全 文 ：菘蓝花药培养及单倍体的诱导*
李摇 焘, 林文媛, 王喆之**
(陕西师范大学药用资源与天然药物化学教育部重点实验室 西北濒危药材资源开发
国家工程实验室, 陕西 西安摇 710062)
摘要: 探讨菘蓝花药处于单核晚期的形态指标, 并以适宜发育时期的花药为外植体, 进行花药培养及单倍
体诱导。 实验结果表明, 4益低温处理 2 d 后, 在含有 6鄄BA 0. 5 mg·L-1和 NAA 1. 0 mg·L-1的 MS 培养基
上, 花药愈伤组织的诱导率为 23. 35% ; 将其转接到 MS 附加 6鄄BA 1. 0 mg·L-1, NAA 0. 5 mg·L-1的分化
培养基上, 80. 00%以上的愈伤组织可以诱导产生不定芽; 再将分化出的试管苗转接到 1 / 2MS+NAA
1. 0 mg·L-1的生根培养基上, 3 d左右即可获得完整植株。 经叶边缘压片检查染色体数目, 花药培养所得
的弱小绿苗为单倍体植株。
关键词: 菘蓝; 花药培养; 单倍体
中图分类号: Q 943. 1摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2011)02-225-04
Anther Culture and Haploid Induction from
Isatis indigotica (Cruciferae)
LI Tao, LIN Wen鄄Yuan, WANG Zhe鄄Zhi**
(Key Laboratory of Ministry of Education for Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry,
National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Chinese Crude Drugs in
Northwest of China, Shaanxi Normal University, Xi忆an 710062, China)
Abstract: Anther culture and haploid induction were carried out from Isatis indigotica. The experimental results
showed that cold pretreatment could increase the induction rate of callus. The induction rate of callus was 23. 35%
after 2 days of cold pretreatment. Then the calluses were successively transferred to differentiation medium (MS+BA
0. 5 mg·L-1+ NAA 1. 0 mg·L-1) and rooting medium (1 / 2MS+NAA 1. 0 mg·L-1). The complete plants were ob鄄
tained 3 days later. Among which, those weak and green plantlets were haploids with 7 chromosomes.
Key words: Isatis indigotica; Anther culture; Haploid
摇 摇 菘蓝 ( Isatis indigotica Fort. ) 为十字花科
(Cruciferae) 菘蓝属 ( Isatis) 二年生草本植物,
其根 (板蓝根) 和叶 (大青叶) 均可入药, 是
2010 版 《中国药典 (一部)》 收录的常用中药
品种, 原产我国, 全国各地均有栽培。 菘蓝具有
清热解毒、 凉血消斑、 利咽止痛之功效, 含有靛
蓝、 靛玉红、 有机酸、 多糖等多种有效成分, 广
泛用于治疗流感、 腮腺炎、 乙脑、 肝炎等多种疾
病, 其多糖组分具有一定的免疫调节和降血脂作
用, 而靛玉红对治疗慢性粒细胞白血病有较好的
作用 (刘海利, 2002)。
单倍体育种过程中, 植株经染色体加倍后,
在一个世代中即可出现纯合二倍体, 其性状不分
离, 表型整齐一致, 育种年限显著缩短。 由于没
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2011, 33 (2): 225 ~ 228
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 3724 / SP. J. 1143. 2011. 10155
*
**
基金项目: 陕西省科技攻关计划 (2009K19鄄07)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: zzwang@ snnu. edu. cn
收稿日期: 2010-09-14, 2010-12-20 接受发表
作者简介: 李焘 (1976-) 女, 博士生, 讲师, 主要从事药用植物资源开发应用研究。 E鄄mail: litao@ snnu. edu. cn
有显性基因的掩盖, 隐性基因控制的性状容易显
现, 这对诱变育种和遗传突变研究具有较大的优
势。 我国应用单倍体育种技术先后育成了烟草、
水稻、 小麦等多个优良品种。 目前, 关于菘蓝组
织培养及植株再生体系建立的文献较多 (涂玉
琴等, 2009; 张菊红等, 2006; 张胜珍等, 2009;
汪洪等, 2008), 但有关菘蓝花药培养及单倍体诱
导的研究尚未见报道。 本实验以菘蓝花药为试材,
研究花药培养及植株再生的适宜条件, 以期为菘
蓝单倍体育种提供一定的研究基础。
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料
2009 年 4-5 月间, 随机抽取种植于本校试验田二年
生的菘蓝花药为实验材料。
1. 2摇 方法
1. 2. 1摇 小孢子发育时期的检测摇 取材当日 7: 00-10: 00
摘取生长健壮、 无病虫害、 直径不同、 闭合的菘蓝花
蕾, 同时观察记录花蕾特征和花药颜色; 将花药置于卡
诺固定液中处理 24 h后, 用改良苯酚试剂染色, 压片镜
检花粉小孢子的发育时期。
1. 2. 2摇 花药的预处理与培养摇 将花蕾置于 4益冰箱, 分
别进行 0、 2、 4、 8 和 12 d 的预处理。 接种前, 将花蕾
用流水冲洗 1 ~ 2 h, 常规消毒后用滤纸吸干表面水分,
小心剥取花药, 并接种于不同的培养基中进行培养。 观
察并记录愈伤组织诱导、 不定芽分化与增殖、 植株再生
等情况。
1. 2. 3摇 培养条件摇 培养用基本培养基为 MS, 附加琼脂
6. 5 g·L-1, 蔗糖 30 g·L-1, 灭菌后 pH 值为 5. 8 左右。
培养室温度为 (25 依 2)益, 光照强度为 2 000 ~ 3 000
滋mol·m-2·s-1, 每天光照 12 ~ 14 h。
1. 2. 4摇 再生植株的倍性鉴定 摇 将试管苗叶片于流水中
冲洗 10 min, 再用蒸馏水冲洗 3 次; 切取叶边缘组织,
并用 0. 002 mol·L-1 8鄄羟基喹啉预处理 2 h, 于卡诺固定
液中固定 24 h; 转入 1 mol·L-1 HCl中解离 10 min, 改良
苯酚品红试剂染色 20 min, 压片、 镜检染色体数目并拍
照 (段英姿等, 2006)。 同法取正常二倍体菘蓝试管苗
为对照, 进行染色体制片并计数、 拍照。
2摇 结果与分析
2. 1摇 小孢子发育时期的鉴定
镜检结果表明, 花蕾直径小于 0. 15 cm时, 小
孢子发育不成熟或处于单核早期, 培养过程中, 细
胞分裂能力差, 花药存活力低; 直径大于 0. 25 cm
时, 花蕾逐渐展开, 花冠黄色, 小孢子已发育至
双核至三核期, 不宜作为花药培养的外植体; 而
直径在 0. 15 ~ 0. 25 cm之间的闭合花蕾, 花冠呈
淡绿色至淡黄色, 50%以上的小孢子处于单核中
期至后期 (靠边期)。 因此, 菘蓝花药培养时,
宜在取材当日选取健康、 无病虫害, 花冠颜色为
淡绿至淡黄色, 直径 0. 15 ~ 0. 25 cm、 闭合花蕾
中的花药作为单倍体诱导的适宜外植体。
2. 2摇 花药愈伤组织的诱导
2. 2. 1摇 不同激素组合对花药愈伤组织诱导的影
响摇 接种一周左右, 部分花药开始膨大、 纵裂并
伴有愈伤组织的形成。 随着培养时间的延长, 整
个花药完全脱分化成黄绿色、 疏松的愈伤组织
(图 1: a), 并最终转为绿色、 结构致密的愈伤
组织 (图 1: b), 不同激素组合对愈伤组织诱导
的影响作用如表 1 所示。
表 1摇 不同激素组合对花药愈伤组织诱导的影响*
Table 1摇 Effects of different hormone combinations on the
induction rate of callus for I. indigotica
BA
(mg·
L-1)
NAA
(mg·
L-1)
2,4鄄D
(mg·
L-1)
初愈
时间
Time of
callus
formation
(d)
接种
花药
数
No. of
anther
形成愈
伤组织
块数
No. of
callus
formation
愈伤组织
诱导率
Induction
rate of
callus
(%)
0. 5 1. 0 0 6 226 46 20. 35
0. 5 1. 0 1. 0 10 42 5 11. 90
0. 5 1. 0 2. 0 10 44 6 13. 64
0. 5 2. 0 1. 0 10 45 6 13. 33
0. 5 2. 0 2. 0 10 47 7 14. 89
0. 5 3. 0 1. 0 11 44 5 11. 36
0. 5 3. 0 2. 0 12 44 5 11. 36
1. 0 1. 0 1. 0 10 44 6 13. 64
1. 0 1. 0 2. 0 11 42 5 11. 90
1. 0 2. 0 1. 0 11 44 5 11. 36
1. 0 2. 0 2. 0 12 43 4 9. 30
1. 0 3. 0 1. 0 11 44 6 13. 64
1. 0 3. 0 2. 0 12 40 6 15. 00
*接种 30 d后的统计结果。
* Results of inoculation for 30 days
从表 1 可以看出, 花药在 MS附加 6鄄BA 0. 5
mg·L-1和 NAA 1. 0 mg·L-1的培养基中, 经过 6 d
的培养即可诱导愈伤组织形成, 诱导率为
20. 35% ; 而添加了 2,4鄄D 的培养基组合中愈伤
622摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 33 卷
组织的诱导率分别在 9. 30%到 15. 00%之间不
等。 同时, 添加 2,4鄄D后愈伤组织的形成时间明
显推迟至 10 d 以上, 推测 2,4鄄D 对菘蓝花药愈
伤组织的形成具有一定的抑制作用。 因此, 适宜
菘蓝花药愈伤组织诱导的培养基为 MS 附加 6鄄
BA 0. 5 mg·L-1和 NAA 1. 0 mg·L-1。
2. 2. 2摇 不同低温预处理对花药愈伤组织诱导的
影响摇 与对照组相比, 适当的低温预处理能够在
一定程度上提高愈伤组织诱导率, 同时缩短愈伤
组织的形成时间。 如 2 d (23. 35% ) 和 4 d
(18. 57% ) 的低温预处理均较对照 (15. 26% )
明显地提高了愈伤组织诱导率。 在相同的培养基
中, 与 2. 2. 1 项的结果 (20. 35% ) 相比, 2 d
的低温预处理 (23. 35% ) 可以进一步提高愈伤
组织诱导率; 而较长的低温预处理时间会在一定
程度上降低愈伤组织诱导率, 并延长其形成时
间。 因此, 适宜菘蓝愈伤组织诱导的低温预处理
时间为 2 d。 观察结果表明, 花药培养一段时间
后, 药隔处首先开裂, 进而形成淡黄色的愈伤组
织 (图 1: a)。 培养初期愈伤组织生长缓慢, 随
后逐渐加快, 7 d左右愈伤组织块直径可达 1. 5 cm
以上, 颜色由淡黄转为淡绿, 质地由疏松转为致
密 (图 1: b)。
2.3摇 花药愈伤组织的增殖、 分化及完整植株的获得
表 2摇 低温预处理时间对花药愈伤组织诱导的影响*
Table 2摇 Effects of low temperature pretreatment on the
induction rate of callus for I. indigotica
处理时间
Treatment
time (d)
初愈时间
Time of callus
formation (d)
愈伤组织诱导率
Induction rate
of callus (% )
0 7 15. 26
2 6 23. 35
4 10 18. 57
8 13 14. 61
12 20 10. 35
*接种 30 d后的统计结果。 * Results of inoculation for 30 days
将花药愈伤组织接种到 MS附加 6 鄄 BA
1. 0 mg·L-1和 NAA 2. 0 mg·L-1的培养基中, 经过
25 d左右的培养, 愈伤组织旺盛生长并明显增殖。
2 ~3 次继代培养后, 将其转入 MS 附加 6鄄BA
1. 0 mg·L-1, NAA 0. 5 mg·L-1的培养基中, 6 d左
右可以见到绿色芽点的形成, 芽点经进一步生长
形成不定芽 (图 1: b), 且形成率达到 80. 00%以
上。 每块愈伤组织上形成不定芽的个数不等,
25 d时统计不定芽的平均增殖倍数约为 8 (图 1:
c)。 待不定芽长至 2 ~ 3 cm 高时将其切下, 转入
1 / 2MS附加 NAA 1. 0 mg·L-1的培养基中, 3 d 左
右即可生根 (图 1: d), 生根率为 100%。 待根长
至 4 ~5 cm长时 (图 1: e), 可以进行移栽。
图 1摇 菘蓝花药培养及单倍体诱导
a. 黄绿色疏松愈伤组织; b. 绿色致密愈伤组织, 并有不定芽形成; c. 不定芽丛; d. 试管苗;
e. 试管苗基部诱导产生的根; f. 单倍体染色体 (n=7); g. 二倍体染色体 (2n=14)
Fig 1摇 Anther culture and haploid induction for I. indigotica
a. Yellow鄄green loose callus; b. Green dense callus and shoot in vitro; c. Shoots; d. Tube seedlings;
e. Root; f. Haploid with 7 chromosomes; g. Diploid with 14 chromosomes
7222 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 李焘等: 菘蓝花药培养及单倍体的诱导摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
2. 4摇 再生植株的倍性鉴定
从再生植株的形态和生长情况来看, 经花药
培养获得的单倍体植株较为弱小, 且生长较慢;
而二倍体植株形态正常, 生长旺盛, 在培养基中
呈现优势生长。 分别取对照和经花药培养所得植
株的叶边缘进行染色体制片并计数, 对其进行染
色体倍性鉴定。 从图 1: f, g 可以看出, 经花药
培养所得植株的染色体 (n = 7) 明显减少, 为
正常二倍体植株 (2n=14) 的一半; 而同一植株
中部分细胞的染色体数目还存在 9 条、 10 条、
13 条等情况, 说明在愈伤组织诱导过程中产生
了一定数量的非整倍体。 因此, 对于菘蓝单倍体
植株的选育仍有待进一步研究。
3摇 讨论
低温处理可以有效地改变小孢子的配子体发
育途径, 启动孢子体发育途径, 显著提高小孢子
愈伤组织或胚状体的发生频率; 在一定程度上延
缓小孢子退化, 提早雄核发育, 增加参与雄核发
育的小孢子的比率 (Li 等, 2008)。 不同植物花
药低温预处理的时间不同, 温度条件也存在差
异。 菘蓝花药培养的过程中, 适宜的低温预处理
能够提高愈伤组织诱导率, 并缩短愈伤组织形成
时间; 但随着预处理时间的延长, 诱导率会随之
下降。 在本研究中, 低温预处理 2 d 可以提高菘
蓝花药愈伤组织诱导率。
研究结果表明, 菘蓝花药愈伤组织诱导的适宜
条件为MS附加6鄄BA 0.5 mg·L-1和NAA 1.0 mg·L-1,
其诱导率为 23. 35% 。 与正常二倍体菘蓝叶片和
叶柄的愈伤组织诱导结果 (叶片和叶柄的愈伤
组织诱导率分别为 97. 50%和 80. 00% , 苗永美
等, 2008) 相比, 花药愈伤组织诱导率偏低。 这
可能与花药较高的分化水平、 不同材料基因型的差
异、 以及培养条件等都有一定的关系。 大多数禾本
科植物, 如水稻 (李大林, 2000)、 小麦 (裴翠娟
等, 1992)、 大麦 (魏凌基等, 1995) 等的花药
培养中, 2,4鄄D是启动小孢子细胞形成愈伤组织
的必要条件。 而菘蓝花药培养过程中 2,4鄄D对愈
伤组织的诱导表现出一定的抑制效应, 这与大多
数植物花药培养的研究结果不同, 这种抑制效应
的机制如何, 尚有待于从物质代谢、 激素水平和
酶活性等方面进行较为深入地探讨。
迄今为止, 未见有菘蓝花药培养及单倍体诱
导的研究报道, 本文从菘蓝花药低温预处理、 激
素组合等方面进行了研究, 希望能为菘蓝的花药
培养、 单倍体诱导及育种等提供一定的研究依据。
也参摇 考摇 文摇 献页
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