全 文 ：康乃馨 !氧化酶 #$%!的克隆及其反义植物 表达载体的构建! 张树珍!，，汤火龙，杨本鹏，刘飞虎! （! 云南大学生命科学与化学学院，云南 昆明 #$%%&!； 中国热带农业科学院热带作物
生物技术国家重点实验室，海南 海口 $’!!%!） 摘要：以康乃馨（!#$%&’( )#*+,-&+..’( ()）花瓣为材料，用改进的异硫氰酸胍一步法提取总
*+,，根据已报道的康乃馨 ,-- 氧化酶（!./0123454637837/29.!.4/8:3;5614 /41< 3;1）
基因的序列设计并合成一对引物，通过 *?.@-*方法获得一约 !AB:特异片段，把该片段连
接到 7CDE（*）.? 9/=5 F94G38上进行测序，其全长共 !!$#:7，编码区 &!$ :7，共编码 H%I个氨基
酸残基。序列分析结果表明该序列与 C92J/2B (H$!$中的康乃馨 ,--氧化酶基因的 4K+,序
列完全相符，推断该基因在康乃馨种内可能是完全或高度保守的。随后将此片段反向插入植
物表达载体 7JL!!的 H$M启动子和 +>M终止子之间，构建了一反义植物表达载体 7J>；又把
花特异表达启动子 @4N=,插入 7JL!!的 O12,--氧化酶基因反向插入中间载体 7-OJ的 Q:/L P M=G!位点构建成另一反义植物表达载体
7-J>。
关键词：康乃馨；,--氧化酶；*?.@-*；反义植物表达载体
中图分类号：R ’$，R &I$ 文献标识码：, 文章编号：%$H S ’%%（%%）%# S %’’$ S %#
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作者简介：张树珍（!&#$S）女，博士，主要从事植物抗逆保鲜基因工程和植物生物反应器的研究。 !#$%%& ’ () *+,) -.) /)#01-# -.- -.+# 234 *)5) 675* -.) #8)9+)# 7: !#$%&’( )#*+,-&+..’( ;’ +# .+*.1< 975#)/,)=’ >.) 234 *)5) 5-+#)5#) #)?0)59) !# -.)5 +5#)/-)= @)-!))5 -.) 3A, BCD 8/767-)/ 5= E4D -)/6+5-7/ +5-7 -.) )F8/)##+75 ,)9-7/ 8GH$I$’ >.+# )F8/)##+75 ,)9-7/ 911)= 8G4；>.)5 -.) :17!)/J#8)J 9+:+9 8/767-)/ K9.#2 !# :+/#- +5#)/-)= +5-7 -.) #+-)# 7: -.) )F8/)##+75 ,)9-7/ 8GH$I$L M+5=HHH N O@1，>.+# /)976@+55- 81#6+= 911)= 83MG，-.)5 +5#)/-)= -.) 234 5-+#)5#) *)5) +5-7 -.) #+-)# 7: -.) 81#6+= 83MG L O@H N D#-H ’ M)59) -.) 5-+#)5#) 815- )F8/)##+75 ,)9-7/ 83G4 !# 975#-/09-)=’ !#$%&’(：3/5-+75；233 7F+=#)；P>JK3P；25-+#)5#) 815- )F8/)##+75 ,)9-7/
康乃馨是一种典型的呼吸跃变型花卉，乙烯是其内源的衰老激素，花瓣衰老的最初反
应之一便是自动催化而产生乙烯，一方面是衰老过程产生乙烯，另一方面是产生的乙烯又
激活与衰老相关基因的表达进一步促进其衰老，并导致花朵最终凋谢变质（G7/79.7,等，
$QRQ；M55等，$QQB）。康乃馨花瓣衰老是植物在生理控制下的一种程序性器官死亡，在
程序性器官死亡的过程中蛋白酶、脂酶和核酸酶在降解蛋白质、脂肪和核酸中起重要作用
（G7/79.7,等，$QRQ ）；康乃馨花的衰老受乙烯的诱导，主要是由于乙烯能诱导康乃馨花瓣 半胱氨酸蛋白酶的表达，进而促使其蛋白质发生降解而启动花瓣的衰老（S75)# 等，$QQC）；乙烯能诱导康乃馨花瓣中脂酰基水解酶的表达，该酶对膜脂的脱脂作用使得膜的
完整性发生变化，因而启动其花瓣的衰老（M75*等，I%%%）；4/T)T等（$QQU）证实乙烯 在花瓣的衰老过程中还调节着 VE2的断裂，类似于动物中的编程式死亡。因而控制康乃 馨切花乙烯的生物合成，是延缓切花的衰老、延长其保鲜期的一条主要途径。233氧化酶 催化植物乙烯合成的最后一步即将 233（$ W氨基环丙烷 W $W羧酸）转化为乙烯。最新的 研究表明，H22能够促进乙烯产量的增加是通过乙烯自身诱导了 234基因的转录，234 可能也是乙烯生物合成途径中的一个限速酶，并且 234基因的表达是非组成型的，其转 录水平上的调控可能控制着乙烯的生成速率（2/X)5等，$QQU）。利用反义 PE2技术把康乃
馨 233氧化酶基因反向导入康乃馨优良品种中，可在一定程度上抑制其内源 233氧化酶
基因的表达，而抑制乙烯的生物合成，进而延缓其切花的衰老，从而使康乃馨切花的保鲜
期得以延长。将康乃馨 233氧化酶基因反向导入康乃馨中，获得了衰老延缓的康乃馨新
品系（37/5+#.等，$QQ$）。但国内还未见有这方面的报道。
为此我们首先采用 P>JK3P（P),)/#) -/5#9/+8-+75 871<6)/#) 9.+5 /)9-+75）技术分离、
克隆了康乃馨 233氧化酶的 9VE2并进行了序列分析，该序列与 Y)5G5Z ;BC$CI中康乃馨 233氧化酶基因的 9VE2序列完全相符。推断该基因在康乃馨种内可能是完全或高度保守 的。在此基础上，我们把康乃馨 233氧化酶基因的 9VE2序列分别以反向插入 3A[ BC# 启动子和花特异表达启动子 K9.#2的后面构建了两个反义植物表达载体，准备用于转化康 乃馨优良品种，以获得能延长插瓶寿命的康乃馨新品种。 ) 材料与方法 )*) 材料 康乃馨（!#$%&’( )#*+,-&+..’( ;’）切花取自云南农业大学花卉所；质粒载体 8GH$I$、8Y\AJ> ,)9-7/
#<#-)6、PE2提取试剂盒、2A[ P>#)和 41+*7（=>）$C为 K/76)*公司产品，>? VE2聚合酶、=E>K#、各种 限制性内切酶和 K3P 6/Z)/#购自华美生物产品公司，K3P产物纯化试剂盒购自大连宝生物工程公司，其 ]UU 云 南 植 物 研 究 I^卷 他化学常规试剂为国产分析纯。受体菌菌株 ! ! #$% #$%&’(由实验室保存。 !# 方法 )!*!) 康乃馨花瓣总 +,- 的提取及电泳分析 +,- 的提取采用 ./01(23 公司的总 +,- 提取试剂盒 （+,-2(456（+）7053& +,-$60&35804 9:65(1），方法按产品使用说明。+,-的电泳采用甲醛凝胶电泳。
)!*!* ;<,-第一链的合成 在一个 =!> 1&的 ?@@(4A0B管中加入 )!2 +,-（)=!&）和 )!2 C&820（A7）)>
（=!>!2 D!&，./01(23公司产品），加 +436(EB/(( F*C至 )>!&，置 G=H水浴 > 184后冷却至室温，再依次加入：
> I B8/65 65/34A %’BB(/ >!&、*!> 1J A,7.6 )!&、/+,3684（K= ’ D!&）)!&、K= 1J焦磷酸钠 *!>!&、-JL反转录酶
（M= ’ D!&）=!>!&，再加水至终体积为 *>!&，于 K*H水浴 N= 184，M>H水浴 > 184以灭活反转录酶，置 O
*=H备用。
)!*!P .Q+扩增 .Q+扩增所用引物是根据 R(4S34T #P>)>*中的康乃馨 -QQ氧化酶的 ;<,-序列设计的
并由上海生工生物工程公司合成，引物序列为：上游引物 .)：>URQ7Q7-R-7777R777-7R777-7R7 PU，下
游引物 .*：>URRR-RQ7Q-Q77----RR--RQ7Q7PU，以合成的 ;<,- 第一链为模板，采用 73V <,- @0&:E
1(/36(进行扩增，反应体系为：;<,-第一链反应液 )=!&，73V <,- @0&:1(/36( %’BB(/ >!&，*!>!J J2Q&*
（-P>)S）K!&，* 1J A,7.6 K!&，.)（)= @10& D!&）*!>!&，.*（)= @10& D!&）*!>!&，73V <,- @0&:1(/36(（> ’ D
!&）=!>!&，AAF*C )N!>!&，总体积为 >=!&。反应条件为：预变性 MKH，> 184；循环参数为 MKH，) 184；
>)H，K= 6；G*H，) 184 *= 6；P> ;:;&(6，最后 G*H，)= 184。.Q+产物经 )W琼脂糖凝胶电泳后，切下目
的带，用 .Q+产物纯化试剂盒回收。
)!*!K .Q+ 产物的序列测定 把纯化出的目的片段与 @R?J（+）E7 (36: X(;50/ 相连，再转化 ! ! #$% #) %&’(，挑取白色菌落，碱法提取质粒，电泳后取滞后质粒用 ?;0+$内切酶酶切分析，挑出能切出约 )!*T%
片段的菌落，大量提取质粒并经 .?R纯化后，用 -S$PGG型自动测序仪进行测序。 )!*!> 康乃馨 -QQ氧化酶 ;<,-反义植物表达载体的构建 -Y 反义植物表达载体 @SC的构建 将重组质粒 @RC>用 %3$ Z 93;$完全酶解后电泳回收小片段（含 目的基因）；@S$)*)质粒也用 %3$Z 93;$酶切，电泳回收大片段，然后进行定向连接反应，连接产物转化
! ! #$% #)感受态细胞、碱法提取质粒，取电泳谱带滞后的质粒 <,-作 %3$ Z 93;$酶切图谱分析。 SY 反义植物表达载体 @QSC的构建 先将表达载体 @S$)*)用 F84A $$$ Z %3&酶解完全，回收大片段； 再把带有花特异表达启动子的质粒 @QF9-.也用 F84A$$ $Z %3& 酶切完全，回收小片段（含 .;[6-启动 子），然后进行定向连接，连接产物转化 ! ! #$% #)，用上述同样方法筛选出重组质粒 @QFS，@QFS又用
%3$Z 93;$完全酶解，电泳回收大片段；@RC>用 %3$Z 93;$酶切，再电泳回收小片段，然后进行定向连
接，连接产物转化 ! ! #$% #)，碱法提取质粒，取电泳谱带滞后的质粒 <,-作酶切图谱分析。 # 结果与分析 #!$%&的完整性
从康乃馨花瓣提取的总 +,-用紫外吸收法测定其浓度及 C<*N= D C<*\=比值。+,-的提
取利用 ./01(23 公司的总 +,- 提取试剂盒，该法采用异硫氰酸胍和O 巯基乙醇两种
+,36(抑制剂来抑制 +,36(活性，同时异硫氰酸胍和十二烷基肌氨酸钠的联合使用，将促
使核蛋白复合体的解离，使 +,-与蛋白质分离，并将 +,-释放到溶液中。由于 +,-在碱
性条件下不稳定，因而整个提取过程中反应体系始终保持酸性至中性，而在该环境下
<,-极少发生降解，同蛋白质一起变性后被离心下来，+,-仍溶于上清液中，最后可用
异丙醇加以沉淀。该法通过苯酚 D氯仿 D异戊醇两次抽提，提取的总 +,-纯度高，C<*N= D
C<*\=比值为 )!M=，通过甲醛凝胶电泳分析，产生 P条清晰条带，其中 *\6/+,-的亮度约
GGGN期 张树珍等：康乃馨 -QQ氧化酶 ;<,-的克隆及其反义植物表达载体的构建
图 ! 康乃馨
花瓣#$甲醛 凝胶电泳图谱 %&’( !$)
’*+,-. ’./ ,0
0,+1*/2.342.
./.56+,73,+.6,’+*1 0,+
#$,0 8*+9*) 6&,9 7.6*/- 为 !:-+#$的两倍（图 !），说明利用该法所提取的总 #$不仅纯度高而 且完整性好，完全可满足逆转录 5;#$的要求。
!! #$%产物的鉴定 将 <8产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，其扩增片段大小约 !=>?@（图 >），与设计的结果相符。将此片段回收后与 7ABC（）)D).*-4 E.56,+相连，获 得重组质粒 7AFG，7AFG经 B5,H酶切能切下约 !=>?@的片段，说明 !=>?@ 片段已经插入 7ABC（）)D).*-4 E.56,+中。 !& 序列测定及分析 本实验所获得的康乃馨$88 氧化酶 5;#$经序列测定，该片段全长 !!GI@7，包含 J!G @7 的编码序列，编码 KLM 个氨基酸。经比较该序列与 A.9N*9? OKG!G>中的序列完全一致，说明我们得到的康乃馨$88氧化酶的
5;#$是正确的，并推断该基因在康乃馨种内可能是完全或高度保守的（序 列略）。 !’ 康乃馨 ($$氧化酶基因反义植物表达载体的构建 康乃馨$88氧化酶的反义基因插入植物表达载体 7NH!>!的 P@*H Q R*5H
位点后（即取代了 7NH!>! 中的 ASR 基因），转化 ! = #$% PO! 感受态细胞， 经筛选转化子，用滞后质粒作 P@*H Q R*5H双酶切鉴定，所切下的片段大小 图 > <8产物电泳谱带 %&’( >$’*+,-. ’./
./.56+,73,+.6,’+*1 ,0 <8
7+,2T56-
! ( <8 C*+?.+-； >(
<8 7+,2T56- ,0 5;#$.95,2&9’$88 ,U&2*-. ,0
8*+9*6&,9
与预期结果相符，说明构建正确，该重组质粒被命名为 7NF。反义植
物表达载体 7NF的质粒图谱如图 K所示，其酶切鉴定结果见图 M。
另外再用花特异表达启动子 <53-$取代植物表达载体 7NH!>!中 的 8*CV KGR启动子，构建成带花特异表达启动子的植物表达载体 78WN；同样再把康乃馨$88氧化酶的反义基因插入花特异表达启动
子的植物表达载体 78WN的 P@*H Q R*5H位点后（即取代了 78WN中的
ASR基因），转化 ! = #$% PO!感受态细胞，经筛选转化子，其滞后质 粒分别用 P@*H Q R*5H和 W&92HHH Q P@*H双酶切鉴定，所切下的片段分 别约为 !=>?@和 L=G?@，均与预期结果相符，该质粒即为花特异表达 的康乃馨$88氧化酶基因反义植物表达载体，命名为 78NF。康乃馨
$88氧化酶基因反义植物表达载体 78NF的图谱如图 G所示，其酶切 鉴定结果见图 I。 图 K 康乃馨$88氧化酶基因反义植物表达载体 7NF的质粒图谱
%&’( K 8*+9*6&,9 $8F$96&-.9-. 7/*96 .U7+.--&,9 E.56,+ 7NF
:XX 云 南 植 物 研 究 >M卷
图 ! 酶切鉴定反义植物表达载体 #$%&’( ! )*+*,+&-. -/ +0* 1.+&2*.2* *34*22&-. 5*,+-4 #$ 67 *.8791+&, :&’*2+&-.
; ( #<;=; > ?61< @ A1,<；=( BCD E14F*42（;G!H6，
II!6，JIG6，G;G6，HKK6，=HK6）；
H( #$> ?61< @ A1,< 图 J 酶切鉴定反义植物表达载体 C#$
%&’( J )*+*,+&-. -/ +0* 1.+&2*.2* *34*22&-. 5*,+-4
C#$67 *.8791+&, :&’*2+&-. ;( #<;=; > L&.:<<< @ ?61M；=( C#$ > L&.:<<< @ ?61M（GNN6）；
H( BCD E14F*42（;G!H6，II!6，JIG6，G;G6，HKK6，=HK6）；
!( C#$> ?61< @ A1,<（;( =F6）G( #<;=; > ?61< @ A1,< 图 G 康乃馨 OCC氧化酶基因反义植物表达载体 C#$的质粒图谱
%&’( G C14.1+&-. OC$O.+&2*.2* M1.+ *34*22&-. 5*,+-4 C#$
! 讨论
康乃馨是一种典型的呼吸跃变型花卉，乙烯是其内源的衰老激素。利用反义 DPO技
术抑制其乙烯的生物合成从而延长鲜切花的观赏寿命，在理论上是可行的。国外 C-4.&20
等（;II;）已将康乃馨 OCC合成酶基因反向导入康乃馨中，获得了衰老延缓的康乃馨新
品种。但国内还未见有这方面的报道。我们拟利用反义 DPO技术把康乃馨 OCC氧化酶基
因反向导入康乃馨中，以获得能延长切花插瓶寿命的康乃馨新品种。我们首先采用 DQ R
BCD（D*5*42* +41.2,4&+&-. -M79*412* ,01&. 4*1,+&-.）技术分离、克隆了康乃馨 OCC氧化酶的
,)PO并进行了序列分析，该序列与 S*.#1.F THG;G=中的康乃馨 OCC氧化酶基因的 ,)PO
序列完全相符，推断该基因在康乃馨种内可能是完全或高度保守的。这提示我们，可利用
该基因的反义基因在康乃馨的任何品种（!#$%&’( )#*+,-&+..’( T(）的转基因计划中，它不 受品种类群的限制。 康乃馨 OCC 氧化酶基因在自然衰老过程中是在花器官中被诱导表达（O4U*. 等， ;IIK）。如采用组成型启动子驱动康乃馨 OCC氧化酶的反义基因在康乃馨中表达，那么该 反义基因在康乃馨发育的任何时期及植株的任何部位均可表达，它的表达不仅造成植株内 部资源的浪费，可能还会在一定程度上影响植株的正常生长。如果采用花特异表达启动子 驱动康乃馨 OCC氧化酶的反义基因在康乃馨花中特异表达，而在植株的其它部位并不表 达，这样不会造成植株内部资源的浪费，从而不影响植株的正常生长，也因其只特异地在 花中表达，只抑制花中乙烯的生物合成，延长花期的效果可能会更好。B,02O是光依赖性 IKKJ期 张树珍等：康乃馨 OCC氧化酶 ,)PO的克隆及其反义植物表达载体的构建 的并在花器官中特异表达的启动子，在 !诱导条件下也在实生苗中低水平的表达（#$%&’(
等，)**+）。有鉴于此，我们分别以组成型的 ,-. /0启动子和花特异表达启动子 12345
为启动子构建康乃馨 5,,氧化酶基因的反义植物表达载体转化康乃馨，目的在于进一步
比较康乃馨 5,,氧化酶反义基因的组成型表达和组织特异性表达（即花特异表达）对其
目的基因表达的抑制效果，以便能更好地筛选出耐储运、保鲜期长的康乃馨新品种。同时
也可为应用反义 675技术培育植物新品种在选择表达调控元件方面提供一定依据。目前
遗传转化康乃馨栽培品种的工作正在进行当中。
〔参 考 文 献〕
5&89$:9$ ;-<9，=&$4: >?，)**@A =:3BC9$9 D’E4B$:39:’2 %9$94 -&9 (’FF9&9$:’-CCB 9GH&9449( (I&’$% 2-&$-:’E$（!#$%&’( )#*+,-&+..’( JA） FCEK9& 49$9429$29［>］A /.#$% 0,.1)’.#* 2,.,3+，!：L*—*@
ME&E23E< 5，?EE(4E$?6，)*L*A 13B4’ECE%B -$( D’E239N’4:&B EF FCEK9& H9:-C 49$9429$29［>］A 4,*% 51-，##：)0—O/
,E&$’43 =,，M-I(’$9::9 P,，Q&-3-N ?.， 1% #.，)**)A =GH&944’E$EF -$:’49$49 9:3BC9$9 FE&N’$% 9$RBN9 ’$:&-$4%9$’2 2-&$-:’E$［5］A /)4: 5$$I-C Q9$9&-C .99:’$% EF :39 5I4:&-C’-$ PE2’9:B EF 1C-$: 13B4’ECE%’4:4，5I4:&-C’-$ 7-:’E$-C !$’<9&4’:B［,］，S T O U2:ED9&
5I4:&-C’-$7-:’E$-C !$’<9&4’:B，-D4:&-2: 7EA V0 ;-$-$#:R3-W’，?’CC’-N 6，?EE(4E$，)**/ A ,3-&-2:9&’R-:’E$EF -$ 9:3BC9$9X&94HE$4’<9 %CI:-:3’E$9 PX:&-$4F9&-49 %9$9 2CI4:9& ’$ 2-&$-X :’E$［>］A /.#$% 0,.1)’.#* 2,.,3+，$$：O/—0L ;E$% Y，?-$% Z?，;I(-W [5， 1% #.，S+++A 5$ 9:3BC9$9X’$(I29( 2\75 9$2E(’$% - C’H-49 9GH&9449( -: :39 E$49: EF 49$9429$29［>］A /*,) 6#%. 7)#8 9) :97，%&（)0）：L@)@—L@S@ #$%&’( .，<-$(9& .99&，,E&$9C’4 =A PH9C:， 1% #.，)**+ A 1&ENE:9& -$-CB4’4 EF :39 23-C2E$9 4B$:3-49（234 5）%9$9 EF /1%’$# &+;*< 8#：- V@ DH H&ENE:9& &9%’E$ (’&92:4 FCEK9&X4H92’F’2 9GH&944’E$［>］A /.#$% 0,.1)’.#* 2,.,3+，#’：*0—)+*
JE$94 .J，J-&49$ 1M，?EE(4E$?6，)**0 A =:3BC9$9X&9%IC-:9( 9GH&944’E$EF - 2-&$-:’E$2B4:9’$9 H&E:9’$-49 (I&’$% FCEK9& H9:-C 49$94X 29$29［>］A /.#$% 0,. 2,.，$(（/）：0+0—0)S
U&R-9R \，Q&-$9CC 5，)**@ A \75 F&-%N9$:-:’E$’4 &9%IC-:9( DB 9:3BC9$9 (I&’$% 2-&H9C 49$9429$29 ’$ /(’= (#%>’=［>］A ?&1 /.#$%
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+L@ 云 南 植 物 研 究 SO卷