全 文 ：拟南芥雄性不育突变体 ms214 的遗传与功能分析*
周摇 鹊, 易摇 君, 杨仲南, 张摇 森**
(上海师范大学生命与环境科学学院, 上海摇 200234)
摘要: 经过 EMS 诱变、 背景纯化以及遗传分析, 得到一株隐性核基因控制的拟南芥雄性不育突变体
ms214, 用图位克隆的方法将突变基因 MS214 定位于拟南芥第一条染色体上顶端 700 kb的区间内。 生物信
息学分析发现, 该区间内有一个与蜡质合成有关的基因 CER1; 测序分析表明在突变体 ms214 中, CER1 基
因第一个外显子上碱基由 C509变成了 U509的突变, 导致 CER 蛋白在该处的氨基酸由脯氨酸170变成了亮氨
酸170; 等位实验结果表明 ms214 和 cer1 是等位突变体。 ms214 突变体的茎和果荚呈现出与野生型不同的亮
绿色; 组织切片观察结果表明, 突变体花药发育各个时期无异常变化; 扫描电镜观察发现 ms214 的茎和果
荚的表皮没有蜡质的形成, 但是突变体成熟花粉粒表面含油层异常, 具有许多小的脂肪小滴。 这些结果揭
示了 MS214 蛋白质参与蜡质合成过程, 而且脯氨酸170是该蛋白质行使功能所必需的。
关键词: 拟南芥; 雄性不育; 蜡质
中图分类号: Q 945, Q 75摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2011)03-287-06
Genetic and Functional Analysis of Arabidopsis thaliana
Male Sterile Mutant ms214
ZHOU Que, YI Jun, YANG Zhong鄄Nan, ZHANG Sen**
(College of Life and Environment Science, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China)
Abstract: Through EMS mutagenesis we obtained an Arabidopsis thaliana male sterile mutant named ms214 which
is controlled by a single recessive nuclear gene. Map鄄based cloning strategy was used and MS214 gene was mapped
to a region of 700 kb on the upper end of chromosome 1. Bioinformatics analysis revealed that there is a CER1 gene
which is involved in wax biosynthesis in this region. Sequencing analysis indicated that ms214 mutant had a C to U
base鄄pair change in the first exon of CER1 gene, which resulted in the replacement of a proline170 by a leucine170 re鄄
sidue in this region. Allelism tests indicated that MS214 and CER1 belong to the same locus. Unlike the wild type,
the mutant displays glossy green stems and siliques. Cytology observation showed that there were no differences in an鄄
ther development between the mutant and the wild type. Scanning Electron Microscopy (SEM) examination revealed
that no wax was formed on the ms214 stems and siliques. But SEM examination on pollen grains showed that the pollen
coat of the ms214 mutant was aberrant with numerous smaller lipid droplets. These data demonstrated that MS214 pro鄄
tein was involved in wax biosynthetic pathways, and proline170 is very important for the function of this protein.
Key words: Arabidopsis thaliana; Male sterile; Wax
摇 植物的有性生殖不仅是植物繁殖的主要途
径, 也是植物进化及对环境适应的基础之一。 花
药是植物的雄性生殖器官, 是花粉发育的场所。
对花药及花粉发育的研究具有重大的理论意义。
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2011, 33 (3): 287 ~ 292
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 3724 / SP. J. 1143. 2011. 10193
*
**
基金项目: 国家自然科学基金项目 (30971553)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: senzhang@ shnu. edu. cn
收稿日期: 2010-11-04, 2011-01-10 接受发表
作者简介: 周鹊 (1982-) 女, 主要从事植物基因功能研究。
花药及花粉发育异常会导致雄性不育, 雄性不育
是生产上杂交制种的基础。 因此对花药及花粉发
育的深入研究又有潜在的应用价值。
花粉外壁的主要成分是孢粉素, 通常在其表
面的腔或间隙中充满花粉覆盖物。 花粉覆盖物也
称花粉鞘或含油层, 是绒毡层细胞分泌的物质
(Bedinger, 1992)。 这些粘性的物质可使花粉相
互粘结成块, 有助于传粉媒介携带至柱头的表
面。 此外, 花粉外壁还含有一些蜡质、 角质等物
质。 植物表皮的蜡质是长链脂肪酸形成的长链脂
肪类碳氢化合物组成的复合物, 是植物表皮的重
要组成部分 (Millar 等, 1999), 它们是植物抵抗
外界环境胁迫包括干旱、 太阳辐射、 冰冻、 虫害
及致病菌感染等的重要屏障 (Post鄄Beillenmiller,
1996)。 蜡质在防止植物失水及植物受精过程的花
粉-柱头相互作用中起非常重要的作用 (Chen等,
2003; Preuss 等, 1993; Fiebig 等, 2000)。 在拟南
芥中有两条主要的蜡质合成途径, 脱羰合成途径
和酰基还原合成途径 (Millar 等, 1999)。 该合成
途径受阻常常导致茎或叶片出现异常的亮绿色
(Fiebig等, 2000), 同时, 常常导致植物雄性不育
(Chen等, 2003; Aarts 等, 1995)。 目前已经有一
些与蜡质合成相关的基因被克隆, 主要是 CER家
族和 GL家族的基因 (Millar等, 1999)。
本实验中我们获得一个拟南芥雄性不育突变
体 ms214, 遗传分析表明突变体的性状是由单个
隐性核基因控制的, 该突变体的茎和果荚的表面
呈异常的亮绿色。 本文对该突变体基因 MS214 进
行了定位和克隆, 结果表明突变基因 MS214 与定
位区间内的 CER1 基因是等位的。 对突变体进行
了细胞学以及扫描电子显微镜观察分析, 结果表
明突变基因在蜡质合成和植物育性方面起重要作
用, 而且脯氨酸170是该蛋白质起作用所必需的。
1摇 材料及方法
1. 1摇 植物材料
野生型拟南芥 (Arabidopsis thaliana) Landsberg erecta
(Ler) 生态型, 由本实验室种植。 拟南芥突变体 ms214
是 Ler生态型。
1. 2摇 方法
1. 2. 1摇 植物材料的种植摇 种植方法同易君等 (2006)。
1. 2. 2摇 突变体的背景纯化与遗传分析摇 以野生型 Ler植
株作为父本, 突变体作为母本进行杂交得到 F1 代, 收
获 Fl代种子, Fl 种下后自交, 获得 F2 代种子, 种植下
去, 并观察 F2 代表型, 统计 F2 代中可育植株与不育植
株的比例。
1. 2. 3摇 DNA提取摇 拟南芥基因组 DNA的提取参照方法
(Zhang等, 2003)。
1. 2. 4摇 PCR 反应 摇 PCR 反应参照易君等 (2006) 的方
法。 引物的序列由英潍捷基 (上海) 贸易有限公司合
成。 用 2. 5%的琼脂糖凝胶进行电泳验证 2 个亲本 Ler和
Col之间的多态性。
1. 2. 5摇 雄性不育基因的定位摇 以野生型 Col植株作为父
本, Ler背景的突变体植株作为母本进行杂交得到 F1
代, F1 代自交后得到 F2 代, 收集 F2 代中的不育植株用
于基因定位。 基因初定位的方法及所用分子标记同易君
等 (2006), 一旦找到了连锁的分子标记, 就在该分子
标记附近设计新的分子标记 (表 1), 用高通量提取
DNA的方法 (Xin等, 2003) 提取大批 F2 遗传群体中的
突变体单株 DNA, 对这些植株进行基因型分析, 对目的
基因进行进一步定位。
1. 2. 6摇 花药发育的光学显微镜观察摇 野生型与突变体
植株的花序在 FAA 固定液中固定 12 ~ 24 h 后, 用 50%
乙醇洗 2 ~ 3 次, 常规脱水, Spurr 树脂包埋, 切片, 片
厚约 1 滋m, 1%甲苯胺蓝染色后在显微镜下观察并拍照
(Zhang等, 2007)。
1. 2. 7摇 茎、 叶、 果荚和花粉的扫描电镜观察摇 (1) 新
鲜材料直接制样: 分别取 5 株野生型与突变体新鲜植株
茎、 叶、 果荚及 13 期正常和潮湿环境下生长的突变体的
花粉, 置于扫描电镜的座台上, 直接真空干燥, 喷金后
观察。 (2) 固定后制样: 野生型和突变体取 13 期的花
朵, 2. 5%戊二醛溶液固定过夜, 用 pH7. 2 的磷酸缓冲溶
液充分洗涤后, 再经1%锇酸溶液固定4 h, pH7. 2的磷酸
缓冲溶液充分洗涤, 梯度乙醇脱水, 临界点干燥后分离
雄蕊, 将花粉撒在扫描电镜座台上, 喷金后观察。
1. 2. 8摇 胼胝质特异性染色 摇 将正常环境和潮湿环境下
生长的野生型和突变体的 13 期花朵用 0. 01%苯胺蓝溶
液染色后, 在紫外光激发下观察其柱头有无胼胝质发出
的特异性黄绿色荧光, 并用 Olympus DP70 数码相机拍照
记录。
2摇 结果与分析
2. 1摇 突变体 ms214 的表型观察
为了研究参与花药发育的相关基因, 我们通
过 EMS诱变了一批野生型拟南芥 (Ler) 种子,
经过背景纯化获得了一株雄性不育突变体
ms214。 与野生型植株比较, ms214 突变体的果
882摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 33 卷
荚短小萎缩, 成熟后不含种子 (图 1: A, B)。
将突变体植株与 Ler野生型的花粉做杂交后可以
结出正常的果荚, 说明突变体的雌蕊是可育的。
增加突变体生长环境的湿度, 不育突变体植株长
出正常的果荚, 说明 ms214 为环境控制的雄性不
育突变体 (图 1: C)。 突变体的茎和果荚表面呈
图 1摇 突变体 ms214 的表型分析
野生型 Ler (A) 和突变体 ms214 (B) 植株的形态比较; C. 增加
生长环境的湿度, 突变体植株的果荚变得膨胀; D. 突变体的茎
(右) 表现出与野生型的 (左) 不同的亮绿色; E. 突变体的果
荚 (右) 呈现出与野生型 (左) 不同的亮绿色
Fig. 1摇 Characterization of the ms214 mutant
Comparison of morphology between wild type (A) and ms214 mutant
(B) plant; C. Mutant siliques become large at wet environment; D.
Mutant stem (right) looks glossy green which is different from the wild
type (left); E. Mutant silique ( right) looks glossy green which is
different from the wild type ( left)
现出与野生型不同的亮绿色 (图 1: D, E), 植
株的其它部位并没有这种表型特征。
2. 2摇 突变体 ms214 花药的光学显微镜观察
为了分析突变体雄性不育的原因, 我们通过
树脂切片技术在光学显微镜下观察比较了突变体
和野生型花药发育的各个时期 ( Sanders 等,
1999)。 结果表明二者之间没有差异, 花药最后
都能形成花粉, 并能开裂释放花粉 (图 2)。 这
说明突变体的不育不是由花药发育过程造成的。
图 2摇 第 13 时期突变体 (A) 和野生型 (B) 花药的
横切面比较 (标尺为 10 滋m)
Fig. 2摇 Comparison of anther transverse sections of mutant plant
(A) and the wild type (B) at stage 13 (bars=10 滋m)
2. 3摇 突变体 ms214 的花粉、 茎、 果荚、 叶的扫
描电镜观察
为了进一步探讨突变体不育的深层次原因,
以及茎、 果荚呈现出与野生型不同的亮绿色的原
因, 我们对突变体和野生型的花粉、 茎、 果荚和
叶片的表面进行了扫描电镜观察分析。 结果发
现, 与野生型正常花粉相比 (图 3: A, B), 突
变体的花粉表面透明度低, 似有一层油状物
(图 3: E, F)。 在较高湿度的环境中生长的突变
体花粉表面趋于正常, 接近野生型的花粉 (图 3:
图 3摇 野生型与突变体花粉扫描电镜的观察
A-F: 新鲜花粉观察, A和 B. 野生型; C和 D. 潮湿环境中生长的突变体; E和 F. 突变体; G-J: 固定后花粉观察;
G和 H. 野生型; I和 J. 突变体 (A, C, E, H, J中标尺为 5 滋m; B, D, F中标尺为 1 滋m; G, I中标尺为 10 滋m)
Fig. 3摇 Scanning electron microscopy examination of wild type and mutant pollen grains
A-F: Fresh pollen. A and B, Wild type pollen; C and D, Mutant pollen at wet envronment; E and F,
Mutant pollen; G-J: Fixed pollen grains. G and H, Wild type pollen; I and J, Mutant pollen grains
(bars in A, C, E, H, J=5 滋m; bars in B, D, F=1 滋m; bars in G, I=10 滋m)
9823 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 周鹊等: 拟南芥雄性不育突变体 ms214 的遗传与功能分析摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
C, D)。 与野生型的花粉表面比较 (图 3: G,
H), 经过固定的突变体花粉表面凝聚了许多白
色颗粒状凝结物, 说明突变体花粉表面的油脂数
量或种类发生了变化 (图 3: I, J), 这种变化可
能是导致突变体不结种子的原因。
与野生型的茎和果荚上表皮具有明显可见的
蜡质 (图 4: A, C) 相比, 突变体的茎和果荚上
表皮表面光滑, 没有蜡质的形成 (图 4: B, D);
而突变体的叶片上表皮表面与野生型的没有区
别, 均没有明显可见的蜡质形成 (图 4: E, F)。
2. 4摇 花粉管胼胝质特异荧光染色观察
在拟南芥生长发育过程中, 花粉成熟后落到
柱头上, 萌发出花粉管, 花粉管表面形成一层胼
胝质, 用苯胺蓝溶液染色可在荧光显微镜下观察
到特异荧光。 用苯胺蓝浸染野生型雌蕊柱头后,
会看到萌发花粉管发出黄绿色的荧光。 而突变体
的柱头经苯胺蓝染色后, 没有观察到荧光 (图
5: A), 但高湿度环境下生长的突变体的柱头经
过染色后, 观察到了明显的荧光 (图 5: B)。 说
明正常环境中突变体的花粉不能萌发, 造成不
育, 但是环境增湿后, 突变体的花粉能成功的萌
发形成花粉管, 从而发出荧光, 也能完成受精过
程, 这时突变体就变得可育了。
2. 5摇 突变体 ms214 的遗传分析
为了确定突变体 ms214 是否由单个基因控
制, 将野生型 Ler做为父本, 突变体做母本杂交
得到 F1 代, 其表现为野生型表型, 植株可育,
说明该突变体受隐性基因控制。 F1 代自交, 得
到的 F2 代群体中出现性状分离, 经过统计得可
育植株 179 株, 不育 60 株, 两者比例接近 3 颐 1
(X2 = 0. 00139
基因调控的。
2. 6摇 MS214 不育基因的定位与克隆
为进一步研究 ms214 突变体并最终克隆突变
基因, 利用图位克隆的方法对突变体进行了遗传
定位, 以确定该突变基因在染色体上的位置。 首
先, 选用在拟南芥基因组 5 条染色体上分布均匀
的 20 对分子标记 (易君等, 2006) 进行基因的
初定位连锁分析。 这 20 对分子标记在野生型 Ler
和 Col之间具有序列的多态性。 以这些分子标记
进行 PCR, 结果表明突变基因 MS214 与第 1 条
染色体上的分子标记 F13K23 连锁。 利用新设计
的分子标记 (表 1) 结合用高通量 PCR 方法
(Xin等, 2003), 最终将基因 MS214 定位在第 1
条染色体顶端分子标记 T7I23 和 F21M11 之间
700 kb区间内。
根据网上 (www. arabidopsis. org) 公布的拟
南芥第一条染色体上该定位范围的序列信息, 这
里面包含一个基因 CER1, 其突变体 cer1与 ms214
图 4摇 野生型与突变体茎、 果荚、 叶片的扫描电镜观察
野生型 (A) 和突变体 (B) 的茎, 突变体的茎没有蜡质覆盖; 野生型 (C) 和突变体 (D) 的果荚, 变体体果荚
没有蜡质覆盖; 野生型 (E) 和突变体 (F) 的叶片, 突变体与野生型没有区别 (标尺为 10 滋m)
Fig. 4摇 Scanning electron microscopy examination of wild type and mutant stems, siliques and leaves
Wild type (A) and mutant (B) stems, no wax on the mutant stem; Wild type (C) and mutant (D) siliques, no wax on
the mutant silique; Wild type (E) and mutant (F) leaves, no difference between them (bar=10 滋m)
092摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 33 卷
表 1摇 本研究所涉及的新设计分子标记引物序列
Table 1摇 Sequences of molecular markers used in this work
分子标记 Molecular marker 正向引物 Forward primer 反向引物 Reverse primer
摇 摇 摇 摇 F7C19 TTACAAGTCAACAGGTTTAG AAATATGGATATAAACAAAC
摇 摇 摇 摇 T7I23 TGTATTTGAAGTGGGATGAA AACTATGGGTCTGACTGGTA
摇 摇 摇 摇 F21M11 CTTCTCTGCGAACGTTACTC GGACGGGTTCGAAAACAAT
摇 摇 摇 摇 F12K11 TATATTTCTCGAATCTAACC GAGCCTGTCACCAACTAC
摇 摇 摇 摇 F13K23 CTTGATAGTCATTAATAC AGAACTTGCTTGCTATGC
摇 摇 摇 摇 F26F24 TTGGTTGCTCTAAATCAC TTGCCAATAATAAGAAGG
图 5摇 正常环境 (A) 和潮湿环境 (B) 中生长的突变体
花粉萌发时胼胝质特异性染色
Fig. 5摇 Specific staining of callose during mutant pollen germination
at normal (A) and wet (B) environment
突变体表型相似。 因此, 我们克隆了突变体中该
基因的 DNA 序列和 cDNA, 通过测序分析并与
野生型序列比对。 结果表明在突变体中, 该基因
的第一个外显子上第 509 个碱基对由 C509变成了
U509, 导致该基因编码的蛋白质的氨基酸序列中
第 170 个氨基酸由脯氨酸170变成了亮氨酸170, 说
明突变体在该基因座位发生了突变 (图 6: A)。
通过等位实验, 以 ms214 突变体的杂合子植株为
父本, cer1 突变体为母本进行杂交, 得到 F1 代
植株的表型更接近 cer1 突变体的表型, 这表明
ms214 突变体和 cer1 突变体是等位的。 在 cer1 突
变体中, CER1 基因的突变是由于 I / dSpm 元件
的插入造成的, 该元件插在 CER1 基因序列的
971 bp的位置 (Aarts等, 1995)。
2. 7摇 MS214 基因的序列分析
为了分析 MS214 基因的一级结构, 我们对
其编码区的碱基序列进行了分析, 该基因基因组
序列全长 2643 个碱基, 包含了 7 个外显子 (分
别为 517, 220, 391, 108, 201, 273, 174 碱基
对) 和 6 个内含子 (分别为 71, 83, 295, 123,
85, 102 碱基对) (图 6: A)。 该基因编码的蛋
白有 627 个氨基酸, 分子量是 72. 1 kDa。
按照 Pfam数据库 ( (http: / / www. sanger. ac.
uk / Software / Pfam / ) 中的数据进行分析, 发现在
拟南芥中有 3 个和 MS214 基因同源的基因。 系
统进化分析显示 MS214 基因在无根进化树中单
独形成一个分支, 说明 MS214 基因在拟南芥中
具有独特的功能 (图 6: B)。
图 6摇 CER1 基因序列和系统进化分析
A. MS214基因一级结构以及核苷酸变化的位置。 黑色方格子表
示MS214基因外显子; B. 拟南芥中 CER1家族蛋白的无根系统进
化树。 利用MEGA3. 1计算遗传距离, 用邻接法分析 CER1基因家
族蛋白的氨基酸序列。 节点处的数字表示基于 1 000 次重复的自
举值。 分支的长度与每个点处期望的氨基酸替换数目成正比, 这
与图下面的比例尺是一致的。 图中箭头表示 CER1 (At1g02190)
Fig. 6摇 Sequence and phylogenetic analysis of MS214 gene
A. The MS214 gene structure and position of the nucleotide change in
ms214 mutant. The black boxes indicate MS214 exons; B. Unrooted
phylogenetic tree of the CER1 family proteins in Arabidopsis. Amino acid
sequences of CER1 family proteins were analyzed by the neighbor鄄joining
method with genetic distance calculated by MEGA3. 1. The numbers at
the nodes represent percentage bootstrap values based on 1 000 replica鄄
tions. The length of the branches is proportional to the expected num鄄
bers of amino acid substitutions per site, with a scale provided at the
bottom of the tree. The arrowhead indicates CER1 (At1g02190)
3摇 讨论
植物雄性不育是指植物体中雄蕊发育由于受
到某些内、 外因素的影响而发育不正常, 无有效
花粉形成, 但这种影响对雌蕊发育的影响很小或
1923 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 周鹊等: 拟南芥雄性不育突变体 ms214 的遗传与功能分析摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
无影响, 雌蕊能正常发育和正常受精的一种不育
现象, 在植物界是很普遍的。 蜡质是长链脂肪酸
衍生物的混合物, 存在于许多生物有机体中, 同
时也存在于拟南芥花粉粒的表面, 对花粉的吸
水、 萌发、 甚至花粉管的生长是非常重要的。 蜡
质合成有关基因的突变会导致植物的雄性不育,
因此, 蜡质对植物的育性保持也是必需的 (Chen
等, 2003)。
花粉成熟后, 其新陈代谢即基本停止, 并呈
干粉状, 一般含水量为 15% ~ 35% 。 当它落在
湿润的柱头上, 花粉周围立即被水包围, 花粉吸
水含水量增加并开始萌发; 但是当花粉落在比较
干燥的柱头上时, 花粉必须依靠自身花粉壁的含
油层所形成的界面利用水势梯度从柱头吸收水分
(Buitink等, 2000)。 拟南芥柱头属于干燥型的,
一旦长链脂肪酸的代谢途径受阻, 就会影响到花
粉表面含油层中蜡质的形成, 进而大大降低花粉
在柱头上的水合作用, 从而导致植物雄性不育。
雄性不育突变体 cer1, cer6 和 cut1 等就是由于花
粉表面缺少蜡质造成的 (Aarts 等, 1995; Fiebig
等, 2000; Millar 等, 1999)。 本实验中 ms214 突
变体与 cer1 突变体经过等位分析证明是等位的,
具有类似的表型。 而且我们的实验中, ms214 突
变体花粉表面的含油层的量或成分的变化, 使花
粉在柱头上的水合作用大大降低, 花粉粒缺少水
分不能萌发从而造成不育。 这说明该突变体的脂
肪酸代谢途径受阻, 影响了蜡质的合成, 导致了
花粉表面含油层的成分发生改变。
在我们的突变体 ms214 中, 通过 EMS 诱变,
造成了 MS214基因蛋白氨基酸序列中第 170 位的
氨基酸发生了突变, 由脯氨酸变成了亮氨酸, 产
生了与 cer1突变体相似的表型, 而且等位分析的
结果表明, ms214突变体与 cer1 突变体是等位的,
但它们的基因突变位点不同。 在 cer1 突变体中,
基因突变是由于 I / dSpm 元件插入 CER1基因编码
区的 971 bp位置造成的。 这种插入破坏了基因读
码框, 导致该位点后的基因序列不能表达, 蛋白
功能丧失, 突变体表现出不育的表型。 在突变体
ms214 中, CER1 基因第 170 位单个氨基酸的变
化, 就导致了不育表型的出现, 说明第 170 位的
脯氨酸在 CER1蛋白功能的作用是非常重要的。
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