全 文 ：用 !#$技术探讨冬青属苦丁茶的遗传差异、
亲缘关系与分类地位!
张凤琴!，刘国民!!，周 鹏，徐立新!，郭安平
（! 海南大学苦丁茶研究所，海南 海口 #$%&； 中国热带农业科学院热带作物生物技术
国家重点实验室，海南 海口 #$!!%!）
摘要：利用随机扩增多态性 ’()（*)+’）技术对 份冬青属苦丁茶不同种质材料的遗传变
异进行了研究。,%个 !%-./的引物用于多态性检测，从中筛选出了 $个多态性良好的引物。
用该 $个引物对上述 份种质材料进行 +0*扩增，共得到 ,,#条 ’()谱带，其中多态性带
,1条，占 2$3%&4。根据扩增结果计算了各份材料之间的遗传距离，并用 5+67)构建了聚
类树状图。分析结果表明：份供试材料分成 ,类 #组，第!类为 !#$ %#&’()*&(（分为 )、8
两组：)组为新变种 9:;3 +(,-(&#&,., 6< 7< =<；8 组为原变种 9:;3 %#&’()*&(），第 类 为
! 3 /01.&)2-(，第#类为 ! 3 (’.3*.(，第$类为 ! 3 2*4&0’(；第，#，$三类各有一组材料组
成。物种的差异、亲缘关系以及同一物种内不同种质材料在起源地域上的差异均可从系统树
中反映出来。*)+’分子标记的结果可作为判断冬青属苦丁茶种质资源材料的起源地域、遗
传差异、亲缘关系以及种级水平和种下分类鉴定的重要参考依据。
关键词：冬青属；苦丁茶冬青；遗传差异；*)+’分析
中图分类号：> 2,? 文献标识码：) 文章编号：%#1 @ $%%（%%,）%? @ %?1$ @ %&
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收稿日期：%%, @ %, @ %!，%%, @ %? @ %!接受发表
作者简介：张凤琴（!2$? @）女，湖南人，硕士研究生，主要从事苦丁茶种质资源研究；现为中国科学院南海
海洋研究所在读博士。
基金项目：国家自然科学基金资助项目（12&?%%,&；1%%?%%,%）：OND /;J_DQPR WD;D RI//J;PDT .Y PND (:PGJE:S (:PI;:S
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“苦丁茶”并非山茶科植物，而是我国民间作为传统代茶饮料使用或茶药两用的一大
类植物的统称，涉及 B@ 个科 BI 属，至少有 IC 种植物（包括变种，变型）（刘国民，
@CCI）。其中，冬青属主要有苦丁茶冬青（ !,#- .+/0$’)1& %# X # M7’(,）、大叶冬青（ ! ! ,&%04
5(,0& M&F(8#），五棱苦丁茶（ ! ! #$%&’($& # $# %&’(# )# *# +’(, ’- %# +# ./0(,）以及
枸骨（ ! ! )(*$+%& ./(12 #）等 E种植物在我国民间作为“苦丁茶”使用（史学群等，@CCI）。
此外，何云核（@CC@）最近还报道冬青科新种霍山冬青（ ! ! 1(+31&$#$303 )# W# W’）在大
别山地区作为“苦丁茶”使用（据我们实地考察，主要是在安徽霍山地区）。冬青属苦丁
茶种类较多，遗传背景非常复杂，而且某些分类学领域中的问题至今尚有争议。例如，自
曾沧江教授（BJKB）发表新种苦丁茶冬青（ !,#- .+/0$’)1& %# X # M7’(,）以来，关于该新种
及有关近缘种的分类学地位问题，特别是 ! ! .+/0$’)1& 是否应与 ! ! .&+31+# # )# WF归并
的问题，就一直存在着争议（曾沧江，BJKB；俸宇星等，BJJK；王玉国和韦发南，@CCC，
@CCB；陈书坤，BJJJ，@CCB；刘国民等，@CCE）。冬青属苦丁茶种质资源的遗传差异以及它
们之间的亲缘关系是一个比较复杂的问题。根据我们近年的研究，以往的争议在很大程度
上是由于不同学者所依据的研究材料之种类不同（腊叶标本或活体材料），或因标本数量
有限，或是由于依据的标本其来源地域不同而引起的。特别是冬青属的主要苦丁茶种类
! ! .+/0$’)1&分布地域较广，加之其遗传多样性比较丰富，故不同研究者依据的实验材料
不同，所得出的研究结论往往相互之间有较大出入，或者是相互矛盾的。甚至同一学者，
由于在不同时期所采用的实验材料或研究方法不同，所得出的部分结论可能是前后矛盾
的。海南大学苦丁茶研究所近年来在我国冬青属苦丁茶的主要原产地和主要栽培区（广
东，广西，海南，云南，四川，贵州，湖南，湖北，浙江，安徽等省区）多次进行实地考
察，从这些省区共收集了 HCC余份有代表性的冬青属苦丁茶种质材料，并创建了一个冬青
属苦丁茶种质资源圃。为了澄清以往在冬青属苦丁茶的某些分类学问题上的争议，我们拟
KIY 云 南 植 物 研 究 @Y卷
综合运用形态学研究，同工酶分析及 !#$技术确定其各类群之间以及同一类群不同种质
材料之间的遗传差异与亲缘关系，并根据研究结果对经典的形态分类中关于冬青属苦丁茶
分类地位的有关结论予以验证，或根据研究结果将其予以修正。关于形态学研究及同工酶
分析的结果我们已作了报道（刘国民等，%&&’；史学群等，%&&(），或在近期内陆续报道；
以 ! ) #$%&’()* 为代表的冬青属苦丁茶 !#$分析的影响因素及实验条件的优化已作了报
道（张凤琴等，%&&(）；本文报道冬青属 ’种常用“苦丁茶”以及一些相关变异类型共 %%
份种质材料的 !#$分析结果。
! 材料与方法
!! 材料
从海南大学苦丁茶种质资源圃中所定植的种质材料上取嫩芽作为本研究的供试材料，各份种质材料
的原产地如表 *所示。
表 ! 用于 #$%&分析的 ’’份冬青属供试种质材料及其原产地
+,-./ * %% +/01 2/345.,04 4,1/36,.0 70/8 9:3 !
!!
#$ ,;,.<060 ,;8 1=/63 :3626;0
编号 >:8/0 物种名称 ?5/@6/0 原产地 A3626;0 编号 >:8/0 物种名称 ?5/@6/0 原产地!! A3626;0
BC &&* ! ) #$%&’()* 海南白沙 BD C &&* ! ) +,&-*’.&*!! 广西大新
BC &&% ! ) #$%&’()* 广东英德 BD C &&’ ! ) +,&-*’.&*!! 广西大新
BC &&( ! ) #$%&’()* 广东英德 BD C &&E ! ) +,&-*’.&*!! 湖南湘西
BC &&F ! ) #$%&’()* 广东清新 BD C &&F ! ) +,&-*’.&*!! 湖南湘西
BC &&G ! ) #$%&’()* 广东清新 $ C &&* ! ) /*-%0./%*!! 浙江淳安
BC &*& ! ) #$%&’()* 广东大埔 $ C &&( ! ) /*-%0./%*!! 浙江缙云
BC &** ! ) #$%&’()* 广东大埔 $ C &&’ ! ) /*-%0./%*!! 浙江永康
BC &*E （？） 广西马山 $ C &&H ! ) /*-%0./%*!! 浙江磐安
> C &*E% （？） 广西大化 II C &&* ! ) (.1&#-*!! 海南海口
> C &*E( （？） 广西大化 II C &&( ! ) (.1&#-*!! 湖南祁东
> C &*EF （？） 广西大化 II C &&’ ! ) (.1&#-* 湖北宜昌
（？）：表示形态上介于五棱冬青与苦丁冬青之间的种质材料。
!’ 方法
*)%)* 总 $J的提取 采用修改后的 >+K法（$:<./ L $:<./，*HMG）。称取上述冬青属苦丁茶种质材料
的嫩叶 &)E 2液氮研磨，装入 E 4.离心管并加入 *)M 4.提取液（%N >+K；*&& 44:.OD +360PQ>.；*)’ 4:.OD
J,>.；%& 44:.OD R$+；&)EN!PSR），FET水浴 ’& 46;，用氯仿O异戊醇（%’U*）抽提一次，取上清液于另
一 E 4.离心管用等体积的饱和酚抽提一次，再取上清液于另一 E 4.离心管再用氯仿O异戊醇（%’U*）抽提
一次，用 ’T &)G体积的异丙醇沉淀 $J，*% &&& 3O46;，*& 46;收集 $J沉淀，用 GEN乙醇洗涤沉淀两
次，自然吹干，用 M&&. +R溶解 $J，加入 M.的 !J,0/贮藏液（浓度为 *& 42O4.），于 (GT保温 (& 46;，
再用酚O氯仿O异戊醇（%EU%’U*）抽提一次，上清液用氯仿O异戊醇（%’ U *）抽提一次，再用 ’T &)G体积
的异丙醇沉淀 $J，*% &&& 3O46;、*& 46;收集 $J沉淀，用 GEN乙醇洗涤沉淀两次，自然吹干，用 M&.
88Q%A溶解。琼脂糖凝胶电泳 C RK染色检查 $J有无降解，用 GE%型紫外分光光度计测定吸光度以确定
$J浓度和纯度， C %&T保存备用。
*)%)% $J的扩增 实验参考 B6..6,40等（*HH&）创建的方法。反应在 +I!$VRJ+ +=/34:@<@./3型 #>!
仪上进行；从购自上海 ?,;2:;公司的 ?系列 ’&个引物中，共筛选出 %G个扩增多态性好的引物进行扩增。
+,W $J聚合酶购自华美生物工程公司；8J+#购自北京经科生物技术有限公司。反应体积为 %E.包括：
*& X反应缓冲液（不含 S2% Y），&)% 44:.OD 8J+#0，E 54:.引物，*)E 44:.OD S2>.%，*)E Z+,W酶，’& ;2模
H(FF期 张凤琴等：用 !#$技术探讨冬青属苦丁茶的遗传差异、亲缘关系与分类地位
板脱氧核糖核酸。反应程序为：!#预变性 $%&，!#变性 ’( )，复性温度为 ’*#，复性时间 ’( )，延
伸温度为 +,#，延伸时间 , $%&，-个循环后再在 +,#延伸 .( $%&。
./,/’ 扩增产物的检测 取 .(!0扩增产物，用 ./1琼脂糖凝胶电泳检测，23染色，在 4567898 :;
< 型凝胶成像系统中观察、分析、记录。
./,/ 谱带的统计分析 每个反应重复一次。=>6?条带的记录，以“有”赋值为 .，“无”赋值为 (。
根据 @A% B C%（.!+!）的方法计算材料间的遗传相似系数 D，D E ,@%F G（@% H @F），其中 @%，@F 为两材料各
自的总扩增带数，@%F为两材料所共有的扩增带数，材料间的遗传距离 ?E . I D。用 46J:>法对材料进行
系统聚类分析（徐克学，.!!）。
! 结果与分析
!# 引物的筛选及 $%&扩增结果
在供试的苦丁茶冬青（ !#$ %&’()*+,- K; L ; 9)A&M ）、五棱苦丁茶（ ! / .#)/-*0)- N; O;
KPA&，Q; R; DA&M AS K; D; C%T&M）、大叶冬青（ ! / -/(10(- 9PU&V;）和枸骨（ ! / +0)&/-
C%&W0 ;）等 种冬青属苦丁茶中每个物种任选 ,份种质材料，对购自上海 NT&MX&公司 N系
列 (个 .(YVZ随机引物进行筛选，共筛选 ,+个有效引物（扩增出的谱带呈多态性、清晰、
至少有 ’条）。用这 ,+个引物对冬青属内上述 个物种的 ,,份苦丁茶种质材料进行扩增，
共扩增出 - 条谱带，其中多态性带有 ’, 条，占总带数的 !+/([1，每个引物检测出
=>6?多态性的平均带数为 .[/’（表 ,）。不同引物所扩增出的谱带数不同；同一引物，不
同供试种质材料之间的扩增带数也不相同（图 .，图 ,）。这反应了各个材料之间存在丰富
的多态性，同时也表明了冬青属苦丁茶物种之间遗传背景的复杂性。另一方面，由于存在
共同的扩增谱带，也说明冬青属不同苦丁茶种质材料在起源上的某些共同性，或者说，它
们之间有不同程度的亲缘关系。
表 ! 用 !’个引物对 !!份冬青属苦丁茶种质材料的 (&)$扩增结果
9TV0A , ,+ 6\%$A\) T&W SPA T$Z0%]%^TS%X& \A)U0S) X& ,, O4?_@JK7> MA\$Z0T)$ $TSA\%T0) %& !#$
!!
C;
引物 碱基序列（-‘’‘） 扩增带数 多态性带数 引物 碱基序列（-‘’‘!! ） 扩增带数 多态性带数
6\%$A\) NAaUA&^A) @U$VA\) X] @U$VA\) X] 6\%$A!! \) NAaUA&^A) @U$VA\) X] @U$VA\) X]
（-‘’‘） VT&W T$Z0%]%AW ZX0b$X\ZP%^ （-‘’‘）!! VT&W T$Z0%]%AW ZX0b$X\ZP%^
!!VT&W) VT&W)
!!N. J999KJK9KK ! [ N,, 9JKKJ>JK9J ,* ,*
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!!N JJ>K9JJ>J9 .[ .- N, >>9KJJJK9J .- .-
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!!N* 9JKJKKK99K ,. ,. N,* JJ9KKK9J>K .[ .[
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!!N,( JJ>KKK99>K . . N[! K9J>KJ9K>K ,, ,,
N,. K>JJKKK99K .. ..
!! 冬青属苦丁茶种质材料的聚类分析
用筛选出的 ,+个引物对不同物种和不同地域来源的 ,,份冬青属苦丁茶种质资源材料
(* 云 南 植 物 研 究 ,*卷
进行 !#扩增，将所得谱带经统计分析后，根据遗传距离进行聚类，所得系统树如图 $
所示。根据系统图，可将供试的 %%份种质材料分为 &类 ’组。
图 $ ()$引物的 #*!+产物图谱
,-./ $ 012 3456-7-28 92:;6<: =7 59-429 ()$
图 % (%%引物的 #*!+产物图谱
,-./ % 012 3456-7-28 92:;6<: =7 59-429 (%%
第!类：包括 > ?$’%， > ?$’)， > ?$’@，AB > ?$’，AB > ??$，AB > ??&，AB >
??’，AB > ??@等 C份材料。这些材料可分为两组，即 *组和 D组。其中 *组系形态上介
于五棱苦丁茶（ ! E #$%&’($&）和苦丁茶冬青（ ! E )*+,$’-.&）之间的中间类型，包括 >
?$’%， > ?$’)， > ?$’@和 AB > ?$’等 &份材料；D组包括 AB > ??$，AB > ??&，AB >
??’和 AB > ??@等 &份形态上表现为典型的五棱苦丁茶的种质材料。*组的材料在形态上
有两个最突出的特点，一是革质的叶片较苦丁茶冬青厚而较五棱苦丁茶薄，侧脉于叶背仅
能隐约可见，网脉完全不可见；既不像苦丁茶冬青那样叶片为薄革质，侧脉和网脉于叶背
凸突，十分清晰，也不像典型的五棱苦丁茶那样，叶片为厚革质，侧脉和网脉于叶背完全
不可见，或仅能在一些年龄较老的功能叶中于仅能十分模糊地于叶背观察到侧脉。二是其
尚未木质化和尚未完全木质化的茎（或小枝）既不像五棱苦丁茶那样具 ’条显著凸突的纵
生锐棱，也不象典型的苦丁茶冬青之尚未木质化或尚未完全木质化的茎（或小枝）那样，
具 & F ’条上下深浅不等的沟槽，每条沟槽发源于腋芽（或小枝）的着生处，在向上延伸
的过程中逐渐变浅，并于该沟槽上延时所触及的上一个叶柄的着生处完全消失。这种中间
类型其茎兼有沟槽和纵棱，但分别不如苦丁茶冬青和五棱苦丁茶那样典型。此外，中间型
材料在花器的形态上也有其独特的特征，即雄花的花瓣上部约 %G’的为紫红色；雌花的花
瓣上部约 $G’ F $G&亦为紫红色。这些特征是五棱苦丁茶和苦丁茶均不具备的。鉴于在系统
树图中，*组与 D组（典型的五棱苦丁茶种质材料）为平行的两支，故我们有理由可以根
据形态学研究和 #*!+分析的结果，将 *组和 D组划分为五棱苦丁茶的两个不同的变种，
其中 D 组为五棱苦丁茶原变种，*组为另一变种，暂名为“马山苦丁茶”： !/#0 #$%&’($&
(/ H/ 12I，J/ K/ ,2I. 2< / ,/ B-3I. L39E 1&2.&$#$2,2 M/ N/ B-;（形态学及分类学研
究的详细资料将另文发表）。
第类：亦即 组，由A> ??$，A> ??%，A> ??)，A> ??@，A> ??O，A> ?$?和A
> ?$$等 O份的苦丁茶冬青种质材料组成，其中 A > ??$ 是在海南岛白沙县境内发现的，
其余 @份分别来自广东省境内的不同地区。O份野生的苦丁茶冬青种质材料基本上均是按
其地域来源聚类。海南岛远离大陆，由于琼州海峡的地理隔离，故起源于海南岛的野生苦
$&@@期 张凤琴等：用 #*!+技术探讨冬青属苦丁茶的遗传差异、亲缘关系与分类地位
丁茶冬青种质材料在其系统发育过程中几乎不受外来基因的影响，形态特征上亦明显有别
于大陆各地区起源的种质材料。在聚类时，起源于海南的野生种质材料（! ##$）单独
聚类，而起源于广东境内的 %份种质材料先是基本按其在广东省境内的分布地域聚类（个
别有交叉），而后相互聚合成一支，再与海南岛的种质材料聚合成第!类。
图 & ’’份冬青属苦丁茶种质材料的聚类分析图
()*+ & ,-./01*023 410 ’’ *-0356273 328-0)267 14 9:,;<=>?@ ). !#$ A+ B27-/ 1. C6D78-0 2.26E7)7（:F=G@）
第类：亦即 , 组，由 , ##$、, ##&、, ##H 和 , ##I 等 H 份野生大叶冬青
（ ! J %&’()’% KLD.B+）种质材料组成，它们分别引自浙江省境内的不同县市，这 H份野生种
质材料的遗传差异不是很大，聚类时形成与苦丁茶冬青平行的第类。
第#类：亦即 M 组，包括 == ##$、== ##& 和 == ##H 等 & 份枸骨（ ! J *)+,-&%
A)./6+）种质材料，但来源于不同省份。其中 == ##$引自海口市，== ##&引自湖南省
祁东县，== ##H引自湖北省宜昌县。其中 == ##$与 == ##&在形态上较接近，而与
== ##H就有较大差异。从地理上说，湖南祁东与湖北宜昌相距较近，而与海南岛的海口
市相距较远，且有琼州海峡相隔。但根据《海南植物志》等文献介绍，海南岛并无野生枸
骨的记载。我们所收集的 == ##$这一枸骨种质材料来自海南大学园林苗圃中，其原产
地不详。我们推测，海南大学苗圃的这份种质材料很可能是从大陆某个距湖南省祁东县相
对较近的地域内引种到海南的。因此在聚类时，== ##$先是和 == ##&聚在一起，然后
再与 == ##H聚合成第#类。
’H% 云 南 植 物 研 究 ’%卷
! 讨论
随机扩增多态 !#（$%&’() #)*+,-,.’ /(+0)(1*2,3 !#，$#/!）技术，是建立在 /4$
反应基础上，用以检测基因组 !#多态性的一种分子标记技术。已被广泛应用于种、亚
种、变种、品种或不同基因组的亲缘演化关系和分类等方面的研究（5,++,%)6等，7889；
!.).:.等，788;；<=6%& 等，788>；?%1&2%)，788@；汪小全等，788@；施苏华等，788A；
邹喻苹等，7888；周永红等，7888）。本研究选用 ;; 份冬青属苦丁茶种质材料，利用
$#/!技术系统地研究冬青属苦丁茶种质资源材料之间的遗传差异与亲缘关系，供试的 ;;
份冬青属苦丁茶种质材料，其遗传距离在 9B;@AC D 9BEE89之间。从形态上看，五棱苦丁茶
的两组材料（两个变种）最接近，然后再按五棱苦丁茶!苦丁茶冬青!大叶冬青!枸骨的
顺序，形态差异渐次增大。$#/!分析中的聚类结果与形态差异的观察结果完全吻合；同
一种物种内不同种质材料的起源地域也可以清晰地从系统树图中反映出来。这表明，
$#/!分子标记的结果完全可以作为判断冬青属苦丁茶种质资源的起源地域、遗传差异、
亲缘关系以及种级水平和种下水平分类鉴定的重要参考依据。
$#/!分析的重复性一直是国内外研究者十分关注的问题。史永忠等（788A）在柑桔
$#/!技术体系建立与体细胞杂种鉴定的实验中证明，在已确定的实验体系下，柑桔 /4$
扩增的重复性良好。F1%2%)等（788@）在草莓（!#$#%# #&#&#’’# !=32.6&.）上重复扩增 >
次，所得结果一致。我们在本研究中，对每个反应均重复一次，所得结果也是一致的。因
此，我们认为，只要确保采用同一套优化的实验体系，并采用同一厂家生产的试剂，
$#/!分析的结果重复性是相当高的。也就是说，$#/!分析结果是可靠的。
〔参 考 文 献〕
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