全 文 ：叶绿体分裂相关蛋白 CrMinD 的保守功能 ?
雷启义 , 周江菊 , 张文华
(凯里学院环境与生命科学学院 , 贵州 凯里 556000)
摘要 : 细胞或质体中部正确分裂位点的选择是 MinD 蛋白与其他 Min 蛋白 (MinC?E ) 相互作用的结果 ,
MinD蛋白在原核细胞以及植物叶绿体的分裂过程中发挥着重要的作用。细胞中 MinD蛋白浓度的明显升高
可影响正常细胞的分裂过程而产生丝状体细胞。为了研究叶绿体分裂蛋白 CrMinD 的保守功能 , 构建了衣
藻 CrMinD-gfp的原核表达重组质粒进行了原核功能验证。试验结果表明 , 衣藻 CrMinD 蛋白的过量表达严
重影响了大肠杆菌的分裂 , 其在原核细胞中运动和定位与用 GFP 标记的原核细胞 MinD蛋白具有相似性。
更进一步证明了叶绿体分裂同源物 CrMinD蛋白与原核细胞 MinD蛋白有着相似的功能 , 是一个进化上功能
保守的蛋白。同时 , 这一结果也为研究植物细胞中质体的分裂机制奠定了一定的基础。
关键词 : 叶绿体 ; MinD蛋白 ; 基因表达 ; 细胞分裂
中图分类号 : Q 71 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2009) 05 - 415 - 06
The Conservative Function of Chloroplast Division
Associated CrMinD Protein
LEI Qi-Yi , ZHOU Jiang-Ju, ZHANG Wen-Hua
( Collegeof Lifeand Environment Science, Kaili University, Kaili 556000 , China)
Abstract : The interactingof MinD and MinC and MinE proteins of Escherichia coli arerequiredfor proper placement of the
division septumat midcell, TheMinD protein plays a key role in the course of bacterial cell and plant chloroplast division .
The over production of MinD protein can block the normal cell division and lead to a filamentation cell . In plant cells,
There are clear similarities between bacterial andplastiddivision, but limited information exists regardingthemechanismof
plastid division in higher plants . Here we constructed a expression plasmid encoding the full-length CrMinD, an
Chlamydomonas reinhardtii homologue of the bacterial MinD . In agreement with cell division studies in bacteria over ex-
pression of CrMinD in E. coli results in filamentation cell formation . The sesuggestion that CrMinD is an evolutionary con-
served cell division protein . Meanwhile, the result lays a certainfoundationfor studying on thedivisionmechanismof plant
chloroplast .
Key words: Chloroplast; MinD protein; Gene expression; Cell division
质体作为植物细胞器的基本组成部分对于
地球上的生命是至关重要的 , 它们除了从预存的
质体一分为二分裂产生外不能再生 ( Possingham
and Saurer, 1996; Boasson, 1972; Platt-Aloia and
Thomson, 1977 ) , 因此 , 质体的分裂对于质体的
总体维持和累积是非常重要的。目前的研究表
明 , 细菌和叶绿体起源的蓝细菌的与质体分裂相
关的许多蛋白具有同源性 , 包括 FtsZ蛋白和 Min
蛋白等 ( de Boer PA and Crossley, 1989; Colletti
等 , 2000; Itoh 等 , 2001; Maple等 , 2002; Ostery-
oung and Vierling, 1995; Pichoff and Lutkenhaus,
2001) 。FtsZ蛋白是一种具有 GTP 酶活性的微管
云 南 植 物 研 究 2009 , 31 (5) : 415～420
Acta Botanica Yunnanica DOI : 10 .3724?SP. J . 1143 .2009.09175
? ?基金项目 : 贵州省凯里学院植物学重点学科基金资助 (2008ZW002 )
收稿日期 : 2009 - 09 - 07 , 2009 - 09 - 16 接受发表
作者简介 : 雷启义 , 男 , 副教授 , 研究生 , 植物分子细胞生物学。E-mail : leiqiyi@ 126 . com; Tel : 0855 - 8509951
相似蛋白 , 在正常细胞分裂中 , FtsZ 蛋白在细胞
中部聚合形成“Z”形环状骨架结构 , 其它分裂
相关蛋白再与“Z”环相结合而导致分裂事件的
发生 (Osteryoung and Vierling, 1995) 。“Z”形环
在质体中部的形成与正确定位要通过起源于原核
的 Min 蛋白来调控 , Min 蛋白———MinC、MinD、
MinE 蛋白在细胞分裂位点的选择与确定中起着
非常重要的作用 ( de Boer and Crossley, 1989; de
Boer 等 , 1992; Rothfield 等 , 1999; Rothfield 等 ,
2001; Rothfield等 , 2005) 。原核细胞存在三个潜
在的分裂位 , 一个在中部 , 另外两个分别靠近细
胞的端部 (或称极部 ) , 在这些 Min 蛋白中 , 当
minD 基因突变或过量表达时 ,“Z”环不能正确
定位于细胞中部潜在的分裂位点 , 从而导致细胞
分裂异常 , 产生不含基因组的小细 (Mincell ) 或
长丝状细胞 (filamentation cell ) ( Erickson, 1997;
Rothfield等 , 1999) 。
最近 10 年的研究成果表明 , 质体分裂是一
个高度集成的多蛋白参与的过程 , 包括原核起源
的蛋白以及真核寄主起源的蛋白。然而 , 各种不
同来源的蛋白在质体分裂过程中相互作用的机制
直到最近才有所阐述 ( 李大鹏等 , 2009 )。植物
叶绿体为内共生起源 , 目前对高等植物核基因组
中研究中也发现了 ftsZ、 minD 同源基因 ( Colletti
等 , 2000; Fujiwara 等 , 2004; Maple and Chua,
2002; Pichoff and Lutkenhaus, 2001; Wang 等 ,
2003) , 植物细胞中内共生起源的叶绿体仍然利
用 FtsZ 蛋白进行分裂 , 干扰拟南芥 ftsZ、 minD
基因以及衣藻 CrMinD1 基因的过量表达均会导致
叶绿体分裂出现异常表型 , 说明了高等植物质体
与细菌的分裂仍然具有相似的遗传基础和分裂机
制 ( Adams 等 , 2008; 胡勇 等 , 2004; Kanamaru
等 , 2000; Osteryoungand Vierling, 1995; Osteryoung
and Pyke, 1998; Steryoung and Nunnari , 2003) 。
衣藻属于单细胞绿藻 , 其仅含有单一的体积
较大的杯状叶绿体 , 这种叶绿体在衣藻细胞质分
裂时其子细胞中都分布。衣藻细胞分裂具有多重
性 , 有证据表明在衣藻第二和第三轮分裂过程中
(在四分裂或八分裂细胞中 ) , 叶绿体的分裂先于
细胞分裂 ( Harper and John, 1986 ) [ 26 ] 。衣藻和拟
南芥质体共同内共生起源和质体分裂的类似物的
存在 , 表明了衣藻叶绿体分裂与高等植物叶绿体
分裂机制具有相似性 ( Adams 等 , 2008 )。然而 ,
以往的研究仅仅局限于单细胞衣藻质体分裂
MinD 类似 物对 细 胞形 态 的 影响 ( Adams 等 ,
2008) , 而关于衣藻质体分裂 MinD 类似物原核功
能验证没有做全面工作 , 为此 , 我们研究组利用
衣藻质叶绿体分裂相关基因 MinD 类似物构建融
合表达载体进行研究 , 全面证明了衣藻叶绿体分
裂基因 MinD 类似物是一个功能非常保守的蛋
白 , 这为进一步研究高等叶绿体的分裂及其调控
机制奠定一定的基础。
1 材料与方法
1 .1 材料
大肠杆菌菌株 JM109 由本室保存 , 限制性内切酶
HindIII、 BamHI 以及 Taq 酶 购 于 TaKaRa 大 连 公司 ,
T4DNA 连接酶购自华美公司 , DNA 序列测定由上海联合
基因公司完成。PCR 引物由上海生工公司合成 , dNTP 与
DNA 电泳凝胶回收试剂盒购自上海生工公司 , 其他试剂
及培 养基 购 自华 美、生 工、 Promega、鼎 国 等 公司。
CrMinD蛋白抗血清由本实验室制备 , 羊抗鼠 IgG 购自北
京中山生物技术公司。
1 .2 ?衣藻 CrminD 基因的克隆以及 CrminD-egfp 融合表
达载体的构建
衣藻 CrminD基因的克隆以及其融合表达载体的构
建按照文献 (胡勇等 , 2004; Hu等 , 2008) 的方法进行。
扩增 CrMinD cDNA 并将其纯化后 , 克隆到 HindIII +
BamHI 双酶切的 pEGFP 载体上 , 转化 JM109 感受态菌 ,
在选择培养基上筛选阳性转化子命名为 pHMinD-gfp, 并
进行 DNA 序列测定和酶切鉴定。
1 .3 CrMinD 蛋白在 E. coli 中的定位与观察
将以酶切鉴定正确的转化有融合表达质粒 pHMinD-
gfp的大肠杆菌 JM109 在选择培养基上划板 (含氨苄青霉
素 80μgml - 1 ) 培养后 , 挑取含重组载体的单个菌落于液
体培养基中 (含氨苄青霉素 80μg ml - 1 ) 37℃摇培过夜 ,
次日以 1?50 比例取过夜培养物分别接种于含有 0、25、
50、100、200、400、800、1 000、1 200、1 400μmol L - 1 不
同 IPTG 浓度的 LB 液体培养基中 (含氨苄青霉素 80μg
ml - 1 ) , 在 37℃恒温培养箱摇培诱导 4 小时 ; 与此同时将
对照组 (野生大肠杆菌 JM109 和转化有 pEGFP 质粒的空
宿主菌 ) 做同样的处理。把以上培养物与等体积预热的
0 .5%低熔点琼脂糖充分混匀后涂于无荧光载片上 , 压片
后采用蓝光激发和标准滤光片进行镜检和统计。
利用 Leica DMRE 型多功能显微镜微分干涉系统对在
不同 IPTG 浓度诱导下的转化有融合表达质粒的 JM109 的
菌体和对照组菌体的形态以及荧光情况进行观测 , 并用
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Spot cold CCD Digital camera采集图象 ; 再利用 Leica TCS
激光共聚焦显微镜对转化有融合表达质粒的 JM109 的菌
体形态以及 GFP 来源的荧光定位进行实时观察 , 所用物
镜为 Leica100x, 激发 GFP 产生荧光的激发光波长为 488
nm, 图像的采集处理用 LeicaTCS PowerScan软件。
1 .4 CrMinD 蛋白 Western blot 检测
取检测到 CrMinD融合蛋白在细胞中动态定位的诱导
培养菌和对照菌各 1 .5 ml 于离心管 , 离心后分别加入蛋
白提取液 , 蛋白质经定量后 , 取 60μg?样本进行 SDS-
PAGE 电泳 , 标明 1、2、3、4 泳道 , 100 V 电泳 2 h, 然
后转印蛋白质到 NC 膜上放入 TBST 脱脂奶粉封闭液中
(电压 24 V , 50 min) , 37℃孵育 2 h, PBS室温振摇洗膜 3
次 , 每次 5 min。一抗 (1∶500 ) 4℃过夜 , 相应二抗 (1∶
3000) 37℃孵育 2 h, PBS 洗膜 3 次 , 每次 5 min, ECL 化
学发光 , 观察结果。
2 结果
2 .1 目的基因 CrminD 的扩增
以 CrminD 基因 cDNA 为模板进行 PCR 扩增
并做琼脂糖凝胶电泳分析。结果证明 , 扩增产物
为 1 .7 kb大小的 DNA 带 , 与衣藻 CrMinD 全长的
大小相吻 , 鉴定结果见图 1A。
2 .2 pHMinD-gfp 重组质粒的鉴酶切定
重组质粒经 HindIII + BamHI 双酶切后鉴定产
生 1 .7 kb大小的 DNA 带和约 4 kb的质粒带 , 与目
的基因 CrMinD 全长和原质粒的大小相一致。最
后的 DNA 测序结果证明 CrMinD 基因序列没有
图 1 CrMinD PCR 及重组质粒 pHMinD-gfp酶切鉴定结果
A .M 为分子标记; 1 . 基因 CrMinD PCR 电泳图 ; B . M 为分子标记 ;
1、2 . 质粒 pHMinD-gfp HindII I + BamHI 双酶切电泳图
Fig . 2 Agarose gel electrophoresis of CrMinD PCR
prouduct and pHMinD-gfp digested
A . M . marker; 1 . PCR product of gene CrMin; B . M . marker;
1 , 2 . pHMinD-gfp HindII I + BamHI digested
突变的出现 , 而且整个重组质粒 pHMinD-gfp 的
读码框也是正确的 , 酶切鉴定结果见图 1B。
2 .3 FCrMinD 对原核细胞形态的影响及在其中的
定位
通过上述的实验方法 , 利用显微镜观察发
现 , 作为对照组的野生型大肠杆菌和 转化有
pEGFP 质粒的空宿主菌在一系列的诱导条件中菌
体长度 (2～6μm) 没有发生明显的变化 , 细胞
的分裂几乎都发生在正常的分裂位点 ( 细胞中
部) ( 图 2: A , B ) ; 在 IPTG 的诱导下 , 转化有
pEGFP 质粒的空宿主菌 ( 对照菌 ) , 其细胞的形
态和大小与野生型大肠杆菌相似 ( 图 2: C) , 荧
光观察可见 GFP 蛋白分子分布于整个细菌细胞
中 (图 2: D) , 而且仍然能进行正常的生命活
动 , 说明 pEGFP 质粒并没有影响空宿主菌的生
长也没有影响其正常的生命活动。含有 pHMinD-
gfp质粒的宿主细胞 , 随着 IPTG 浓度的增加 , 诱
导培养的细菌细胞出现了明显的不对称分裂 ( 图
3: A , B 白色箭头示分裂位点 ) , 而且细胞长度
明显变长 (图 3: A , B , C) , 有的细胞长达 20
μm (图 3: B) , 菌体长度呈现规律性的变化。对
每种诱导浓度 , 随机测量 200 个菌的长度并进行
单因子方差统计分析 ( 图 5 ) 也证明了这一现
象 ; 在 1μmol L - 1 IPTG 浓度培养的含有 pHMinD-
gfp质粒的宿主细胞可见 CrMinD 融合蛋白在细胞
中定位 ( 图 3: D) , 通过共聚焦显微镜观察 , 可
见 CrMinD融合蛋白在细胞中快速往返式的螺旋
运动情况 ( 图 4 ) 并影响细胞的分裂。
2 .4 CrMinD 蛋白 Western blot 检测结果
Western blot结果显示 , 在泳道 1 (野生大肠
杆菌 ) 和泳道 2 ( 转化有 pEGFP 质粒的空宿主
菌 ) 未出现反应 , 而含 pHMinD-gfp重组质粒的
大肠杆菌经 IPTG 诱导后在泳道 3 和 4 上相应于
其表达产物相对分子量的地方出现了目的条带
(图 6)。
3 讨论与结论
最近的研究表明 , 植物质体的分裂是通过多
种具有保守性的质体分裂蛋白相互作用来确保植
物质体的正常分裂 , 这种相互作用直接影响了质
体分裂蛋白的定位及功能的发挥。为此 , 人们在
质体分裂研究中 , 主要研究各种已知或新发现蛋
7145 期 雷启义等 : 叶绿体分裂相关蛋白 CrMinD 的保守功能
图 2 野生大肠杆菌 JM109 和转化有 pEGFP 质粒的空宿主菌菌体表型 (对照 )
A . E . coli JM109 无 IPTG诱导 ; B . E. coli JM109 用 1 000μmol L - 1 IPTG 诱导 ; C . 转化有 pEGFP 质粒的空宿主菌用
1 000μmol L - 1 IPTG诱导 ; D . 转化有 pEGFP 质粒的空宿主菌用 1 000μmol L - 1 IPTG诱导荧光对照图
Fig . 2 The morphology of wild E. coli JM109 and empty host E . coli that contain pEGFP plasmids (contrast)
A . without IPTG induction; B . with 1 000μmol L - 1 IPTG induction for 4 h; C . empty host E . coli that contain pEGFP
plasmids with 1 000μmol L - 1 IPTG induction for 4 h; D . the pictureof gfp contrast of Fig C
图 3 CrMinD基因在大肠杆菌细胞中表达及对细胞形态的影响
A . 含 pHMinD-gfp 重组质粒的大肠杆菌经 1 000μmol L - 1 IPTG诱导细胞形态 ; B . 丝状体细胞不对称分裂
(白色箭头示分裂位点 ) ; C, D . 示 CrMinD 蛋白在大肠杆菌细胞中的定位
Fig . 3 Expressions of CrMinD in E . coli and effect on morphology of host cell
A . the morphology of host cell contain pHMinD-gfp plasmids with 1 000μmol L - 1 IPTG induction for 4 h; B . asymmetric division of
filamentous cell (the white arrows indicate the cell division site) ; C and D . theorientation of CrMinD in E . coli
图 4 CrMinD 蛋白沿着大肠杆菌细胞长轴螺旋式运动
A-M . CrMinD 蛋白在大肠杆菌细胞中的螺旋式运动过程 ; N . 激光扫描共聚集三维重组图 ; O . 同一视野中大肠杆菌对照图
Fig . 4 The helix movement of CrMinD protein around the long axis of E . coli cell
A-M . the course of CrMinD protein around the long axis of E. coli cell ; N . the three-dimensional representation
of laser scanning confocal ; O . the contrast image of E . coli cell in same visual field
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图 5 转化 pHMinD-gfp 质粒菌体长度变化统计图
Fig . 5 Statistical Fig of length changes of E . coli contain pHMinD-gfp plasmids
图 6 CrMinD 蛋白 Western blot 检测
1 . 野生大肠杆菌 JM109; 2 . 转化有 pEGFP 质粒的空宿主菌 ;
3、4 . 经 IPTG 诱导的含 pHMinD-gfp 重组质粒的大肠杆菌
Fig . 6 Western blot analysis of CrMinD protein
Lane 1: wild E. coli JM109; Lane 2: empty host E. coli that contain
pEGFP plasmids; Lane 3 and lane 4: E. coli that contain
pHMinD-gfp plasmids with 1 000μmol L - 1 IPTG induction
白的亚细胞定位以及与其它蛋白间的相互作用
(李大鹏等 , 2009) , 通过此途径来认识植物质体
的分裂机制。
衣藻是一种单细胞绿色藻类 , 其世系分支于
10 多亿年前的陆生植物 , 其已经成为研究叶绿
体光 合 作 用 的 一 个 模 型 体 系 ( Merchant 等 ,
2007)。为了研究植物叶绿体分裂相关蛋白———
Min蛋白的功能及叶绿体的分裂机制 , 我们将来
源于衣藻的 CrMinD 基因构建成原核表达质粒 ,
转化大肠杆菌并对其功能进行分析研究。通过研
究发现 , 转化有 CrMinD 基因的原核细胞在 IPTG
的诱导下 , 能特异地表达 , 细胞分裂出现了异常
现象 , 大多数细胞的分裂位点发生在细胞的端部
(极部 ) , 有的细胞分裂受阻逐渐变长而呈现了丝
状体细胞表型 , 随着 IPTG 的诱导浓度的增加 ,
菌体长度也呈现规律性的变化 , 而对照组细菌细
胞没有此现象发生 , 衣藻 CrMinD 蛋白对原核细
胞形态的影响类似于原核细胞内源 MinD 蛋白作
用 ( Pichoff and Lutkenhaus, 2001; Shih等 , 2003) ,
说明了衣藻 CrMinD蛋白功能具有同样的保守性。
荧光观察可见 CrMinD-EGFP 融合蛋白在分裂受阻
的丝状体细胞中形成环状物 (MinD 环 ) 并呈均
匀分布 , 且相邻环的间距也在 2～6μm, 这与野
生大肠杆菌的细胞长度接近吻合 , 我们认为这些
点是细胞的分裂位点因 CrMinD-EGFP 融合蛋白过
量表达聚合而被屏蔽所致。在实验中 , 我们观察
到衣藻 CrMinD 蛋白 , 快速地从转化菌长丝状细
胞的一端 ( 极 ) 绕着细胞长轴地移动到另一端
(极 ) , 呈现出明显螺旋式运动 ( 图 4 ) , 这也与
绿色荧光标记的大肠杆菌内源性 MinD 蛋白运动
相似 ( Shih等 , 2003 ) , 通过 Western blot 检测证
实了观察到蛋白为目的蛋白。以上实验结果说
明 , 衣藻 CrMinD 蛋白在大肠杆菌细胞中仍然能
够调控细胞的分裂活动 , 是功能非常保守的蛋
白 , 也说明植物中叶绿体具有与细菌细胞相似的
分裂调控机制 , 更进一步验证了衣藻 CrMinD 蛋
白的保守功能 , 这为进一步研究植物叶绿体的分
裂机制奠定了一定的基础。
〔参 考 文 献〕
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