresultshowedthattherewerethreedifferenttranscriptsinArabidopsisthaliana,
whichindicatedthattherewerealternativesplicingpneumoniainthetranscriptionofSDIR1gene.Thelength
ofthreetranscriptswere822bp,691bpand666bp,respectively,andwerenamedasSDIR1灢822,SDIR1灢
691andSDIR1灢666subsequently.ComparedwiththereportedsequencesofDNAandcDNAinArabidopsis
thaliana,SDIR1灢822containedintactcodingdomain,whiletheothersmissedsomenucleotidesincodingdo灢
main.SDIR1灢691missed131bpwhichcontained33bpinthe3曚endofthesecondexon,53bpofalthe
thirdexonand45bpinthe5曚endofthefourthexon.SDIR1灢666missed156bpwhichcontained18bpinthe
3曚endofthethirdexonand138bpinthe5曚endofthefourthexon.Theexpressionratioofthreedifferenttran灢
scriptsSDIR1灢822,SDIR1灢691andSDIR1灢666was26灡00暶1灡33暶1灡00analyzedbyselecting101clones,which
mightindicatetherelativecontentofdifferenttranscriptsofSDIR1geneinArabidopsisthaliana.
Keywords:SDIR1gene;Alternativesplicing;Arabidopsisthaliana
暋暋SDIR1 (SALT灢ANDDROUGHT灢INDUCEDRINGFINGER1), 具有环指结构域的E3泛素蛋
云 南 植 物 研 究暋2010,32(2):141~146
ActaBotanicaYunnanica暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋DOI:10灡3724/SP灡J灡1143灡2010灡09239
*
**
基金项目:西南林学院人才引进启动项目、省部级重点学科、省高校重点实验室及校实验室共享平台资助项目
通讯作者:Authorforcorrespondence;E灢mail:yanbodr@yahoo灡com灡cn
收稿日期:2009灢11灢30,2009灢12灢22接受发表
作者简介:武晓璐 (1985-)女,西南林学院园林植物与观赏园艺在读硕士研究生,从事植物分子生物学研究。
E灢mail:huaxiaosheng1985@gmail灡com
白连接酶,可以正向调控拟南芥胁迫响应的脱落
酸传导途径 (Zhang等,2008)。SDIR1在拟南
芥受到干旱和盐害胁迫时可以表达,但不受
ABA (AbscisicAcid)诱导。有试验证明对拟南
芥干旱处理0~48h,SDIR1的表达增强,且在
植株各部位均有表达 (Zhang等,2007)。
选择性剪接是细胞生物体产生复杂蛋白的一
个重要机制,最重要的功能是可提高基因产物的
多样性和基因表达的复杂程度。拟南芥基因组中
绝大多数发生选择性剪接的基因编码的蛋白都与
调控功能有关 (Anireddy,2007)。植物前体
mRNA 选 择 性 剪 接,最 早 是 Werneke 等
(1989)研究发现RCA 基因在菠菜和拟南芥的
叶片中均可发生选择性剪接。生物信息学研究表
明,4%的大麦基因 (Zhang等,2004)、11灡6%
的拟南芥基因 (Iida等,2004)和10%的水稻基
因发生了选择性剪接 (Kikuchi等,2005),并且
在水稻中检测到大量基因在第一外显子发生选择
性剪接 (Kitagawa等,2005)。除了核基因组的
基因外,线粒体 (WangandBrendel,2006)和
叶绿体 (Barbazuk等,2008)的基因也会发生选
择性剪接。本文在对SDIR1基因的克隆研究中
也首次发现该基因存在选择性剪接现象。
1暋材料与方法
1灡1暋材料
拟南芥Arabidopsisthaliana(L.)Heynh,Columbia
生态亚型,由中科院昆明植物研究所惠赠。大肠杆菌
DH5毩由本实验室提供。
1灡2暋拟南芥总RNA、DNA的提取
选取新鲜拟南芥植株分别采用 TIANGEN 公司的
TRIzol植物总RNA提取试剂盒和 TaRaKa公司植物基
因组 DNA 提取试剂盒提取拟南芥总 RNA、DNA。
1灡0%琼脂糖凝胶电泳检测提取总RNA、DNA纯度。
1灡3暋拟南芥SDIR1基因cDNA第一链合成
采用20毺l反应体系。0灡5mlEppendof管加入13灡5
毺lRNA、oligo(dT)10 (2毺g·毺l灢1)0灡5毺l、5暳first
strandbuffer4毺l、RNaseInhibitor(30u·毺l灢1)0灡5毺l、
M灢MLVRTase(30u·毺l灢1)0灡5毺l、dNTPs(2灡5mmol·L灢1)
1毺l。42曟孵育60min,置于-20曟备用。
1灡4暋PCR扩增
1灡4灡1暋引物序列如下:
SDIR1Reverseprimer
5—3:TCAAACCATGTCGGAAGCATCATC
SDIR1Forwardprimer
5—3:ATGAGCTTTGTTTTCCGGGGAAG
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1灡4灡2暋PCR循环数的确定暋暋以上述合成的SDIR1cD灢
NA第一链为模板,进行PCR扩增,采用25毺l反应体
系:10暳TaqDNApolymerasebuffer2灡5毺l、Mg2+ (25
mmol·L灢1)1灡5毺l、dNTPs(2灡5mmol·L灢1)2灡0毺l、SDIR1
PF(12灡5pm·毺l灢1)0灡5毺l、SDIR1PR (12灡5pm·毺l灢1)
0灡5毺l、cDNA 第一链反应液1灡0毺l、TaqDNApoly灢
merase(5u·毺l灢1)(TIANGEN 公司)0灡2毺l、ddH2O
16灡8毺l。反应条件为预变性94曟,4min;循环参数为
94曟30s;60曟30s;72曟 90s;分别在18,20,22,
24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46个
循环时进行扩增。反应结束后PCR产物经1%琼脂糖凝
胶电泳检测以确定适合的循环数。
1灡4灡3暋PCR扩增暋暋分别以上述合成的SDIR1cDNA第一
链、SDIR1DNA为模板,进行PCR扩增目的片段,反应
体系及参数如前。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1灡5暋序列分析
PCR扩增产物经胶回收试剂盒 (尚能生物科技)纯
化后,采用 TaKaRa公司的pMD18灢T 载体进行克隆,
宿主菌为大肠杆菌DH5毩。挑取克隆子经PCR鉴定,选
择部分不同片段长度的克隆子送TIANGEN测序。
1灡6暋差异表达研究
挑取101个克隆子,经PCR鉴定和1%琼脂糖凝胶
电泳,统计含有不同片段长度的克隆子数,从而计算
SDIR1基因不同转录本的比例。
2暋结果与分析
2灡1暋PCR循环数的确定
本研究分别进行18、20、22、24、26、28、30、
32、34、36、38、40、42、44、46个循环的PCR扩
增,1%琼脂糖凝胶电泳检测,预期大小的目的片
段在38个循环前明显处于线性扩增期。我们选定
SDIR1cDNA的PCR扩增循环数为38个循环。
2灡2暋SDIR1cDNAPCR扩增
利用前述合成的SDIR1基因cDNA第一链
为模板,用SDIR1Primers进行PCR扩增目的
片段,RT灢PCR反应产物电泳结果见图1。在大
约822bp的位置有一条明亮的扩增带,并在其
下方约600bp左右还可见一条很微弱的扩增带,
将这两条带所在区域经胶回收试剂盒纯化后,用
于后续的序列分析。
241暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋第32卷
图1暋SDIR1PCR扩增
M:DNA标准分子量2000
Fig灡1暋AmplificationofSDIR1cDNA
M:DNAmarker2000
2灡3暋SDIR1DNAPCR扩增
利用SDIR1DNA为模板,用SDIR1Prim灢
ers进行PCR扩增目的片段,电泳检测结果见图
2,在大约1灡8kb的位置有一条特异扩增带,切
下,经胶回收试剂盒纯化后,进行克隆。
图2暋 SDIR1DNAPCR扩增
M:DNA标准分子量2000
Fig灡2暋AmplificationofSDIR1DNA
M:DNAmarker2000
2灡4暋菌落PCR检测
cDNA检测:利用SDIR1primers对获得的克隆
子进行了PCR鉴定,结果出现3种不同大小的分子
(图3),其大小分别约为822bp、691bp、699bp。
DNA检测:利用SDIR1primers对获得的
克隆子进行了PCR鉴定,在大约1灡8kb位置有
一条特异扩增带。
2灡5暋克隆子测序结果
克隆子测序结果显示,来源于cDNA的PCR
扩增产物的克隆子中发现下列3种分子:大小分
图3暋部分克隆子菌落的PCR鉴定
M:DNA标准分子量2000;
1~10:随机挑选克隆子的菌落PCR鉴定
Fig灡3暋IdentificationofpartclonesbyPCR
M:DNAmarker2000;
1~10:IdentificationofpartclonesbyPCR
别为822bp、691bp、666bp。与已报道的SDIR1
cDNA (GenBankNM_115410)比对发现,822bp
片段包含了完整的编码序列;691bp片段则比该
片段少了131bp;666bp片段则是少了156bp
(图4)。其余序列与已报道的SDIR1cDNA序列
完全一致。根据序列的不同,将三个转录本命名
为SDIR1灢822、SDIR1灢691、SDIR1灢666。
同时,来源于DNA的PCR扩增产物的序列
测序结果与已报道的SDIR1基因的DNA序列具
有100%同源性。结合已报道的SDIR1cDNA
(GenBankNM_115410)序列,其外显子与内含
子的位置结构如图5所示。
3种选择性剪接转录本的序列特征如下:
转录本SDIR1灢822包含完整的编码序列。
转录本SDIR1灢691缺失了131bp的片段:第
二外显子3曚端缺失33bp,第三外显子53bp全部
缺失,第四外显子5曚端缺失45bp,使其产生的成
熟的mRNA缺失了三段外显子。此缺失导致了移
框突变的发生,并导致了终止密码子的提前出现,
其结果是可能产生无功能意义的蛋白质片断。
转录本SDIR1灢666 缺失了156bp的片段:
第三外显子3曚端缺失18bp,第四外显子5曚端缺
失138bp,使其产生的成熟的 mRNA缺失了两
段外显子。此缺失导致了SDIR1蛋白质中缺失
了一段连续的氨基酸序列:MPPNFLLWLVL灢
GVFLMATTLAQAAAASGLFSHTELRLH,包含
52个氨基酸残基。据报道SDIR1蛋白质中有一
段高度保守的环指结构域和两段跨膜结构域,且
3412期暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋武晓璐等:拟南芥SDIR1基因转录的选择性剪接暋暋暋暋暋 暋暋暋 暋暋暋暋暋暋
其功能与胞内膜系统相关 (Zhang等,2008)。
该转录本编码的蛋白质仍含有完整的环指结构域
和第一个跨膜结构域,但缺失了第二个跨膜结构
域,这对于该蛋白与细胞内膜结合的影响,乃至
对其功能的影响如何,尚待进一步的研究。
结合已有资料和报道,我们推断SDIR1基
因可能是由于前体 mRNA的选择性剪接产生了
上述差异。选择性剪接是真核细胞一种重要的
mRNA转录后加工机制,由此而产生相应的多种
mRNA异构体 (Schmucker等,2000),使一个基
因可以翻译为多种多肽序列,是基因表达多样性
的重要表现形式。据报道,在植物中,由于选择性
剪接所生成的产物具有信号传导、免疫、发育、
转运、抗病及调控等功能 (Garcia灢Ortiz等,2004;
图4暋克隆的SDIR1cDNA (822bp,691bp,666bp)序列比对
NM_115410:已报道的SDIR1基因cDNA序列;SDIR1灢822、SDIR1灢691、SDIR1灢666:SDIR1
基因3种分子大小分别为822bp、691bp、666bp
Fig灡4暋SequencealignmentofSDIR1cDNA (822bp,691bp,666bp)
cDNAsequenceofreportedSDIR1gene,thelengthofSDIR1灢822,SDIR1灢691andSDIR1灢666
was822bp,691bpand666bp,respectively
441暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋第32卷
图5暋SDIR1DNA外显子与内含子的位置结构划线部分为外显子区域
Fig灡5暋LocalizationoftheexonandintronofSDIR1lineationregionistheexon
Hamada等,2002;delaFuentevanBentem 等,
2003;Isshiki等,2001;Li等,2006),有些选择性
剪接基因编码的蛋白还与植物品质及开花时间有
关 (ReddyandGolovkin,2008)。转录本SDIR1灢
666在拟南芥的生长发育过程中,是独立作用还
是协同作用,对其功能有何种影响还需要深入的
研究。
2灡6暋SDIR1基因选择性剪接转录本的差异表达研究
2灡6灡1暋SDIR1基因选择性剪接转录本的差异表
达分析暋暋挑取101个克隆子,有阳性克隆子
85个,其中4个克隆子含有691bp长度的片段,
3个克隆子含有666bp长度的片段,78个克隆
子含有822bp长度的片段。3种分子的相对表
达比例SDIR1灢822暶SDIR1灢691暶SDIR1灢666=
26灡00暶1灡33暶1灡00。该比值显示SDIR1基因不
同转录本在拟南芥中的相对表达量。
SDIR1基因在正常生长情况下具有一定的
基础表达水平 (Zhang等,2007)。本实验取材
于未经任何预处理的拟南芥新鲜植株,因此上述
比值显示了SDIR1基因不同转录本在基础表达
水平的相对表达量,同时也说明了该基因的选择
性剪接现象在正常生长条件下就存在。但在干旱
和盐诱导等逆境条件下该选择性剪接现象是否存
在、表达量是否有变化以及可能的功能仍需进一
步的研究。
2灡6灡2暋选择性剪接转录本差异表达分析的可靠
性暋暋RT灢PCR反应是酶促反应,遵循酶促反应
定律 (Bustin,2000)。其初期的循环数内扩增
产物呈指数累积,产物与模板呈线性关系,定量
RT灢PCR技术正是利用产物与模板的这一线性关
系,通过扩增产物来比较总RNA中目的基因表
达丰度的不同 (Gonzalez等,2003)。但经过一
定的循环后,PCR产物不再呈指数累积而进入
平台期,在平台期低水平表达的目的RNA可能
会增加到与高水平表达的目的RNA相同的浓度
(MorrisonandGannon,1994),因此,为避免
平台效应的影响,合适的循环数是 RT灢PCR用
于定量分析的关键因素之一。
SDIR1基因的3种不同转录本在PCR扩增中
形成了一组天然的竞争性模板,即在同一PCR反
应管中,三个模板竞争相同的引物、dNTPs和聚
合酶,形成了一种类似竞争性PCR反应的过程与
5412期暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋武晓璐等:拟南芥SDIR1基因转录的选择性剪接暋暋暋暋暋 暋暋暋 暋暋暋暋暋暋
机制。因此,三种模板PCR最终产物的比值能够
反映其初始状态时含量的比值。线性时期反应体
系中的产物量也就代表了被检测模板的量 (Gili灢
land等,1990;Zhang等,1997)。本研究中采用线
性扩增期间的循环数,既保证所扩增分子在量上
的可检测性,同时也保证了对选择性剪接转录本
差异表达进行相对定量分析的可靠性,即三个转
录本RT灢PCR反应扩增产物之间的比例关系初步
反映了所对应转录本之间的表达量的差异。另外,
由于转录本SDIR1灢691、SDIR1灢666的表达量很
低,使用传统的Northern杂交技术很难对其进行
定量分析,本实验根据竞争性PCR原理,在挑选
一定数量克隆子的基础上用类似竞争性PCR的方
法,对SDIR1基因进行比例分析可以更灵敏地反
映不同的转录本的差异表达量。
暡参暋考暋文暋献暢
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