全 文 ：应用 DNA条形码对植物标本的核查*
曾春霞, 贺正山, 杨俊波**
(中国科学院昆明植物研究所中国西南野生生物种质资源库, 云南 昆明摇 650201)
摘要: DNA条形码主要目的是物种鉴定和新物种或隐存种的发现, 而 DNA 条形码参考数据库是物种快速
鉴定的重要基础。 目前中国维管植物 DNA条形码参考数据库正在建设之中, 借助于公共数据库 (NCBI)
和初步建立的中国植物 DNA条形码参考数据库, 运用 DNA条形码数据开展了植物标本鉴定的核查工作:
(1) 比较 DNA序列信息与标本鉴定信息, 从科、 属、 种级水平查找鉴定错误的标本; (2) 基于有较好研
究基础的 DNA条形码参考数据库, 开展未知标本的鉴定; (3) 通过对标本核查的总结, 提出 DNA条形码
参考数据库建设过程中的几点建议。
关键词: 植物; 标本鉴定; DNA条形码; 参考数据库
中图分类号: Q 949, Q 78. 1摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2013)06-693-08
DNA Barcoding for Plant Specimen Identification*
ZENG Chun鄄Xia, HE Zheng鄄Shan, YANG Jun鄄Bo**
(Germplasm Bank of Wild Species in Southwest China, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China)
Abstract: DNA barcoding comprises two distinct aims: specimen identification and species discovery. To achieve
these goals, a DNA barcode reference library is indispensable and is currently under construction for Chinese plants.
In this paper, we used the existing public database, NCBI, and also our DNA barcode reference library, which is
under construction, to identify plant specimens. By combining DNA barcode sequences with scientific names deter鄄
mined by taxonomists, we first attempted to find incorrectly identified specimens and also to check specimens whose
DNA sequences were wrongly labeled. Secondly, we attempted the identification of unknown specimens in some
groups for which DNA barcodes are available. Thirdly, we make some suggestions for the development of a plant
DNA barcode reference library.
Key words: Plants; Specimen identification; DNA barcoding; Reference library
摇 对物种的准确鉴定是分类学的主要目的,
也是物种多样性管理、 保护和可持续利用的迫切
需求 (Chase和 Fay, 2009)。 自林奈的双名法确
立以来, 已鉴定和描述了约 170 万种生物物种
(Hawksworth, 1995), 但仍有 86%的陆地生物和
91%的海洋生物有待发现和描述 (Mora等, 2011)。
目前, 传统分类学对脊椎动物、 昆虫及高等植物已
开展了广泛研究, 然而, 对于形态特征不明显的微
小生物研究较少 (任保青和陈之端, 2010)。 随着
社会经济的发展, 人们对生物多样性的认识、 保护
和利用越来越关注, 对物种快速准确鉴定的需求也
日益迫切 (Che 等, 2010)。 然而传统分类学家的
数量正在不断缩减, 因此, 对地球上如此众多物
种的认识和准确鉴定是当前面临的艰巨任务之一
(Blaxter, 2003; Tautz等, 2003; Li等, 2011b)。
DNA条形码技术是利用标准化的 DNA 序列
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2013, 35 (6): 693 ~ 700
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 7677 / ynzwyj201313186
*
**
基金项目: 科技部科技基础性工作专项项目 (2013FY112600); 国家高技术研究发展计划 (863 计划) 主题项目 (2012AA021801);
中国科学院仪器设备功能开发技术创新项目实施方案项目 (植物遗传信息高效获取技术体系集成研制)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: jbyang@ mail. kib. ac. cn
收稿日期: 2013-09-11, 2013-10-16 接受发表
作者简介: 曾春霞 (1980-) 女, 博士, 主要从事植物系统发育研究。 E鄄mail: zengcx@ mail. kib. ac. cn
对物种进行快速准确的鉴定, 其实质是作为一种
新的性状来构建分类系统, 实现序列本身变异信
息与现有形态分类学的结合 (DeSalle 等, 2005;
Kristiansen 等, 2005; Will 等, 2005; Haase 等,
2007; Hajibabaei 等, 2007; Vogler 和 Monaghan,
2007)。 该技术不完全依赖形态特征保存完整的
标本, 对于已经失去了重要形态分类特征的待鉴
定标本, 也能实现正确鉴定, 它是对传统形态分
类学强有力的补充 ( Godfray, 2002; Mallet 和
Willmott, 2003; Hebert和 Gregory, 2005; Schindel
和 Miller, 2005)。 同时, DNA 条形码不仅可以
鉴定物种、 辅助分类学修订, 而且有利于新种和
隐存种的发现, 为生物多样性的研究提供了新的
研究手段和思路 (Dayrat, 2005; Fitzhugh, 2006;
Agnarsson和 Kuntner, 2007)。
自 Hebert等 (2003) 提出 DNA 条形码用于
物种快速鉴定以来, 植物 DNA 条形码研究也取
得了长足发展。 2009 年, 国际生命条形码联盟
植物工作组 (CBOL Plant Working Group, 2009)
推荐 rbcL+matK 组合作为陆地植物的核心 DNA
条形码, 用于构建植物物种鉴定的统一框图。 第
三界国际生命条形码大会上, ITS 和 trnH鄄psbA
被建议为植物条形码的辅助条码 (Hollingsworth
等, 2011 )。 中国植物条形码研究组 ( China
Plant BOL Group) 基于中国种子植物的 75 科 141
属 1 757 种约 6 286 个样品, 通过对 4 个条码
( rbcL、 matK、 trnH鄄psbA和 ITS) 综合比较分析,
建议 ITS (或 ITS2) 可作为种子植物的核心条码
之一 (Li 等, 2011a)。 DNA 条形码数据分析采
用 3 种常用的方法, 即基于 BLAST 分析的相似
法 (Meier 等, 2006)、 距离法 (distance) 和基
于遗传分化距离的建树法 ( tree鄄building) (Matz
和 Nielsen, 2005; Nielsen和 Matz, 2006)。
为了实现对物种的快速鉴定, DNA 条形码
参考数据库 (Reference Library) 的构建是物种
鉴定的重要前提。 目前分子鉴定和系统学分析中
常用的 DNA数据库有: 美国国家生物技术信息
中心 ( National Center for Biotechnology Informa鄄
tion, GenBank), 欧洲分子生物学实验室 (Eu鄄
ropean Molecular Biology Laboratory, EMBL) 和日
本核酸数据库 (DNA Data Bank of Japan (DD鄄
BJ)。 为了进一步推进 DNA 条形码研究, 生命
条形码联盟 (CBOL, Consortium for the Barcode
of Life) 建立了生命 DNA条形码数据库 (BOLD,
The Barcode of Life Data), 为专门收集和分析
DNA条形码数据的平台。 最新统计, 约 181 263
种物种已经完成 DNA 条形码信息的描绘, 同时
具 DNA条形码序列信息的标本也有 2 239 378 份
(http:/ / www. barcodinglife. com/ index. php / TaxBrowser
_Home), 该数据库以鱼类、 鸟类和昆虫类为主,
真菌和植物 DNA 条形码信息相对较少。 中国科
学院昆明植物研究所联合全国相关科研院校开展
了中国重要植物类群的采集、 DNA 条形码的测
定与分析等工作, 已经积累了中国维管束植物约
230 科 1 600 属 6 700 种约 60 000 条 DNA 条形码
序列, 目前 DNA条形码参考数据库已初具雏形。
借助于公共数据库 NCBI和初步建立的 DNA
条形码参考数据库, 我们应用 DNA 条形码技术
开展了植物标本物种鉴定的核查工作。
1摇 有鉴定信息标本的再确认
传统植物鉴定主要依据植物的形态特征, 参
考地理分布, 以分类检索表为路径, 根据植物志
属进行物种匹配 (方伟和刘恩德, 2012)。 由于
需要有较强的专业背景, 分类学家需要经过多年
的培养才能擅长于某一门类。 我国植物多样性丰
富, 即使是有经验的分类学家也难免鉴定错误。
DNA 条形码的工作流程涉及生物标本的采集、
保存和规模化管理; 样品 DNA 的提取; 条形码
标准基因的设计和筛选; 目标片段扩增、 测序;
序列分析和数据提交到数据库等。 利用样品已经
获得的 DNA条形码序列信息, 基于 BLAST 和建
树法, 对 DNA条形码序列和标本信息逐条比对
核查, 可有效查找错误。
1. 1摇 科级水平
如表 1 所示, 通过对样品自编号为 Z5376 和
Z5377 的 7 条 DNA条形码序列进行 BLAST比对,
发现样品编号 Z5376 原标本鉴定信息为禾本科雀
稗 (Paspalum thunbergii), 但 Z5376 的 3 条 DNA
条形码序列 (rbcL、 matK和 trnH鄄psbA) 经 BLAST
搜索与香蒲科香蒲属 ( Typha) 植物相似性最
高; 而来源于 Z5377 的 4 条 DNA 条形码序列原
鉴定信息为长苞香蒲 ( Typha angustata), 经
BLAST搜索则与禾本科雀稗属 (Paspalum) 序
496摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
列信息相似。 为了进一步对 BLAST 结果验证,
利用建树法对这两个属目前已获得的 DNA 条形
码序列构建 NJ树, 也发现样品 Z5376和 Z5377与
来源于同属的其它样品间遗传距离较大, 枝长较
长, 确定这两份样品为错误鉴定 (图 1)。
1. 2摇 属级水平
如图 2所示, 基于数据库中已有条形码数据
信息, 对马鞭草科 matK数据比对构建 NJ 树, 结
果显示紫珠属 (Callicarpa)、 莸属 (Caryopteris)、
马缨丹属 (Lantana) 和马鞭草属 (Verbena) 构
成了较好的单系支, 牡荆属 (Vitex) 为并系, 而
赬桐属 (Clerodendrum) 编号为 D0705 的样品被
鉴定为三对节 (Clerodendrum serratum), 其遗传
距离与牡荆属植物更相似; 同样, 根据 BLAST结
果, 本样品与牡荆属物种的序列相似度最高, 也
支持该样品应为牡荆属植物 (表 1)。 通过对该样
品标本的查证, D0705样品标本鉴定有误。
1. 3摇 种级水平
如图 3 所示, 对接骨木属 (Sambacus) 已有
matK数据进行序列比对, 构建 NJ树, 结果发现
血满草 (S. adnata) 的 9 份样品聚类在一起; 接
骨草 ( S. javanica) 的 16 份样品除 D3577 和
Z0300 外聚为一支, 且序列完全相同, 样品
D3577 单独成为一支, 而样品 Z0300 则与血满草
聚类为一支, 而且序列相同。 BLAST 结果支持
这两份样品均为接骨木属植物 (表 1)。 通过对
样品标本查证, 表明样品 Z0300 确实为血满草,
样品 D3577 物种鉴定错误。
2摇 对未鉴定标本的辅助鉴定
一些标本由于采集性状不完整, 缺乏物种关
键鉴定特征, 如花、 果等, 给传统分类学的鉴定
带来困难。 DNA条形码有诸多优点, 如物种鉴定
不受个体形态特征的限制 (如: 形态性状特征不
显著的一小块或一小片残缺材料; 保存已久的腊
叶标本、 炮制过的民间药材、 DNA降解材料等);
鉴定结果准确, 具有可重复性。 但只有构建统一
完整的 DNA条形码参考数据库, 才能快速实现对
已知物种的准确鉴定以及新种和隐存种的发现。
借助已有较好 DNA 条形码研究类群的数据
库, 我们尝试通过 DNA 条形码技术, 将这些材
料进行准确的物种鉴定。 例如, Liu 等 (2011)
利用 4 个叶绿体片段 ( rbcL、 matK、 trnL鄄F、
trnH鄄psbA) 和 1 个核基因片段 ( ITS), 将分布
于欧亚地区的红豆杉属 (Taxus) 植物鉴定为 11
个种, 即欧洲红豆杉 (T. baccata)、 密叶红豆杉
(T. fuana)、 东北红豆杉 (T. cuspidata)、 苏门答
腊红豆杉 (T. sumatrana)、 喜马拉雅红豆杉 (T.
wallichiana s. s. )、 红豆杉 (T. chinensis)、 南方
红豆杉 (T. mairei), 和 4 个新分类群或隐存种,
图 1摇 基于 matK序列用 p距离构建的邻接树
Fig. 1摇 Unrooted neighbor鄄joining (NJ) tree based on matK data with p鄄distance
5966 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 曾春霞等: 应用 DNA条形码对植物标本的核查摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 2摇 基于 matK序列用 p距离构建的邻接树
Fig. 2摇 Unrooted neighbor鄄joining (NJ) tree based on matK data with p鄄distance
696摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
表 1摇 样品编号 Z5376、 Z5377、 D0705、 Z0300 和 D3577 BLAST分析结果
Table 1摇 BLAST results of samples of Z5376、 Z5377、 D0705、 Z0300 and D3577
Query_ID
(sample ID_barcode) Query_species
Blast_species
(GI number_species name) Query Coverage Identity
Z5376_rbcL Paspalum thunbergii 218175479_Typha domingensis 718 99. 86
Z5376_matK Paspalum thunbergii 90967927_Typha angustifolia 861 99. 65
Z5376_trnH鄄psbA Paspalum thunbergii 166244620_Typha angustata 703 98. 86
Z5377_rbcL Typha angustata 341872831_Paspalum thunbergii 720 99. 72
Z5377_matK Typha angustata 440576753_Paspalum urvillei 813 99. 26
Z5377_trnH鄄psbA Typha angustata 341939337_Paspalum thunbergii 641 99. 84
Z5377_ITS Typha angustata 341872750_Paspalum thunbergii 599 99. 67
D0705_rbcL Clerodendrum serratum 290586059_Vitex negundo 678 99. 41
D0705_matK Clerodendrum serratum 24430461_Vitex quinata 755 99. 34
D0705_trnH鄄psbA Clerodendrum serratum 331704877_Vitex quinata 435 99. 31
Z0300_rbcL Sambucus javanica 306482292_Sambucus sp. 643 100
Z0300_matK Sambucus javanica 379042244_Sambucus ebulus 775 99. 87
Z0300_trnH鄄psbA Sambucus javanica 343196454_Sambucus chinensis 392 99. 74
Z0300_ITS Sambucus javanica 343406909_Sambucus chinensis 611 99. 84
D3577_rbcL Sambucus javanica 306482292_Sambucus sp. 718 99. 44
D3577_matK Sambucus javanica 379042244_Sambucus ebulus 822 99. 76
D3577_trnH鄄psbA Sambucus javanica 343196452_Sambucus chinensis 406 97. 78
D3577_ITS Sambucus javanica 343406916_Sambucus chinensis 610 99. 18
即 Hengduan type ( = T. florinii Spjut ), Qinling
type, Tonkin type ( = T. colcicola) 和 Emei type
(Moeller等, 个人通讯) (图 4)。 我们建立的数据
库中, 红豆杉属材料共 7 份, 即 C0293、 D2198、
D2199、 D2200、 D2205、 E0960 和 Z2719, 基于形
态学鉴定均为 Taxus sp. 。 基于这 7 份样品已有的
条形码信息 (ITS、 rbcL 和 trnH鄄psbA), 从 NCBI
下载获得红豆杉属 47个个体的 ITS、 rbcL和 trnH鄄
psbA序列, 构建联合矩阵, NJ 树结果如图 5 所
示。 尽管仅使用了 3个 DNA条形码序列, 红豆杉
属的 11个种都构成了单系支。 数据库中测试样品
D2205与密叶红豆杉聚在一起, C0293、 D2199、
D2200 和 Z2719 与南方红豆杉聚为一支, D2198
和 E0960 则与 Tonkin type 遗传距离更接近。 由
此, 我们认为 D2205 应为密叶红豆杉, C0293、
D2199、 D2200 和 Z2719 为南方红豆杉, E0960
和 D2198 为灰岩红豆杉 Tonkin type。
3摇 植物 DNA条形码应用于物种鉴定的几
点思考
DNA条形码鉴定必要的前提是基于分类群变
异合适的标准条形码序列, 构建一个完备的物种
DNA条形码参考数据库。 构建植物 DNA 条形码
参考数据库的过程中, 有下列三个方面值得关注。
图 3摇 基于 matK序列用 p距离构建的邻接树
Fig. 3摇 Unrooted neighbor鄄joining (NJ) tree based on
of matK data with p鄄distance
7966 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 曾春霞等: 应用 DNA条形码对植物标本的核查摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 4摇 基于 rbcL、 matK、 trnH鄄psbA、 trnL鄄F和 ITS联合矩阵用 p距离构建的邻接树 (图片引自 Liu等, 2011)
Fig. 4摇 Unrooted neighbor鄄joining (NJ) tree based on rbcL、 matK、 trnH鄄psbA、 trnL鄄F and
ITS data with p鄄distance (Figure cited from Liu et al. 2011)
3. 1摇 物种鉴定准确
DNA条形码数据库的构建, 第一步是物种
材料的采集。 形态分类学研究是正确取样的基础
(Meyer和 Paulay, 2005; DeSalle, 2006)。 同时为
了保证物种的准确性, 取样还应涵盖物种的整个
分布区, 充分考虑居群的概念, 准确和较密集取
样, 尽可能最大限度地代表物种遗传多样性 (高
连明等, 2012)。
3. 2摇 物种与 DNA条形码对应关系准确
首先, 数据收集和管理应标准化和信息化。
DNA 条形码数据库构建过程中涉及样品采集、
DNA提取、 PCR扩增、 测序与拼接和序列分析。
每一步骤都应制定和遵守相应的标准规范, 如物
种命名、 凭证标本的存放、 图片及地理信息、 条
形码序列编号和管理、 数据分析等。 同时, 与计
算机网络技术相结合, 样品入库出库、 数据产生
和提取的过程, 引入信息化的数据管理。 一方面
便于数据的共享、 查询和实时更新, 另一方面避
免人为因素导致的样品混淆。
其次, DNA 条形码与实物库相关联, 利用
DNA条形码分析手段对凭证标本重新鉴定, 检验形
态分类结果。 DNA条形码序列必须与实物库, 即标
本库、 植物分子材料库和植物总 DNA 库相关联。
通过 DNA条形码分析手段, 将分析结果与原形态
鉴定结果相比较, 查询凭证标本的采集信息 (地理
分布、 生境、 海拔)、 标本图片等, 对凭证标本再
鉴定。 将形态分类与 DNA 条形码研究紧密结合,
保证 DNA条形码序列与物种的正确对应关系。
896摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
图 5摇 基于 ITS、 rbcL和 trnH鄄psbA联合矩阵用 p距离构建的邻接树
Fig. 5摇 Unrooted neighbor鄄joining (NJ) tree based on ITS、 rbcL and trnH鄄psbA data with p鄄distance
3. 3摇 演化关系复杂的类群需要多种方法验证
植物的演化较为复杂, 杂交或者基因渐渗、
近期辐射分化等现象较为普遍, 均可能导致物种
的界限模糊不清, 现有的 DNA 条形码难以有效
解决等。 这些困难类群的鉴定, 还需要开展有针
对性的探索研究, 如筛选其它合适候选条码或分
子标记等, 从而为构建完整的条形码数据库做好
充分的准备。
致谢摇 感谢中国科学院昆明植物研究所王红研究员在本
文撰写过程中提出的宝贵意见; 分子生物学实验中心袁
文斌助理工程师、 林春艳助理工程师和张金萍助理工程
师在 DNA条形码数据获取与拼接中的帮助。
9966 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 曾春霞等: 应用 DNA条形码对植物标本的核查摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
也参摇 考摇 文摇 献页
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