全 文 ：花粉发育相关基因 BcMF13 不同转录本的克隆及分析*
聂传朋, 李焰焰**
(阜阳师范学院 生命科学学院, 安徽 阜阳摇 236041)
摘要: 在克隆花粉发育相关基因 BcMF13 时, 用 RACE技术进行 3忆端扩增, 得到了两个不同长度的 3忆转录
本。 与 EST库比对, 发现与其相似性高的序列都来源于十字花科芸薹属、 萝卜属等植物的生殖器官, 并
且在这些近源属中也出现不同转录本。 这些不同转录本的存在说明 BcMF13 存在剪切异构体, 调控过程灵
活复杂, 反映出该基因具有重要功能。 同时, 对 BcMF13 基因的 RT鄄PCR表达研究表明, 它只在可育株系
中表达, 在不育株系中不表达, 且主要集中在大花蕾、 雄蕊中表达。 分析 BcMF13 推导的蛋白结构, 发现
其编码的蛋白包含多个生物活性位点。 以上结果均表明 BcMF13 与花粉育性相关, 多个剪切异构体的发现
说明 BcMF13 在执行生理功能时较为活跃。
关键词: Brassica campestris Male Fertility 13 (BcMF13); RACE; 3忆 转录本
中图分类号: S 634. 3, Q 78摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2011)03-330-05
The Clone and Analysis on Different Lengths of 3忆 Transcription
of BcMF13 from Brassica rapa ssp. chinensis (Cruciferae)
NIE Chuan鄄Peng, LI Yan鄄Yan**
(School of Life Sciences, Fuyang Teachers College, Fuyang 236041, China)
Abstract: Two different lengths of 3忆 transcripts were got in cloning the pollen development gene BcMF13, using
RACE technology. Compared with the EST database and found that their high sequence similarity are derived from
cruciferous Brassica, Raphanus, plants爷 reproductive organs, and different transcripts were also found in these
sources. The existence of these different transcripts exist that BcMF13 shear isomers, flexible and complex regula鄄
tion of the process, reflecting the important function of the gene. Expression analysis of RT鄄PCR have shown that
BcMF13 only expressed in fertile lines, no in sterile lines, and mainly concentrated in the large flower buds and sta鄄
men. Analysis of the deduced protein structure of BcMF13 found that the proteins encoded multiple biological active
sites. These results show that BcMF13 was late expression gene on pollen fertility. BcMF13 was active in the imple鄄
mentation of physiological function.
Key words: Brassica campestris Male Fertility 13 (BcMF13); RACE; Different lengths of 3忆 transcription
摇 采用 cDNA鄄AFLP 技术从白菜减数分裂胞质
分裂异常突变体 mmc (male meiotic cytokinesis)
对应的野生型中发现其中一个长度为 191 bp 的
片段 A8T4, 这个片段与网上发布的序列同源性
都很低, 说明该片段很可能属于一个新基因。 为
了获得该基因, 用 RACE (rapid amplifi鄄cation of
cDNA ends) 技术对 A8T4 差异片段分别进行 3忆
端 RACE和 5忆端 RACE序列扩增。 在克隆该基因
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2011, 33 (3): 330 ~ 334
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 3724 / SP. J. 1143. 2011. 11021
*
**
基金项目: 国家自然科学基金 “多肽激素类基因 RALF在油菜花粉发育中的功能研究冶 (31000132)、 安徽省高校青年教师资助
项目 “植物肽类激素 RALF基因的分离和遗传转化冶 (2008jq1121)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: liyanyan1976@ yahoo. com. cn
收稿日期: 2011-01-30, 2011-03-10 接受发表
作者简介: 聂传朋 (1974-) 男, 博士生, 高级实验师, 研究方向: 动植物种质资源评价与遗传多样性研究。
E鄄mail: niechp1974@ 126. com
的 3忆端序列时, 得到了两个长度不同的转录本。
随后的表达分析发现, 该基因主要集中在白菜可
育株雄蕊中表达, 在不育株中不表达, 说明该基
因是白菜花粉发育中的相关基因, 因此把长的转
录本和 5忆端序列拼接后得到的 cDNA全长序列命
名为 Brassica campestris Male Fertility 13 (BcMF13,
雄性可育基因 13), 并递交 GenBank (登陆号:
EF158459)。
把 BcMF13 在 NCBI中 BLAST比对, 未发现
与其有相似性的基因, 说明 BcMF13 是一个新基
因。 把 BcMF13 与 EST库比对, 发现与其相似性
高的序列都来源于十字花科芸薹属、 萝卜属等植
物的生殖器官, 它们应该属于一个基因家族。 并
且在这些近源属中的家族基因中也存在有不同的
转录本。 这些不同转录本的存在说明 BcMF13 存
在剪切异构体, 调控过程灵活复杂, 反映了该基
因在功能上的重要性, 有一定的研究价值。
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料
植物材料选用浙江大学蔬菜研究所多年培育的 ‘矮
脚黄爷 白菜核雄性不育两用系 (Bajh97鄄01A / B), 遗传
性状稳定, 可育株与不育株分离比例为 1 颐 1, 育性由一
对等位基因控制, 不育株系 (Bajh97鄄01A) 为雄配子减
数分裂胞质分裂 (male meiotic cytokinesis, mmc) 突变
体, 可育株系 (Bajh97鄄01B) 为其对应的野生型, 可用
于核雄性不育的研究 (Ye等, 2003; Yu等, 2004; Li等,
2011)。
1. 2摇 BcMF13 基因 3忆不同转录本的 RACE扩增
DNA提取参照曹家树等 (1995) 并略加改进。 总
RNA的提取及分离参照 Life Technologies公司 TRIzoL襆的
说明书进行。 cDNA 第一链和第二链的合成参照 SMAR鄄
TTM PCR cDNA Synthesis Kit User Manual 方法进行。 根据
双链 cDNA合成试剂盒的特征设计 3忆RACE 锚定引物 P3
(5忆鄄GAGGCGGCCGACATGTTTTT鄄3忆); 并根据由 AFLP技
术得到的差异片段序列设计正向特异引物 SP1 (5忆鄄
ACACGTAATTTATCTGCTTCCG鄄3忆) 用 3忆RACE 扩增 3忆末
端。 以双链 cDNA 为模板, 进行 RACE 扩增。 PCR 产物
用 VITAGENE公司的 DNA 凝胶回收试剂盒回收后插入
pGEM鄄T easy载体, 转化大肠杆菌, 蓝白斑筛选阳性克
隆, 碱裂解法抽提质粒, 经 PCR鉴定后, 重组质粒送上
海博亚生物公司测序。
1. 3摇 BcMF13 基因的表达分析
基因表达分析取材, 幼苗期取 ‘矮脚黄爷 白菜幼嫩
叶片, 莲座期取莲座叶, 在抽薹期和开花期, 分别取花
茎叶、 花茎、 五级花蕾 [花蕾大小的分级标准是: I 级
(横径<1. 0 mm), II 级 (横径 1 ~ 1. 6 mm), III 级 (横
径 1. 6 ~ 2. 2 mm), IV 级 (横径 2. 2 ~ 2. 8 mm), V 级
(横径>2. 8 mm)]、 开放花、 嫩角果, 另外对可育株的
IV、 V级大花蕾又分别取了萼片、 花瓣、 雄蕊和雌蕊四
份材料, 取材后用纱布包好, 立即投入液氮中固定, 于
-75益保存备用 (Huang 等, 2008)。 开花期调查编号植
株的育性, 根据育性鉴定结果, 分别取同一时期、 同一
育性的 15 份总 RNA混合备用。
摇 摇 以反转录的双链 cDNA为模板, 根据 BcMF13 的 cD鄄
NA序列设计引物 P1: 5忆鄄CGGGGAACCATCAAACTAGTA鄄
3忆、 P2: 5忆鄄CAAAAGGAGAGAAATAGGTTA鄄3忆做 RT鄄PCR,
以 茁鄄actin作为内参对照。
1. 4摇 BcMF13 及其家族基因 3忆不同转录本的序列分析
将获得的 BcMF13 基因序列与网上的 EST 库进行搜
寻比较, 得到的相似性极高的几个 cDNA 3忆鄄mRNA 序
列。 用 MEGA 4. 1 软件完成 BcMF13 及其同源基因的 cD鄄
NA全序列对齐和同源性序列的多重排定, 进行序列比
对, 并根据 Kimura 双参数模型计算遗传距离 (D), 相
应的标准误差用 Bootstrap 方法 ( replications = 1000), 通
过 MEGA 3. 1 软件得出 NJ系统树, 系统树中节点的自举
置信水平 (bootstrap confidence level, BCL) 应用自引导
(bootstrap) 估计, 共 1000 次循环 (张弢, 2009)。
2摇 结果与分析
2. 1摇 BcMF13 基因 3忆不同转录本的 RACE扩增
用 RACE 技术对 A8T4 差异片段进行 3忆端
RACE扩增。 用 A8T4 的正向引物 SP1 和 3忆锚定
引物配对进行 3忆RACE 扩增, 同时分别用 SP1、
3忆锚定引物做单引物验证以排除杂带的干扰 (图
1), 结果表明, 扩增获得 2 条特异条带, 长度
均在 200 bp到 300 bp 之间。 而单引物均没扩增
出条带, 将回收的 2 个条带分别连接到 T鄄easy载
体上, 转化大肠杆菌 DH5琢。 经蓝白斑筛选、 酶
切鉴定后, 取切出正确长度的菌液送出测序。
摇 摇 测序结果表明, 3忆RACE 扩增的两个片段与
A8T4 原始片段重复部分的碱基序列完全一致。
扣除引物序列, 长片段克隆出 238 个碱基, 序列
结尾有一长度为 16 bp的 poly A结构, 短片段克隆
出139个碱基, 序列结尾有一长度为 25 bp的 poly
A结构, 这表明 A8T4 差异片段的 3忆RACE 已获
得成功, 得到了两个转录本。
1333 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 聂传朋和李焰焰: 花粉发育相关基因 BcMF13 不同转录本的克隆及分析摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 1摇 BcMF13 基因的 3忆 RACE扩增
泳道 1 表示 GeneRulerTM 3000鄄bp ladder的 DNA marker; 泳道 2
和 3 分别表示引物 SP1 和 3忆 锚定引物的单引物扩增; 泳道 4
表示 SP1 和 3忆 锚定引物的双引物扩增
Fig. 1摇 3忆 RACE products of BcMF13
Lane 1 indicates GeneRulerTM 3000鄄bp DNA ladder plus marker; lane
2, lane 3 respectively indicates the products of specific primer SP1 or
3忆 anchor primer; lane 4 indicates the products of the two primers
2. 2摇 BcMF13 基因的表达分析
以 ‘Bajh97鄄01A爷 和 ‘Bajh97鄄01B爷 的 I -V
级花蕾、 开放花、 嫩角果、 茎和叶片以及可育株
的萼片、 花瓣、 雄蕊和雌蕊等组织的双链 cDNA
为模板, 用引物 P1、 P2 进行 RT鄄PCR, 以 茁鄄ac鄄
tin作为内参对照 (图 2), 进行表达分析, 发现
BcMF13 只在可育株系的某些部位中检测到表达
信号, 不育株系的相应部位均没表达信号。 主要
在可育株系的 IV、 V 级花蕾中表达, 在茎、 叶
等营养器官中没有表达。 其中, V级花蕾中表达
很弱。 在 IV 级以上的花蕾中具体部位的表达显
示, BcMF13 主要在雄蕊中表达, 在花瓣也检测
到极微弱的表达。
2. 3摇 BcMF13 及其家族基因 3忆不同转录本的序
列分析
将 BcMF13 在 GenBank 数据库用 blast 软件
进行同源性搜索, 没有发现同源性很高的基
因, 表明 BcMF13 是一个新基因。 但是 EST序列
中发现了几个相似性高达 96% ~ 98% 的序列
(GenBank 登陆号: FD565900. 1、 FD937165. 1、
EX898717. 1、 FD961331. 1、 EX777643. 1 ) (表
1)。 这些序列均来源于萝卜属植物的花药、 花
蕾等生殖器官。
表 1摇 BcMF13 cDNA的 EST比对
Table 1摇 The blast result of BcMF13 cDNA in EST database
登陆号摇
Accession 摇
numbers摇
物种
Species
来源器官
Organs
FD565900. 1 Raphanus sativusvar. oleiformis
幼苗、 花蕾
和花药
FD937165. 1 Raphanus sativusvar. oleiformis
幼苗、 花蕾
和花药
EX898717. 1 Raphanus sativus 幼苗、 花蕾和花药
FD961331. 1 Raphanus raphanistrumsubsp. maritimus
幼苗、 花蕾
和花药
EX777643. 1 Raphanus raphanistrumsubsp. landra
幼苗、 花蕾
和花药
图 2摇 BcMF13 在白菜核隐性雄性不育两用系各组织中的表达
(A) m1、 m2、 m3、 m4、 m5、 mF、 mSi、 mS、 mL、 分别指不育株的 I ~V级花蕾、 开放花、 嫩角果、 茎和叶片; w1、 w2、 w3、 w4、 w5、
wF、 wSi、 wS、 wL、 分别指可育株的上述部分; (B) Se、 Pe、 St、 Pi分别指可育株的萼片、 花瓣、 雄蕊和雌蕊。 Actin为内参对照
Fig. 2摇 RT鄄PCR analysis of the spatial and temporal expression pattern of BcMF13
(A) m1, m2, m3, m4, m5, mF, mSi, mS, mL indicate stage I-V flower bud, open flower, germinal silique, scape, leave of
the sterility line respectively, w1, w2, w3, w4, w5, wF, wSi, wS, wL indicate the above of the fertile line respectively,
(B) Se, Pe, St, Pi indicate sepal, petal, stamen and pistil of the fertile line respectively. 茁鄄 actin is internal control
233摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 33 卷
摇 摇 把 BcMF13 的两个 3忆不同转录本和以上几条
EST序列所代表的 cDNA的 3忆端进行序列同源比
对 (图 3)。 BcMF13 的两个 3忆不同转录本在编码
区 (终止密码子之前) 内只发生一次颠换 (G鄄
T)。 在 3忆UTR 区, 各个序列之间的核苷酸差异
比较明显。
摇 摇 用 NJ 法构建 BcMF13 及各基因间的关系树
(图 4)。 聚类分析结果表明, 来自萝卜属、 芸薹
属等共 7 条 cDNA 3忆转录本均按照其来源分别聚
在一起, 其中, 就 BcMF13 基因的进化而言, 萝
卜和野萝卜的亲缘关系更近一些。 序列同源比对
也显示出 3忆不同转录本在同一物种中的差异要
远低于在物种间的差异。 并且, 越靠近 3忆末端,
序列差异越大, 充分反映出 BcMF13 基因在该区
域的多态性。
3摇 讨论
花粉发育是一个复杂的生物学过程, 是受多
基因共同调控的结果, 但是, 已明确的具体调控
过程并不多 (李焰焰和曹家树, 2010)。 BcMF13
表达分析表明, BcMF13 在可育株系 ‘Bajh97鄄
01B爷 的 IV-V 级花蕾中特异表达, 且主要集中
在雄蕊中, 在不育株系 ‘Bajh97鄄01A爷 中没有检
测到表达。 我们已证明 BcMF13 是与十字花科芸
薹属植物白菜的花粉发育密切相关的基因 (Li
等, 2008, 2009)。 虽然在小麦等作物中发现过一个
图 3摇 BcMF13 3忆不同转录本及同源 EST序列的比对
A为 BcMF13 长的 3忆转录本、 B为 BcMF13 短的 3忆转录本, FD961331、 EX777643、 EX898717、 FD565900、 FD937165
是萝卜属植物的 cDNA, 方框内是终止密码子。 碱基背景从深到浅色分别表示相似性从高到低
Fig. 3摇 Alignment different lengths of 3忆 transcriptions from BcMF13 and EST sequences
A was long 3忆 transcription of BcMF13, B was shot 3忆 transcription. FD961331, EX777643, EX898717, FD565900, FD937165 belongs to
Raphanus sativus Nucleotides in the box are stop codons. Background color from dark to light represent similar from high to low
3333 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 聂传朋和李焰焰: 花粉发育相关基因 BcMF13 不同转录本的克隆及分析摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 4摇 根据 Kimura双参数模型, 用 NJ法构建的 BcMF13 各同源基因间的相互关系树
图中数字为自举检验置信值 (1000 个复制序列)。 A为 BcMF13 长的 3忆转录本、 B为 BcMF13 短的 3忆转录本
Fig. 4摇 Molecular phylogenetic trees based on homologous BcMF13 sequences using NJ method by Kimura忆s two鄄parameter model
Numbers on the tree represented confidence values from bootstrap test (1000 replicates) . A was long 3忆 transcription
of BcMF13, B was shot 3忆 transcription of BcMF13
基因产生不同转录本的现象 (Jin和 Bian, 2004),
但 BcMF13 基因 3忆不同转录本的发现和报道还是
首次。 进一步分析其核酸和推导的蛋白结构, 发
现 BcMF13 编码的蛋白包含有两个 N鄄豆蔻酰化位
点、 一个 N鄄糖基化位点, 在 N末端还有信号肽。
多个生物活性位点表明 BcMF13 在执行生理功能
时很活跃, 可能蛋白成熟前还需要信号肽切割
(Li等, 2008)。 结合其 3忆有不同转录本的现象,
可以推测, BcMF13很可能在白菜以及其它十字花
科植物的花粉发育过程中发挥重要的作用。
也参摇 考摇 文摇 献页
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