全 文 ：东俄洛橐吾遗传变异与分化的 ISSR 分析
?
王金凤1 , 2 , Chiaki kuroda3 , 龚 洵1
??
( 1 中国科学院昆明植物研究所 , 云南 昆明 650204; 2 中国科学院研究生院 , 北京 100049;
3 Department of Chemistry, Rikkyo University, Tokyo 171 - 8501 , Japan)
摘要 : 应用 ISSR 标记对东俄洛橐吾 ( Ligularia tongolensis) 的遗传多样性进行了研究。从 100 个引物中筛选出
8 个用于正式扩增。在所研究的 8 个居群共 150 个个体中检测到 148 个多态位点。在居群水平上 , 多态位点
百分率 ( PPB) 为 50.45% , Nei′s基因多样性指数 ( H) 和 Shannon信息指数 ( I ) 分别为 0 .1595 和 0.2440。
在物种水平上 , 多态位点百分率 ( PPB) 为 88 .10% , Nei′s基因多样性指数 ( H) 和 Shannon信息指数 ( I )
分别为 0 .2811 和 0.4279。居群间的遗传分化系数 ( Gst ) 达 0.4355。研究结果表明东俄洛橐吾的遗传多样性
水平很高 , 居群间遗传分化较大。这与其多样化的生态环境是有必然联系的。因适应其多样化的生态环境
而形成了遗传多样性 ; 且因其生态环境的不连续性阻碍了居群间的基因交流而产生了遗传分化 , 即东俄洛
橐吾高水平的遗传多样性和遗传分化是适应其分布区多样化生态环境的结果。
关键词 : 东俄洛橐吾 ; 居群 ; 遗传多样性 ; 遗传分化
中图分类号 : Q 16 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2007) 05 - 537 - 06
Assessment of Genetic Variation and Differentiation of Ligularia
tongolensis ( Compositae) Detected by ISSRs
WANG Jin-Feng1 , 2 , Chiaki kuroda3 , GONG Xun1 **
(1 Kunming Instituteof Botany, ChineseAcademy of Sciences, Kunming 650204 , China;
2 GraduateSchool of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049 , China;
3 Department of Chemistry, Rikkyo University, Tokyo 171 - 8501 , Japan)
Abstract: The genetic diversity of Ligularia tongolensis ( Franch .) Hand .-Mazz .was analyzed by inter-simple sequence
repeat markers (ISSR) . Eight informativeand reliable primerswere chosen from100 pre-screened primers, of which, 148
ISSR loci were polymorphic . Genetic diversity was high with PPB = 50 .45 % , H = 0 .1595 and I = 0 .2440 at population
level ; PPB= 88 .10 % , H = 0 .2811 and I = 0 .4279 at species level . The Gst = 0 .4355 indicated ahigh degree of genetic
differentiation occurred among L . tongolensis populations . The main factor responsible for the high level genetic diversity
and genetic differentiation among populations ascribed to diversified habitats diversification . Geneflow was inhibited by its
habitats discontinuitywhich finally caused the genetic differentiation .
Key words: Ligularia tongolensis (Franch .) Hand .-Mazz .; Population; Genetic diversity; Genetic differentiation
东俄洛橐吾 ( Ligularia tongolensis ( Franch .)
Hand .-Mazz .) 是 菊 科 ( Compositae) 千 里 光 族
(Tribe Senecioeae) 橐吾属伞房组羽脉系植物。为
多年生草本 , 根肉质 , 茎直立 , 伞房状花序 , 稀
头状花序单生 , 瘦果圆柱形 , 产西藏东南部 , 云
南西北部 , 四川 西 南 部 至西 北 部 , 生于海拔
2 140～4 000 m的山谷湿地、林缘、林下、灌丛
及高山草甸 ( 刘尚武 , 1989) 。橐吾属包括 6 组、
云 南 植 物 研 究 2007 , 29 (5) : 537～542
Acta Botanica Yunnanica

?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : gongxun@ mail. kib. ac. cn
收稿日期 : 2006 - 12 - 30 , 2007 - 04 - 09 接受发表
作者简介 : 王金凤 , 女 , 在读硕士研究生 , 主要从事群体遗传学研究。 ?
基金项目 : 国家自然科学基金 (30670210 )
11 系、129 种 , 所有种类均分布在亚洲 , 仅 2 种
扩散至欧洲。在东亚地区有 119 种 , 占该属总数
的 96%。高度集中在横断山区的有 4 组 , 6 系 ,
67 种 , 其中 61 种为特有种 , 占该属总组数的
66% , 总系数的 54 .5% , 总种数的 52% , 这个
事实表明了横断山区是该属的多样化和分布中
心。本属的现代分布中心在横断山区 , 而初始起
源中心则在中国中部 ( 包括四川东部 ) , 因此是
一个起源中心与分布中心不在同一地区的属 ( 刘
尚武等 , 1994 )。所以 , 该属被认为是研究横断
山区植物物种起源与多样化的好类群。
前人在居群水平上对橐吾属植物以化学成分
和 DNA 序列研究橐吾属植物的遗传多样性 , 以
期探讨其物种多样化的形成机制以及青藏高原抬
升的生物效应 , 研究结果表明 , 在 19 个东俄洛
橐吾 ( Ligularia tongolensis) 居 群 中 存 在 5 个
atpB- rbcL 单倍体型 ( Haplotype) , 在 10 个黄帚橐
吾 ( L . pleurocaulis) 中存在 2 个 ITS 单倍体型和 5
个 atpB- rbcL 单倍体型 ( Hanai 等 , 2005; Nagano
等 , 2006; Tori 等 , 2006)。作者认为东俄洛橐吾
正处于激烈的分化阶段。鉴于此 , 本文采用分子
标记 ISSR 对东俄洛橐吾的遗传变异与遗传分化
进行了研究 , 旨在揭示东俄洛橐吾的遗传多样性
水平和遗传结构 , 探讨其遗传变异在居群水平上
的分布式样 , 并结合东俄洛橐吾生态环境的多样
性来探讨其种系的分化格局。
1 材料和方法
1 .1 实验材料背景资料
在东俄洛橐吾的分布区内 , 按居群进行取样 , 共采
集 8 个居群 , 每个居群的详细资料见表 1 和图 1。每个
个体采取 2～3 片无病斑的嫩叶 , 用硅胶干燥 , 4℃保存
至提取 DNA。
1 .2 DNA 的提取与 PCR 扩增
取 0 .1 g左右硅胶干燥的叶片 , 采用改良 CTAB 法提
取植物总 DNA (Doyle, 1991)。
PCR 反应在 GeneAMP PCR 仪上进行。其 20μL 的反
应体系为 : 灭菌水 13 .3μL , formamide 0 .3μL , 10×PCR
buffer 2 .0 μL , 25 mmol?L 的 Mg2 + 1 .6 μL , 2. 5 mmol?L 的
dNTP (大连宝生物 ) 1 . 2lμL , 10μmol?L 的引物 (上海博
亚) 0 . 4μL , 5 u?μL 的 Taq酶 (大连宝生物) 0 . 2μL , 20 ng?
μL 的 DNA 模板 1μL。扩增程序 : 94℃ 7 min, 1 个循环 ;
然后 94℃ 45 s, 53 或 54℃ 1 min, 72℃ 2 min, 共 35 个循
环 ; 最后 72℃ 7 min, 1 个循环。电泳条件 : PCR 扩增产
物以 1 .5%的琼脂糖凝胶电泳 , 0 .5 %EB染色 , 0 . 5×TBE
缓冲液和 4 V?cm的电压电泳分离。
1 .3 数据分析
将 ISSR 电泳胶图记录后进行人工读带 , 以 100 bp
DNA ladder为分子量标准 , 同一引物扩增的电泳迁移率
一致的条带被认为具有同源性 , 属于同一位点的产物。
按扩增阳性计为 1 , 扩增阴性计为 0 的格式构成 ISSR 表
型数据矩阵 , 采用 POPGENE1.32 软件 ( Yeh 等 , 1997 )
计算出东俄橐吾各居群的 Nei′s 基因多样性指数 ( H )、
Shannon信息指数 ( I )、多态位点百分率 ( PPB)、基因
分化系数 ( Gst )、基因流 ( Nm = (1 - Gst )?4Gst )、居群
内基因多样度 ( Hs) 和总的基因多样度 ( Ht)。
表 1 用于本研究的 8 个居群的样品来源
Table 1 Information of 8 Ligularia tongolensis populations for ISSR analysis
居群代号 Code 居群分布地 Population 采样数 Sample 纬度 Latitude 经度 Longitude 海拔 Elevation ( m)
DBSH 云南香格里拉县 17 ?27 {°27′N 99 °65′E 3200
大宝山 Dabaoshan
SHKSH 云南香格里拉县 20 ?27 {°50′N 99 °41′E 3500
石卡山 Shikashan
GZ 云南香格里拉县 16 ?28 {°26′N 99 °55′E 3500
格咱 Gezan
XHSH 云南香格里拉县 20 ?28 {°49′N 99 °78′E 3600
小恒山 Xiaohengshan
NX 云南香格里拉县 17 ?28 {°03′N 99 °25′E 3520
尼西 Nixi
WMSH 云南省禄劝县 20 ?24 {°63′N 103 4°12′E 3200
乌蒙山 Wumengshan
XXSH 云南省香格里拉县 20 ?28 {°80′N 99 °59′E 3700
小雪山 Xiaoxueshan
LCH 四川省木里 20 ?27 {°76′N 101 4°33′E 3700
林场 Linchang
835 云 南 植 物 研 究 29 卷
图 1 东俄洛橐吾的取样分布图 (居群代号同表 1 )
Fig . 1 Map showing locations of the 8 sampled L . tongolensis populations . Population codes are the same as those in Table 1
2 实验结果
2 .1 引物筛选结果
从哥伦比亚大学设计 ( 上海博亚生物技术有
限公司合成 ) 的 100 条引物中筛选出 8 个条带清
晰、稳定性和重复性好且相对较多条带的引物用
于全部样品的 PCR 扩增 (表 2)。
部分引物的扩增结果如图 2 和图 3。
2 .2 遗传多样性和遗传分化分析
表 2 本研究选用的 8 个引物和扩增条件及检测到的位点数
Table 2 Attributes of ISSR primers used to generate ISSR markers for 150 individuals of L . tongolensis sampled from 8 populations
Primer
Sequence
(5 |′to 3′)
Annealing temperature
( ℃ )
No X.of scorable
bands
No ?.of poly-morphic
bands
Polymorphism
( % )
UBC809 ?( AG)8 ?G 54 20 17 85 .00
UBC818 ?( CA )8 ?G 54 22 ?19 86 .36
UBC823 ?( TC) 8 ?C 53 23 ?22 95 .65
UBC834 ?( AG) 8 YT 53 15 ?11 73 .33
UBC845 ?( CT)8 RG 53 21 ?19 90 .48
UBC856 ?( AC) 8 YA 53 20 ?18 90 .00
UBC857 ?( AC)8 ?YG 53 23 19 82 .61
UBC873 ?( GACA )4 h53 24 ?23 95 .83
Total 168 ?148 &88 .10
图 2 引物 857 对 SHKSH 居群部分样品的扩增样式
Fig . 2 Part of electrophoresis of PCR products of
Population SHKSH via primer 857
图 3 引物 873 对 GZ 居群部分样品的扩增样式
Fig . 3 Part of electrophoresis of PCR products of
Population GZ via primer 873
9355 期 王金凤等 : 东俄洛橐吾遗传变异与分化的 ISSR 分析
对东俄洛橐吾 8 个居群共 150 个个体的群体
遗传分析表明东俄洛橐吾的遗传多样性水平很
高。在检测到的所有清晰且重复性好的 168 个有
效位点中有 148 个多态位点。在物种水平上 , 多
态位点百分率 ( PPB) 为 88 .10% , Nei′s 基因多
样性指数 ( H) 和 Shannon信息指数 ( I ) 分别为
0 .2811 和 0 .4279 , 基因多样度 ( Hs) 和总基因
多样度 ( Ht) 分别为 0 .1595 和 0 .2825。从各个
居群 来 看 , 石 卡 山 居 群 ( SHKSH, PPB =
39 .88% ) 多态位点百分率最低 , 而大宝山居群
(DBSH , PPB = 62 .5% ) 的最高 , 格咱居群和小
雪山居群的处于中等水平 , 结果见表 3 和表 4。
居群间 的 Nei′s 基 因分 化系 数 ( Gst ) 是
0 .4355 , 表明在物种水平上 , 有 56 .45% 的遗传
变异存在于居群内 , 而 43 .55%的遗传变异存在
于居群间 , 居群之间表现出较高水平的遗传分
化。居群间的基因流 ( Nm = 0 .5 ( 1 - Gst )?Gst )
为 0 .6482。
2 .3 聚类分析
从聚类图看 , 大宝山居群 (DBSH) 与乌蒙
山居群 ( WMSH) 聚为一支 , 其他 6 个居群聚为
另一支。从地理上看 , 乌蒙山居群与其他居群的
地理距离很远 ; 但聚类分析结果显示 , 乌蒙山居
群与云南西北部的大宝山居群聚在一起而与其他
6 个居群分开 , 即其遗传距离与地理距离没有显
著的相关性 ; 而其余 6 个居群的聚类分析也得到
同样的结果 , 如格咱居群 ( GZ) 与石卡山居群
(SHKSH) 聚到一起 , 但地理上这两个居群被尼
西居群 (NX) 所隔开。
图 4 东俄洛橐吾的 UPGMA 聚类图 ( 居群代号同表 1)
Fig . 4 UPGMA dendrogram of L . tongolensis . Population
codes are the same as those in Table 1
表 3 东俄洛橐吾自然居群内的遗传多样性
Table 3 Genetic variation in natural populations of Ligularia tongolensis
居群
Population
观察等位基因数
Na
有效等位基因数
Ne
Nei′s基因多样性
H
Shannon 信息指数
I
多态位点百分率
PPB%
DBSH 1 ?. 6250±0 .4856 1 .3378±0 &. 3458 0 ?. 2049±0 o. 1883 0 .3119±0 . 2712 62 v. 50
SHKSH 1 ?. 3988±0 .4911 1 .2040±0 &. 3170 0 ?. 1239±0 o. 1764 0 .1899±0 . 2578 39 v. 88
GZ 1 ?. 5119±0 .5014 1 .2507±0 &. 3175 0 ?. 1556±0 o. 1801 0 .2401±0 . 2638 51 v. 19
XHSH 1 ?. 5357±0 .5002 1 .2959±0 &. 3442 0 ?. 1786±0 o. 1907 0 .2710±0 . 2765 53 v. 57
NX 1 ?. 5000±0 .5015 1 .2539±0 &. 3301 0 ?. 1549±0 o. 1842 0 .2374±0 . 2680 50 v. 00
WMSH 1 ?. 4167±0 .4945 1 .2245±0 &. 3316 0 ?. 1343±0 o. 1842 0 .2038±0 . 2675 41 v. 67
XXSH 1 ?. 5119±0 .5014 1 .2561±0 &. 3313 0 ?. 1566±0 o. 1832 0 .2407±0 . 2664 51 v. 19
LCH 1 ?. 5357±0 .5002 1 .2704±0 &. 3267 0 ?. 1670±0 o. 1820 0 .2572±0 . 2659 53 v. 57
居群水平 Mean 1 ?. 5045±0 .4970 1 .2617±0 &. 3305 0 ?. 1595±0 o. 1836 0 .2440±0 . 2671 50 v. 45
物种水平 1 ?. 8810±0 .3248 1 .4681±0 &. 3364 0 ?. 2811±0 o. 1688 0 .4279±0 . 2274 88 v. 10
表 4 东俄洛橐吾的遗传一致度 ( 对角线上方 ) 和遗传距离 (对角线下方 )
Table 4 Nei′s (1972) original measures of genetic identity ( above diagonal) and genetic distance ( below diagonal)
Code DBSH SHKSH GZ XHSH NX WMSH XXSH LCH
DBSH * * * * 0 . 8331 0 <. 8141 0 Q. 8254 0 f. 8160 0 {. 8362 0 ?. 8136 0 .8393
SHKSH 0 ?. 1826 * * * * 0 <. 8504 0 Q. 8536 0 f. 8213 0 {. 7966 0 .8728 0 .8239
GZ 0 ?. 2056 0 . 1620 * * * * 0 Q. 8537 0 f. 7988 0 {. 7629 0 .8589 0 .8019
XHSH 0 ?. 1919 0 . 1583 0 <. 1581 * * * * 0 f. 8879 0 {. 8161 0 .8836 0 .8511
NX 0 ?. 2033 0 . 1968 0 <. 2247 0 Q. 1189 * * * * 0 {. 7804 0 .8716 0 .8654
WMSH 0 ?. 1789 0 . 2274 0 <. 2706 0 Q. 2033 0 f. 2480 * * * * 0 .8003 0 .8206
XXSH 0 ?. 2063 0 . 1361 0 <. 1521 0 Q. 1238 0 f. 1375 0 {. 2228 * * * * 0 .8757
LCH 0 ?. 1752 0 . 1937 0 <. 2208 0 Q. 1613 0 f. 1446 0 {. 1977 0 .1327 * * * *
045 云 南 植 物 研 究 29 卷
3 讨论
3 .1 东俄洛橐吾的遗传多样性和遗传结构
Hanai 等 ( 2005 ) 对东俄洛橐吾的化学成分
和叶绿体 DNA 的非编码区间 atpB～ rbcL 的核苷
酸序列进行了研究 , 在居群水平上 , 东俄洛橐吾
的化学成分和 atpB～ rbcL 的核苷酸序列均存在
一定的差异 , 有 5 种 atpB～ rbcL 单倍体型。本
研究中 东 俄洛 橐吾 8 个自 然 居 群 的 PPB =
88 .10% , Nei′s 基因 多 样性 指 数 H = 0.2811 ,
Shannon信息指数 I = 0 .4279 , 基因多样度 ( Hs)
和总基因多样度 ( Ht) 分别为 0.1595 和 0.2825 ,
Gst = 0 . 4355 , 说明 43 .55% 的变异存在于种群
间 , 群体内的变异占了总变异的 56 .45%。表明
东俄洛橐吾的遗传多样性水平很高 , 种群内有较
丰富的遗传变异 , 与 Hanai 等的研究结果一致。
Nybom ( 2004) 总结了 158 份 RAPD、27 份 AFLP、
13 份 ISSR 的研究结果所得出的 Gst平均值分别是
0 .27、0 .21 和 0 .34。与 Nybom所得出的平均值
相比 , 东俄洛橐吾 8 个自然居群呈现出了居群间
遗传分化大的特点。
影响物种遗传多样性的因素很多 , 如分布范
围、生活型、繁育系统、种子散布机制等等。一
个物种的遗传多样性是该物种长期进化的产物 ,
是各种因素综合作用的结果 , 并且不同因素的相
互作用往往会产生不同的结果。而东俄洛橐吾之
所以会表现如此高的遗传多样性水平与其多样化
的生态环境可能有直接联系。它不但可以生长在
山谷湿地、林缘、林下 , 而且也可以生长在向阳的
山坡、灌丛及高山草甸 , 干旱及湿润的地方均有分
布。与此相对应 , 东俄洛橐吾的植株形态变异很
大: 生长在湿润地带的个体极高 ; 而生长在干旱
地带的个体则很矮小。东俄洛橐吾是多年生草本 ,
根肉质 , 由于长时间适应多种多样的生活环境导
致东俄洛橐吾的表型变异及高的遗传多样性。
植物居群之间的遗传分化是其长期进化历史
(包括分布范围的改变、生境的片断化和居群的
隔离等 )、基因突变、遗传漂变、交配系统和基
因流以及自然选择等因素的综合反映 ( Schaal
等 , 1998)。葛颂等 ( 1994 ) 认为 , 在居群水平
上 , 繁育 系 统是 影响 遗 传分 化 的重 要 因素。
Wright (1931) 认为群体间的基因流值若小于 1 ,
有限的基因流是促使群体发生遗传分化的主要原
因。对于东俄洛橐吾 , 我们认为导致其自然居群
间显著的遗传分化的主要原因是有限的基因流
(0 . 6482) 和生境选择压力。种子植物基因流的
实现主要是通过其种子散布和花粉的传播。由弱
飞行能力的动物授粉和靠种子迁移的植物居群间
的遗传分化显著 ( Avise, 1994) 。野外观察发现 ,
东俄洛橐吾主要由熊蜂授粉。此种熊蜂的飞行能
力较弱 , 迁移距离有限 , 影响了基因流的扩散。
在高山环境中 , 传粉昆虫的种类和数量都比较
少 , 活动频率也比较低 ( Murray, 1987; Keams
and Inouye, 1994; Bingham and Orthner, 1998 ) ,
从而增加了这种依赖昆虫传粉植物生殖保障的风
险 , 特别是对于那些依赖专一性昆虫传粉的植物
来说更是如此 (Koner, 1999)。Liu等 (2006 ) 认
为适应辐射是橐吾属植物物种形成与多样化的主
要机制 , 东俄洛橐吾物种形成以后经受多样化生
境的选择压力 , 不同生境下的居群各自分化。
3 .2 C结合东俄洛橐吾生态环境的多样性来探讨
其种系的分化格局
物种的遗传多样性和遗传分化与其种系起
源、演化密切相关。橐吾属的现代分布中心在横
断山区 , 而起源中心则在中国中部 ( 包括四川东
部 ) , 因此是一个起源中心与分布中心不在同一
地区的属 。本属的起源时间至少是第三纪古新
世之前或白垩纪中期 , 且其形成与扩散与第三纪
森林植物区系有密切的关系 ( 刘尚武 , 1994 )。
Liu等 (2006) 认为适应辐射是橐吾属植物物种
形成与多样化的主要机制 , 在青藏高原抬升过程
中 , 形成彼此隔离的多样化的生境 , 橐吾属植物
适应横断山区多样化的生境而形成了其物种多样
性和遗传多样性。对于任何一个物种来说 , 其遗
传多样性越丰富 , 对环境变化的适应能力就越
强 , 就越容易扩展其分布范围和开拓新的环境
(葛颂和洪德元 , 1994 )。我们认为东俄洛橐吾
( L . tongolensis) 较高的遗传多样性可能是其多样
化的生长环境造成的。Hanai 等 ( 2005 ) 研究了
19 个东俄洛橐吾 ( L . tongolensis) 居群和 13 个舟
叶橐吾 ( L . cymbulifera) 居群的 atpB～ rbcL 序列
和化学成分。前者的 19 个居群中存在 5 个 atpB
～ rbcL 单倍体型 ( Haplotype) , 与之相比 , 同属
的舟叶橐吾 ( L. cymbulifera) 其化学成分和 atpB
～ rbcL 的核苷酸序列没有差异。由此 Hanai 等认
1455 期 王金凤等 : 东俄洛橐吾遗传变异与分化的 ISSR 分析
为这可能是由于舟叶橐吾 ( L . cymbulifera) 生态
幅较窄 , 生境单一 , 通常只能生长在湿润的草甸
地带 , 而东俄洛橐吾 ( L . tongolensis) 的生境多
样 , 对生长环境的适应而造成东俄洛橐吾高水平
的遗传多样性 , 且仍处于分化中。这与我们的结
论是一致的。聚类分析结果显示 , 乌蒙山居群与
云南西北部的大宝山居群聚在一起而与其他六个
居群分开 , 而八个居群中只有乌蒙山一个居群分
布在云南中部。从地理上看 , 乌蒙山居群与其他
居群的地理距离很远 , 即其遗传距离与地理距离
没有显著的相关性。
在青藏高原的抬升过程中 , 形成了多样化的
生态环境 , 东俄洛橐吾适应其多样化的生态环境
而形成了较高的遗传多样性 ; 因其生态环境的不
连续性 , 阻碍了居群间的基因交流而产生了遗传
分化 , 即东俄洛橐吾的高水平的遗传多样性和遗
传分化是适应其分布区多样化生态环境的结果。
致谢 感谢本实验室的杨杨、杨淑达及潘跃芝在数据分
析方面所给予的帮助。
〔参 考 文 献〕
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