全 文 ：植物中超氧阴离子自由基测定方法的改进!
李忠光，龚 明!!
（云南师范大学生命科学学院，云南 昆明 !##$%）
摘要：通过对植物超氧阴离子自由基测定反应中动力学曲线的分析，确定了最佳的反应介
质、反应参数和羟胺浓度，以三氯甲烷代替乙醚作为植物色素萃取试剂，克服了植物超氧阴
离子测定中存在的诸多问题，提高了测定结果的准确性、重复性和可比性。
关键词：植物；超氧阴离子自由基；测定方法
中图分类号：& $’ 文献标识码：( 文章编号：#%) * %+##（%##）#% * #%,, * #!
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植物细胞在其生命活动过程中，由于叶绿体、线粒体和质膜上每时每刻都发生着电子
传递过程中电子的泄露，因而不可避免地会产生大量的活性氧，如过氧化氢（R%8%）、超
氧阴离子自由基（8% N*）、羟自由基（ N 8R）等（李忠光等，%##)）。近几年的研究表明，
活性氧在植物对环境胁迫的信号感受、传导与适应过程中起重要作用（李忠光和龚明，
%##)）。因此，准确测定活性氧浓度无疑在植物抗逆性研究中起着非常重要的作用。
常见的植物 8% N*测定方法有化学发光法、9S?法、细胞色素法、邻苯三酚法、肾上腺
素法和羟胺氧化法（王爱国和罗广华，,$$#；TD@H2BC 72F RB6ABD，,$+!）。但由于干扰因素
云 南 植 物 研 究 %##，=>（%）：%,, U %,!
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!! 通讯作者：(6H01C K1C I1CCB@A12FB2IBN T * =7;D：3123=;23VA6OD;IW G=W E2W I2
收稿日期：%##’ * #$ * #X，%##’ * ,% * #%接受发表
作者简介：李忠光（,$+, *）男，彝族，实验师，云南省永德县人，主要从事植物逆境生物学研究。
T * =7;D：/012336723— D;V,!)W I1= 电话：#X+, * ,+)$’
基金项目：国家自然科学基金（)#’!##,!）、云南省自然科学基金（%##’>##),:）、国际合作计划（%##%5R#!）
及教育部高校优秀青年教师教学科研奖励计划（%##,年度）
颇多，实际应用时困难不少。羟胺氧化法测定植物超氧阴离子自由基具有灵敏度高，专一
性较好，药剂价廉等特点（王爱国和罗广华，!#；$%&’()* +(, -)./)%，!01）。但是，这
一方法在实际应用中存在许多问题：首先是色素的干扰；其次是以正丁醇为萃取液有时与
反应介质分层不明显，而以乙醚为萃取液，则反应介质位于下层，给比色带来不便；第三
是酸度对显色反应的影响、内源 234 5的干扰、羟胺的自氧化以及反应介质浑浊等，针对
这些问题，我们作了以下修改，以适合植物 34 65的准确测定。
! 材料和方法
!! 植物材料的培养
挑选饱满的玉米（!# $#%&）品种大黄的种子，以 #7!8 -9:%4 消毒 !# ;<(后，漂洗干净，于 417=>
下吸涨 !4 ?，播于垫有 1层湿润滤纸的带盖白磁盘（4@ A; B !1 A;）中，于 417=>下黑暗中萌发 1# ?。随
后，移植于腐植土中，同样的温度下于人工气候箱中继续培养，每天于 !##!;C%·;
54·&5 !的光强下光照
!@ ?，培养期间定期补充水分。
!# 酸对显色反应的影响
张志良（!#）和 D)’)*&等（4##E）在测定植物 34 65时，反应介质所用的酸不一样，所用酸的浓度也
不一样，为了探讨不同的酸对显色反应速度及检测 234 5 灵敏度的影响，我们用相同浓度的不同酸为反
应介质，即在配制磺胺（即对氨基苯磺酸）和F萘胺时，分别以它们为溶剂，以 4=!;C%GH 2+234 为
234 5源，在 4=>下水浴反应，每隔 ! ;<(用 I2J:34###分光光度计检测一次 K=E#。
!$ 最佳羟胺浓度和反应时间的确定
王爱国和罗广华（!#）及 $%&’()*和 -)./)%（!01）测定植物 34 65 时，我们发现不同浓度的 2-43-
对植物 34 65的测定影响较大。为了确定最佳的 2-43-浓度，我们以功能叶片中提取的 34 65与终浓度分别
为 E L !## ;;C%GH 2-43-发生反应，探讨了不同浓度的 2-43-对反应的影响。
此外，由于 M<+(9和 N?+(9（4##!）及 O<+(等（4##E）在测定中所采用的反应时间不同，有的为 4#
;<(，有的为 1# ;<(。为了确定最佳的反应时间，我们以功能叶片中提取的 34 65 与终浓度为 !# ;;C%GH
2-43-发生反应，以确定最佳的反应时间。
!% 不同萃取试剂对植物色素的萃取效果和标准曲线的制作
由于在用羟胺氧化法（王爱国和罗广华，!#；$%&’()* +(, -)./)%，!01）测定植物 34 65 时，反应介
质位于下层，给测定带来了不便，并且以乙醚作为萃取试剂去除植物色素的效果不太理想。为了更有效
地去除植物色素的干扰，我们用乙醚（$’?P% )’?)*，$$）以及比重比水大的四氯化碳（:+*QC( ’)’*+A?%C*<,)，
:O）、三氯甲烷（:?);
除了以上试图获得植物 34 65测定中最佳的实验参数之外，我们还在修改后的实验条件下建立了标准
曲线和回归方程。
!& 测定方法的改进
为了更准确地测定植物 34 65，我们对羟胺氧化法的提取和具体测定过程作了如下修改：称植物材料
! 9，加入 1= ;;C%GH磷酸钾缓冲液（/- 07W，不用磷酸钠缓冲液，其实验效果不好，具体原因待研究）E
;%及少许石英砂，充分研磨，转入离心管中并于 !# ### *G;<(离心 != ;<(，取上清液并定容至 E ;%，此液
即为植物 34 65提取液。
测定过程中分为试验组、对照组和空白调零组，取 1= ;;C%GH磷酸钾缓冲液 #7= ;%分别加入试验组，
对照组和空白调零组，试验组和空白调零组分别加入 !# ;;C%GH盐酸羟胺 #7! ;%（对照组用 #7! ;%蒸馏水
4!4 云 南 植 物 研 究 40卷
取代），摇匀，!#水浴加热 $% &’(，试验组和对照组分别加入上清液 %) &*（空白调零组用 %) &* +
&&,*-.磷酸钾缓冲液取代），摇匀，!#水浴 !% &’(，分别加入 / &&,*-. 磺胺 $ &*，摇匀，再加入 0
&&,*-.!1萘胺 $ &*，摇匀，!#水浴 !% &’(，加入等体积（2 &*）色素萃取液三氯甲烷，并于 $% %%% 3-&’(
离心 2 &’(，取粉红色水相（上层）测定 42%。
! 结果与讨论
我们用相同浓度的不同酸为反应介质，以 !&,*-. 5657! 为 57!
8源，在 !#下水浴
反应，每隔 $ &’(用 95:;7!%%%分光光度计检测一次 42%，得到图 $4显色反应曲线。从图
$4中可以看出，不同酸对显色反应速度及检测 57! 8的灵敏度不同，反应速度及灵敏度从
小到大依次为： ? <;* ? <2@7> ? ;<2;77<。当反应达到 !% &’(时，以乙酸和磷酸为
反应介质的体系反应速度已经达到最大，其中乙酸反应的灵敏度最高，而其它反应仍未达
到最大反应速度。因此，测定过程中显色反应的最佳时间定为 !% &’(。
图 $ 酸对反应速度及灵敏度的影响
A’BC $ DEEFGH ,E 6G’I ,( 3F6GH’,( 36HF 6(I JF(J’H’K’H’FJ
图 $4可以看出以乙酸为反应介质有较快的反应速度和较高的灵敏度，为了进一步探
讨不同浓度的乙酸对反应速度及灵敏度的影响，我们以 !&,*-. 5657! 为 57!
8 源，在
!#下水浴反应，每隔 $ &’(用 95:;7!%%%分光光度计检测一次 42%，得到图 $L显色反应
曲线。从图 $L中可以看出，随着乙酸浓度的增加，反应速度及灵敏度也在增加，当乙酸
浓度为 $! &,*-.时，反应速度和灵敏度达到最大。乙酸浓度超过 $! &,*-.时，反应速度及
灵敏度反而下降。
应用羟胺反应来检测植物 7! C8之所以是一种较灵敏的方法，主要是羟胺反应产物的比
2$!!期 李忠光等：植物中超氧阴离子自由基测定方法的改进
色测定具有较高的灵敏度。显色反应分两步：第一步是在酸性条件下，磺胺与 !# $起重
氮化反应形成重氮盐；第二步是重氮盐进一步与!%萘胺偶联形成粉红色偶氮化合物，此化
合物在 &’( )*处有显著光吸收。反应介质的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶
联作用的速度（张志良等，+,,(），因此反应介质酸度过大过小都不行，从而得到图 +的
结果。另外，以 +# *-./0乙酸为溶剂，具有在常温下就能完全溶解磺胺和!%萘胺的优点；
而以其它酸为溶剂在常温下能溶解磺胺，但不能溶解!%萘胺，!%萘胺必须加热煮沸才能完
全溶解，由于加热煮沸过程中酸的大量挥发，会影响反应介质的最终乙酸浓度。我们还发
现，在植物 # 1$的测定中，用 &2 **-./0磺胺比用 +3 **-./0磺胺效果好。所以，在后面植
物 # 1$的检测实验中，分别以 +# *-./0乙酸为溶剂配制 &2 **-./0磺胺和 3 **-./0!%萘胺，
可达到最佳的实验效果。
为了确定植物 # 1$测定中最佳的 !4#4浓度，我们探讨了不同浓度的 !4#4对反应
的影响，得到图 #5结果。从图中可以看出：!4#4终浓度在 ( 6 +( **-./0范围内，随着
!4#4浓度的增加，5&’(在增加，当 !4#4浓度达到 +( **-./0时，5&’(最大。相反，当
!4#4浓度大于 +( **-./0 时，5&’(反而下降。因此，在植物 # 1$ 的测定中，最佳的
!4#4终浓度应为 +( **-./0。
图 # 羟胺与超氧阴离子自由基反应的动力学曲线
7891 # :8);<8=> =?@A; -B !4#4 @;C=<8)9 D8
我们以功能叶片中提取的 # 1$与终浓度为 +( **-./0 !4#4发生反应，以确定最佳的
反应时间，得到图 #I的动力学曲线。从曲线中可以看出：在 ( 6 J( *8)的反应时间内，随
着反应时间的进行，5&’(在不断增加，当达到 J( *8) 时，5&’(不在增加。另外，在 ( 6 #(
K+# 云 南 植 物 研 究 #3卷
!#的反应时间内，$%&’与反应时间成正比，即具有很好的线性关系。因此，在植物 () *+
的测定中需要考虑以下问题：如果测定的是植物中总的 () *+ 含量，那么反应时间应取 ,’
!#；如果测定的是植物中的 () *+ 产生速率，那么反应时间应为 )’ !#。只有这样才能较
准确地反应植物中的 () *+含量和产生速率。
由于植物色素对 () *+测定干扰较大，为了更有效地去除植物 () *+测定中植物色素的干
扰，我们用比重比水大的萃取试剂来萃取植物色素，得到图 &$ 的实验结果。从图中可
知，在 -种色素萃取试剂中，用三氯甲烷作为萃取试剂，反应介质中的植物色素含量最
低，说明在植物 () *+的测定中，以三氯甲烷作为萃取试剂比用乙醚效果稍好。
图 & 不同萃取试剂对色素的萃取效果和标准曲线
./* & 01234526# 788752 68 988737#2 71234526# 37/7#2 6# :;4#2 :/!7#2 4#9 <24#9439 5=3>7
在确定以上最佳技术参数的基础上，我们也建立了在该实验条件下的标准曲线（图
&?）。从图中可以看出，标准曲线的线性关系很好，其回归方程为 @ A ’B’C&D + EBF, G
C’+ -。在植物的测定中，只要测出 $%&’，通过标准曲线或回归方程换算出 H() + 的浓度，
记录 () *+与 HI)(I反应时间（)’或 ,’ !#），即可得出植物中 () *+的产生速率或含量。
由于盐酸羟胺会发生自氧化反应（王爱国和罗广华，CJJ’），所以在具体的测定过程
中以加入盐酸羟胺组为空白调零组，有效地消除了盐酸羟胺自氧化而导致测定结果的偏
高。其次，以不加盐酸羟胺组为对照组，有效地消除残余色素及内源 H() +的干扰。因此，
在测定过程中，盐酸羟胺与 () *+反应所产生的实际 $%&’值 A试验组的消光值 +对照组的消
光值。按文献（王爱国和罗广华，CJJ’；0;<2#73 4#9 I7=:7;，CJE,）直接以磷酸缓冲液作为
空白调零，会导致实验结果的偏高，而且由于粉红色水层位于萃取液下层，测定中取液时
%C))期 李忠光等：植物中超氧阴离子自由基测定方法的改进
图 ! 新旧方法中植物超氧阴离子自由基产生速率的比较
#$% ! &’( )’*+,-. /,)012’ (#*+ ,3- )’*+,-. ,4 .50’2,6#-’
17#,7 21-#/13 02,-5/*#,7 21*’ #7 0317*
!8 9 :;:<，与新方法相比
易受色素干扰，测定结果不稳定，
重复性不好。改用新的萃取液及
测定方法后，经过离心，粉红色
的水相位于上层，并且不产生浑
浊，这样不仅便于比色测定，而
且严格地遵循了 =1)>’2*?@’’2 定
律，从而提高了测定结果的准确
性、重复性和可比性（图 !）。
为了检验此法的有效性，我
们分别用新旧方法检测了萌发 A;<
-的玉米幼苗以及人工气候箱中正
常生长的玉米幼叶、功能叶片和
老叶中 BA %C的产生速率，得到图 !
的结果。从图中可以看出，在玉
米幼苗和幼嫩的叶片中，两种方
法测定的结果差异不显著；但是在成熟叶片和老叶中，旧方法测定的结果比新方法发高，二
者达到显著差异水平，说明在旧的方法中色素等干扰因素较多。而用新方法测定的结果与荧
光方法和电子自旋共振法（D17$ 等，A::!）测定的结果很接近，因此，具有很强的可靠性。
〔参 考 文 献〕
张志良，EFF: % 植物生理学实验指导［G］% 北京：高等教育出版社，H<—HI
J3.*7’2 J，K’50’3 L，EFIH % M7+#>#*#,7 ,4 7#*2#*’ 4,2)1*#,7 42,) +N-2,6N31)),7#5)/+?3,2#-’：1 .#)03’ 1..1N 4,2 .50’2,6#-’ -#.)5*1.’
［O］% !#$ %&’()*+，!：HEH—HA:
O#17$ GP，Q+17$ OK，A::E % J44’/* ,4 1>./#.#/ 1/#- ,7 1/*#R’ ,6N$’7 .0’/#’.，17*#,6#-1*#R’ -’4’7/’ .N*’2) 17- ,6#-1*#R’ -1)1$’ #7
3’1R’. ,4 G1#S’ .’’-3#7$.［O］% ,$#- ,)./&’$，#$（EE）：EAH<—EAIT
=# QU（李忠光），V5 WX（杜朝昆），U,7$ G（龚明），A::T% Y#)53*17’,5. )’1.52’)’7* ,4 LYLZVKL 17- UYKZUYYU 5.#7$ 1
.#7$3’ ’6*21/*#,7 .N.*’).［O］% 0 12# 3’4+ 5&6（&1* Y/#）（云南师范大学学报）（自然科学版），$%（T）：HI—I:
=# QU（李忠光），U,7$ G（龚明），A::T% M7R,3R’)’7* ,4 17*#,6#-17* .N.*’). #7 *+’ 4,2)1*#,7 ,4 KABA?#7-5/’- +’1* *,3’217/’ #7
G1#S’ .’’-3#7$.［O］% ,$#- ,)./&’$ 7’++2（植物生理学通讯），%&（H）：
#7431))1*,2N ’44’/* ,4 *+’ /5/52>#*1/#7. 421/*#,7 42,) 8&$94#:&# *94#(-*#-#［O］% ;&<* =(&*(*/，!%：AE^<—AEFI
D17$ @，Q+17$ =，K5 O_， *- #$，A::!% M7-#2’/* -’*’2)#71*#,7 ,4 .50’2,6#-’ 17#,7 21-#/13 #7 *+’ 0317* ,4 2’- .1$’ >1.’- #7 ,7 R17#3?
3#7?^?1)#7,]5#7,3#7’ (#*+ 435,2’./’7/’［O］% !#$ 7)*+ !(-#，’$：EA<—ETE
D#17 G，U5 ‘，Q+5 GP，A::T% D+’ #7R,3R’)’7* ,4 +N-2,$’7 0’2,6#-’ 17- 17*#,6#-17* ’7SN)’. #7 *+’ 02,/’.. ,4 .+,,* ,2$17,$’7’.#. ,4
.*21(>’22N /1335.［O］% ,$#- =(&*(*，()’：I:E—I:I
a17$ LU（王爱国），=5, UK（罗广华），EFF:% ‘517*#*1*#R’ 2’31*#,7 >’*(’’7 *+’ 2’1/*#,7 ,4 +N-2,6N313)#7’ 17- .50’2,6#-’ 17#,7
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