全 文 ：初探低拷贝核基因在低等分类阶元系统发育
重建中的适用性———以十字花科为例*
丁摇 铭, 曾丽萍, 马摇 红, 张摇 宁**
(复旦大学生命科学院, 植物科学研究所, 进化生物学中心, 上海摇 200433)
摘要: 分子系统学已被广泛用于解决物种之间的亲缘关系。 迄今为止, 被子植物分子系统学大都采用叶绿
体和线粒体基因。 但叶绿体和线粒体多数采用单亲遗传方式, 不能完全记录物种的进化历史。 而且叶绿体
和线粒体基因相对保守, 可用于系统发育重建的信息有限, 很难用来解决科以下类群之间的亲缘关系。 相
反, 核基因遵守双亲遗传方式并能提供大量信息位点, 但却没有得到广泛运用。 本文以十字花科为例, 从
17种十字花科植物中得到了 5 个编码蛋白的单拷贝核基因序列, 采用最大简约法、 最大似然法和贝叶斯
法重建它们之间的亲缘关系。 结果表明, 和目前常用的基因相比, 这些基因能提供更多的信息位点, 由此
得到的系统发育树具有很高的支持, 利用最大简约法得到的 5 个核基因的系统树中各分支均得到了 100%
的自展支持率。 结果表明, 我们选取的核基因可以用来进行科、 属及种间的系统发育重建。 因此, 这 5 个
基因可以用来解决被子植物其它科内的亲缘关系, 而且也可以作为 DNA条形码研究的有效分子标记。
关键字: 分子系统学; 十字花科; 低拷贝核基因; MCM5; MLH1; AT3G54630; AT3G26730; AT2G47990
中图分类号: Q 949, Q 78摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2012)03-211-11
The Use of Low鄄copy Nuclear Genes for Reconstructing the
Phylogeny of Low鄄level Taxonomic Hierarchies:
Evidence from Brassicaceae
DING Ming, ZENG Li鄄Ping, MA Hong, ZHANG Ning**
( Institute of Plant Biology, Center for Evolutionary Biology, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China)
Abstract: Molecular systematics is widely used to determine organismal relationships. However, until now, system鄄
atics of angiosperms has mostly employed organellar genes, but these genes are generally inherited uniparentally, only
partially reflecting the evolutionary history. In addition, chloroplast and mitochondrial genes are highly conserved, with
limited numbers of phylogenetically informative characters. In contrast, nuclear genes are inherited biparentally and have
relatively large numbers of informative sites, but only few nuclear genes have been utilized. In this work, sequences of
five low鄄copy nuclear genes were obtained in 17 species from Brassicaceae and used for phylogenetic analyses with the
Maximum鄄Parsimony, Maximum鄄Likelihood and Bayesian methods. Highly similar topologies were obtained using the five
genes; in addition, compared with organellar genes, the nuclear genes had more phylogenetically informative sites and
provided stronger supports. Specifically, the supporting values of all the nodes were 100% in MP trees using the five
nuclear genes. Therefore, these five genes are excellent candidate marker genes for plant taxonomists who aim to
resolve the relationships among low鄄level taxonomic hierarchies and might also be useful for DNA barcoding.
Key words: Molecular systematics; Brassicaceae; Low鄄copy nuclear genes;MCM5;MLH1; AT3G54630; AT3G26730; AT2G47990
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2012, 34 (3): 211 ~ 221
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 3724 / SP. J. 1143. 2012. 12041
*
**
基金项目: 国家自然科学基金委资助项目 (31100156); 中国博士后基金资助项目 (20100480549, 201003241)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: peaceful_ning@ hotmail. com, zhang_ning@ fudan. edu. cn
收稿日期: 2012-03-26, 2012-05-04 接受发表
作者简介: 丁摇 铭 (1985-) 男, 硕士研究生, 主要从事十字花科系统发育研究工作。 E鄄mail: 09210700153@ fudan. edu. cn
摇 物种间的系统发育关系是多种生物学研究
的基础, 它被广泛运用于进化生物学、 生物地理
学、 发育生物学、 比较基因组学以及农作物育种
中 (Judd等, 1999)。 随着上世纪 80 年代测序技
术的迅速发展, 分子系统学 (molecular systemat鄄
ics) 应运而生, 为系统发育生物学提供了更加
有力的工具 (Soltis等, 2005)。 现阶段, 植物分
子系统学应用的基因主要来自于叶绿体和线
粒体, 推动了分子系统学的发展 ( Jansen 等,
2007; Qiu等, 2010)。 但叶绿体和线粒体主要采
取单亲遗传方式, 不能完整记录物种的进化历史
(Ness等, 2011)。 另外, 细胞器基因在进化过
程中相对保守, 物种之间的序列差异很小, 不能
提供足以解决物种间亲缘关系的信息位点 (Lu
等, 2010)。 虽然经过 20 多年的研究, 利用细胞
器基因甚至是叶绿体全基因组重建的系统发育树
仍无法全面解决物种间的系统发育关系 (Jansen
等, 2007; Moore等, 2007, 2010)。
随着研究的不断深入, 利用低拷贝核基因作
为分子系统学的基因标记显得更加高效。 这主要
在于核基因属于双亲遗传, 可以更好地反映物种
的进化历史; 而且, 与细胞器基因相比, 多数核
基因可以提供更多的信息位点; 另外, 利用广泛
保守的核基因便于将动物、 植物及真菌等真核生
物整合在一起, 形成完整的生命之树。 目前, 核
基因已经被广泛用于真菌和动物的系统发育重建
并获得了更加详实的结论。 例如 James等 (2006)
利用 6 个编码蛋白的基因序列重建了约 200 种真
菌之间的亲缘关系, 结果表明, 基于核基因得到
的物种树可以得到更高的自展支持率。 Regier 等
(2010) 分析了 75 种节肢动物的 62 个单拷贝核
基因, 将甲壳纲动物分为三个大的类群, 结果表
明核基因为节肢动物的分类提供了新的依据。 另
外, Moreau等 (2006) 研究了蚂蚁中 139 个属
的 6 个核基因编码区, 分子钟 (molecular clock)
的分析结果表明, 食草性昆虫的起源时间在白垩
纪 (cretaceous) 到始新世 ( eocene) 早期之间,
从而推断蚂蚁类群的爆发和早期被子植物的起源
有密切联系。
作为分子系统学研究工具的核基因必须为低
拷贝基因, 只有这样的基因才能减少旁系同源基
因 (paralog) 的影响 (Duarte等, 2010)。 但是,
对于绝大多数被子植物而言, 它们在进化过程中
曾发生过多次全基因组复制事件 (whole鄄genome
duplication, WGD) (Soltis等, 2009; Jiao等, 2011),
使得植物的核基因组中出现了大量的重复基因,
也加大了筛选低拷贝基因的难度。 在实验方面,
编码蛋白的核基因往往具有复杂的基因结构, 这
都对基因片段的扩增和测序提出了挑战。 因此,
筛选出一批能高效进行植物分子系统学研究的核
基因就显得非常必要。
十字花科 (Brassicaceae) 在自然界中是一个
庞大的自然类群, 全科分为 338 个属, 共有 3 700
多个种 (Warwick 等, 2006), 并具有极高的经
济和研究价值。 拟南芥 ( Arabidopsis thaliana)
和油菜 (Brassica rapa), 作为植物学研究的模
式物种, 是本科的代表物种。 虽然经过数十年的
发展, 十字花科的系统关系却并没有得到彻底
解决。 十字花科物种进化速率较快, 利用传统
分类学方法鉴定的十字花科的族多为多系 (pol鄄
yphyletic group) 或者并系 ( paraphyletic group)
(Franzke等, 2009)。 目前的研究结果中能够得
到共识的有, 醉碟花科植物 (Cleomaceae) 是整
个十字花科的姐妹群, 岩芥 (Aethionema) 是核
心十字花科植物的姐妹群, 核心十字花科分为 3
个大分支 (Bailey 等, 2006)。 在十字花科的进
化历史过程中曾经发生过 3 次全基因组复制事
件, 分别为 At鄄琢、 At鄄茁 和 At鄄酌, 其中 At鄄琢 和
At鄄茁都发生在在十字花科起源之前, 而 At鄄酌 则
更早 (Soltis 等, 2009)。 Bailey 等 (2006) 利用
核糖体基因转录间隔区 ( Internal Transcribed
Spacers, ITS) 分析了 146 个属, 共计 461 个种,
并将整个十字花科分为 25 个族。 除了 Camelineae
以外, 其余的族都属于单系类群 (monophyletic
group), 但进化树主干上 (backbone) 的自展支
持率却并不理想, 这说明利用 ITS 序列未能解决
十字花科各大类群之间的亲缘关系。 Couvreur 等
(2010) 在结合前人的研究基础上, 利用 8个基因
即 nad4 intron 1、 ndhF、 phyA、 adh、 chs、 ITS、
matK、 trnLF分析了 307个属的物种, 继续细化了
十字花科的分类, 将其划分为至少 33 个族, 但是
分支内部的自展支持率仍然较低。 综上所述, 利
用以上基因还无法彻底解决十字花科内部尤其是
各个族之间的亲缘关系。
212摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
本研究中, 我们选取了 5 个进化速率较快的
核基因: MCM5 ( Mini鄄Chromosome Maintenance
complex), MLH1 (mutL Homolog; Mismatch Repair,
MMR), AT3G54630, AT3G26730 和 AT2G47990。
其中, MCM5 在所有真核生物中都存在, 它与
MCM2鄄4, 6, 7 编码的蛋白亚基组成 DNA 解旋
酶, 在 DNA复制过程中发挥关键作用 (Maiora鄄
no等, 2006); MLH1 在 DNA 修复过程中起到重
要功能 ( Iyer 等, 2006); AT3G54630, AT3G26730
和 AT2G47990是我们筛选出的进化速率较快的低
拷贝核基因, 功能未知。 我们的研究结果表明,
这些基因在基因组已测序的被子植物中大都只保
留一个拷贝 (未发表数据)。 而且, AT3G54630
和 AT2G47990 基因中没有内含子。 在本实验中,
我们利用这 5 个基因来探究十字花科 17 个代表
物种间的亲缘关系, 从而验证它们在重建低等分
类阶元亲缘关系中的适用性。
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料
本研究依据 《中国植物志》 第 33 卷的十字花科系
统 (周太炎等, 1987) 进行采样, 共采集了 13 个物种作
为研究对象, 另外还从公共数据库中下载了拟南芥、 琴
叶拟南芥 (A. lyrata)、 白菜、 盐芥 (Thellungiella salsug鄄
inea) 和番木瓜 (Carica papaya) 的基因序列, 数据库
网址见表 1。 采集的植物样品放入-80 益超低温冰箱中
保存, 样品名称、 凭证标本及采集地点详情见表 2。
表 1摇 基因数据来源
Table 1摇 The websites of genetic data
物种 Species 网址 Website
拟南芥 Arabidopsis thaliana www. arabidopsis. org
琴叶拟南芥 A. lyrata www. phytozome. net
白菜 Brassica rapa www. brassica. info
盐芥 Thellungiella salsuginea thellungiella. org
番木瓜 Carica papaya www. phytozome. net
1. 2摇 RNA提取及 cDNA反转录
采用改进的 CTAB 法提取物种的总 RNA, 将 2 g 植
物嫩叶材料在液氮中研磨成粉, 并加入到 4 mL CTAB
中 (65 益预热), 另外加入 40 滋L 的 茁-巯基乙醇防止
RNA降解, 后置于 65 益水浴锅 10 min。 在溶液中加入
1 / 4 体积的氯仿 颐 异戊醇 (24 颐 1) 的萃取液, 4 益和转
速 12 000 r / min的条件下离心 10 min, 取上清并重复一次
萃取步骤。 将上清液移入新管子, 加入 1 / 4 体积的 10
mol·L-1氯化锂, 置于-20 益冰箱中 6 ~ 8 h沉淀总 RNA,
离心收集沉淀, 用 70%的乙醇清洗两次, 在通风橱内自
然风干, 溶于适量的双蒸水中, 置于-80 益保存。 cDNA
合成使用 TaKaRa 公司生产的逆转录试剂盒 (货号:
D6210A), 20 滋M 反应体系中保证 RNA 的量约为 0. 5
滋g, 反应条件为 42 益 1 h, 70 益 15 min, 最后将 cDNA
置于-20 益冰箱中保存。
1. 3摇 PCR扩增及测序
利用拟南芥、 琴叶拟南芥、 白菜和盐芥的直系同源
基因序列设计引物, MCM5 和 MLH1 的正反向引物上分
别连接通用引物 T3 和 T7, 引物长度为 40 ~ 45 bp;
AT3G54630、 AT3G26730 和 AT3G47990 的引物则无需连
接通用引物, 长度为 20 ~ 25 bp, 具体序列见表 3。 PCR
表 2摇 样品名称、 凭证标本及采集地点
Table 2摇 Taxa, location and voucher included in this study
物种 Species 族 Tribes (周太炎系统) 采集地 Location 凭证标本 Voucher
播娘蒿 Descurainia sophia 大蒜芥族 Sisymbrieae 山东师范大学校园 M. Ding 1123
臭荠 Coronopus didymus 独行菜族 Lepidieae 上海植物园 M. Ding 1111
独行菜 Lepidium apetalum 独行菜族 Lepidieae 山东师范大学校园 M. Ding1122
诸葛菜 Orychophragmus violaceus 芸薹族 Brassiceae 上海植物园 M. Ding 1109
桂竹香 Cheiranthus cheiri 香花芥族 Hesperideae 复旦大学 M. Ding 1127
蔊菜 Rorippa indica 南芥族 Arabideae 上海植物园 M. Ding 1108
芥菜 Brassica juncea 芸薹族 Brassiceae 上海植物园 M. Ding 1106
荠菜 Capsella bursa鄄pastoris 独行菜族 Lepidieae 上海植物园 M. Ding 1107
碎米荠 Cardamine hirsuta 南芥族 Arabideae 上海植物园 M. Ding 1113
香雪球 Lobularia maritima 庭芥族 Alysseae 复旦大学江湾校区 M. Ding 1128
小花糖芥 Erysimum cheiranthoides 香花芥族 Hesperideae 山东师范大学校园 M. Ding 1124
萝卜 Raphanus sativus 芸薹族 Brassiceae 菜市场 M. Ding 1003
紫罗兰 Matthiola incana 紫罗兰族 Matthioleae 复旦大学 M. Ding 1133
3123 期摇 摇 摇 丁摇 铭等: 初探低拷贝核基因在低等分类阶元系统发育重建中的适用性———以十字花科为例摇 摇 摇 摇 摇
表 3摇 基因名、 引物名及序列
Table 3摇 Sequence of primers used in this study
基因 Genes 引物 Primers 序列 Sequences
T3鄄F1MCM5 ATTAACCCTCACTAAAGGGAATHGAYGARTTTGAYAARATG
MCM5 T3鄄F2MCM5 ATTAACCCTCACTAAAGGGA ATTCAYGARGCNATGGARCA
T7鄄R1MCM5 TAATACGACTCACTATAGGG ATDGAWTCRTTCATBCCCAT
T3鄄F1MLH1 ATTAACCCTCACTAAAGGGA GGRAATYTRTTYTAYAAYATG
MLH1
T3鄄F2MLH1 ATTAACCCTCACTAAAGGGATCNTGYMGAAAGCATGGAGC
T7鄄R1MLH1 TAATACGACTCACTATAGGGTCCATRTCAGGIGTRTAYTGRTC
T7鄄R1MLH1 TAATACGACTCACTATAGGG ACRTGYTGDATIGWCCAYTC
F1 GTCAARGASATCTCCGAAACCCTA
AT3G54630
F2 TAACTCCATGWMTTYCTTCG
R1 TTCTCCTCCACAACYTTCTCCA
R2 CTGAASCTCCACRCTCTTCTT
AT2G47990
F1 CCACCGTCTCCCTCTTCTCCTC
R1 CTCAACGCCCTTCTCCTACTCTC
AT3G26730
F1 TAGCCATGGATCTTCCAAAGAG
R1 CTGACAGAGAGATCAACATCTTG
反应使用 TaKaRa公司生产的 Ex Taq (货号: DRR006C)
进行扩增。 MLH1 和 MCM5 使用两轮 PCR 进行扩增, 在
第一轮 PCR 中, MLH1 选用 T3鄄F1MLH1 / T7鄄R1MLH1引物组
合, MCM5 选用 T3鄄F1MCM5 / T7鄄R1MCM5引物组合, 目的在
于扩增出少量目的片段, 在第二轮中, MLH1 选用 T3鄄
F2MLH1 / T7鄄R2MLH1引物组合, MCM5 选用 T3鄄F2MCM5 / T7鄄
R1MCM5引物组合, 进一步富集目的片段。 AT3G54630、
AT3G26730 和 AT2G47990 的目的片段采用一次 PCR扩增
得到, 其中 AT3G26730 和 AT2G47990 中只扩增一个基因
片段; 而 AT3G54630 扩增得到两个基因片段, 引物组合
分别为: F1 / R1 和 F2 / R2。 反应程序为: 94 益热启动 3
min; 然后进行 25 个循环, 条件为 94 益变性 30 s, 55 益
退火 30 s (每个循环温度降 0. 4 益), 72 益延伸 1 min
(每个循环延伸时间增加 2 s); 随后进行 10 个循环, 条
件为 94 益变性 30 s, 45 益退火 30 s, 72 益延伸 2 min
(每个循环延伸时间增加 3 s)。 反应体系采用 60 滋L反应
体系。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测片段长度后, 送
上海赛英生物技术公司测序。
1. 4摇 克隆实验
由于一些物种样本来自多棵植物, 可能带有多个等
位基因, PCR扩增产物不单一, 直接测序结果表明为非
单一序列。 将这些 PCR 基因片段用来自 Axygen 公司
(货号: L00359463) 的胶回收试剂盒割胶回收。 将纯化
后的 DNA片段连入 TaKaRa公司的连接试剂盒中的 18鄄T
simple Vector 载体 (货号: D103A), 16 益反应 1 h 后,
将连接产物加入感受态细胞 DH5琢。 扩大培养后倒入具
有氨苄 (AMP+) 抗性的固体培养基, 放入 37 益培养箱
中倒置过夜培养。 次日, 挑取单菌落进行菌落 PCR 检
验, 并在具有氨苄抗性的液体培养基中扩大培养, 选取
电泳检测结果中具有正确条带的克隆进行测序, 每个样
品至少选取三个克隆进行测序。 同一物种不同克隆之间
的碱基差异低于 1% , 远少于不同物种之间的差异, 而
且同种的不同序列在单基因树中聚在一起 (未发表结
果), 所以我们将相同物种不同克隆间的差异位点处理
为兼并性位点 (degenerate sites)。
1. 5摇 外类群选择
本实验选取与十字花科亲缘关系较近的物种番木瓜
作为外类群, 番木瓜与十字花科均属于十字花目 (Bras鄄
sicales), 由于番木瓜已经完成基因组测序, 基因序列可
以直接从 Phytozome下载 (表 1)。
1. 6摇 分子系统学常用分子标记序列下载
为了验证本实验中选取的 5 个核基因的高效性, 我
们还从 GenBank中下载了 17 个物种 (包括番木瓜) 的 3
个常用分子标记的基因序列: matK (Maturase K), ITS
(Internal transcribed spacer) 和 rbcL (large subunit of ribu鄄
lose鄄bisphosphate carboxylase)。 其中, matK 和 rbcL 来源
于植物叶绿体基因组, ITS是 rDNA基因的间隔序列, 本
次研究中涉及到的 ITS 包括 ITS1、 ITS2 和 5. 8SrRNA 三
部分。 以上 3 个基因已经广泛用于十字花科系统关系研
究中, 各物种的基因序列号见表 4。
1. 7摇 数据分析
应用 MEGA 5. 0 分别对 5 个核基因的 DNA片段的序
列进行序列比对, 删除无法对齐的序列, 并确定研究的
序列是基因的开放读码框 (Tamura等, 2011)。 对 5 个
412摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
表 4摇 物种名、 基因名以及 GenBank序列号
Table 4摇 Accession numbers of three widely used phylogenetic markers
物种 Species matK ITS rbcL 物种 Species matK ITS rbcL
播娘蒿
Descurainia sophia GQ424581. 1 HQ896614. 1 JN892038. 1
小花糖芥
Erysimum cheiranthoides HQ593289. 1 DQ005989. 1 HQ590092. 1
臭荠
Coronopus didymus ——— AY254533. 1 ———
萝卜
Raphanus sativus AB354262. 1 GQ268079. 1 GQ184382. 1
独行菜
Lepidium apetalum JF954300. 1 JF976769. 1 HM850119. 1
紫罗兰
Matthiola incana AF144361. 1 DQ249848. 1 HM850161. 1
桂竹香
Cheiranthus cheiri ——— ——— ———
拟南芥
Arabidopsis thaliana AF144378. 1 AT3G41979. 1 FN594842. 1
蔊菜
Rorippa indica AF174530. 1 AF128108. 1 D88907. 1
琴叶拟南芥
A. lyrata AF144342. 1 GQ303493. 1 HM849785. 1
芥菜
Brassica juncea AB354274. 1 FJ980406. 1 AY167979. 1
白菜
Brassica rapa AB354276. 1 JN564039. 1 AY167976. 1
荠菜
Capsella bursa鄄pastoris AP009371. 1 AF531561. 1 AP009371. 1
诸葛菜
Orychophragmus violaceus EU306557. 1 GQ261952. 1 ———
碎米荠
Cardamine hirsuta HM850748. 1 DQ268385. 1 HM849847. 1
盐芥
Thellungiella salsuginea ——— AF531626. 1 ———
香雪球
Lobularia maritima AP009375. 1 AY254530. 1 AP009375. 1
番木瓜
Carica papaya EU431223. 1 AY461547. 1 EU431223. 1
基因进行联合基因分析,利用 SeaView 将 5 个基因序列拼
接成一个联合矩阵,构建系统发育树。 利用 PhyML 3. 0 进
行最大似然法分析 (maximum likelihood, ML) (Gouy 等,
2010), 在运用 ML 分析时, 先利用 Modeltest 3. 7 选择适
合的分子进化模型, 结果表明最合适的分子进化模型是
GTR + I + 祝 (Posada和 Crandall, 1998)。 利用 PAUP 4b10
进行最大简约性分析 (maximum parsimony, MP), 联合矩
阵中的空位作为缺失处理, 并对所有性状状态做等权无
序处理, 采用启发式搜索 (heuristic search) 1 000 次抽
样, TBR枝长交换, 每步保留 10 棵树, 获取严格一致树
(Swofford, 2002)。 利用 MrBayes 3. 1. 2 进行贝叶斯分析,
分析采用MCMC (Markov Chain Monte Carlo process) 算法
(Ronqueist 和 Huelsenbeck, 2003), 根据 Modeltest 3. 7
的结果设置相关参数, 以随机树作为起始树, 共运行
500 000 代, 每 100 代进行 1 次抽样。 摒弃前 25%的老化
样本 (burn鄄in samples), 用剩余样本构建一致树并计算
各分支的后验概率 ( posterior probability, PP)。 matK,
ITS和 rbcL三个基因也采用相同的方法进行分析。
2摇 结果
2. 1摇 所选核基因易于扩增
在采集的 13个植物样品中均得到了 MCM5 和
MLH1的目的条带, 扩增效率为 100%; AT3G54630
分成前后两段进行扩增, 其中 F1 / R1 引物组合
得到了所有 13 个物种的扩增条带, F2 / R2 引物
组合得到了 11 个样品的扩增条带, 扩增效率为
92. 3% (图 1); 另外, 我们分别得到了 10 个物
种的 AT2G47990 和 12 个物种的 AT3G26730 基因
片段, 扩增效率分别是 76. 9%和 92. 3% 。 没有
得到的基因序列均处理为数据缺失。 5 个基因的
测序结果, 在 TAIR (www. arabidopsis. org) 网站
上进行 BLAST 搜索后表明我们得到的序列均是
相应基因的同源基因。
2. 2摇 核基因可以提供更多的信息位点
通过单基因之间的比较, 我们发现核基因提供
的信息位点数目远远多于 3个常用的分子标记基因
(表 5)。 在 3个已用于研究的基因中, ITS 提供了
158个信息位点, 占到序列总长度的 25. 4%, matK
和 rbcL 提供的信息位点数占到各自序列长度的
6. 5%和 3% , 可以看出, 后两个基因能提供的信
息位点数非常有限。 本次研究所涉及的 5个核基因
中, AT3G54630总长度为1 227个碱基, 其中446个
位点为信息位点, 占到序列总长度的 36. 3%;
AT3G26730总长度为 842 个碱基, 提供了 179 个
信息位点, 占序列总长度的 21. 3%; AT2G47990
总长度为 722 个碱基, 提供了 219 个信息位点,
占序列总长度的 30. 3%; 功能已知的 MCM5 和
MLH1 的信息位点数也分别占到各自序列长度的
19. 7%和 12. 7% , 都明显高于 matK和 rbcL。
5123 期摇 摇 摇 丁摇 铭等: 初探低拷贝核基因在低等分类阶元系统发育重建中的适用性———以十字花科为例摇 摇 摇 摇 摇
图 1摇 十三个十字花科物种 AT3G54630 基因 PCR片段电泳图, 扩增引物为 F2 / R2
1. 荠菜; 2. 萝卜; 3. 臭荠; 4. 芥菜; 5. 蔊菜; 6. 二月兰; 7. 香雪球; 8. 碎米荠; 9. 紫罗兰; 10. 独行菜;
11. 播娘蒿; 12. 桂竹香; 13. 小花糖芥; 14. 空白对照; 15. DL2000
Fig. 1摇 Electrophoresis of PCR products of AT3G54630 that were amplified with F2 / R2 from 13 Brassicaceae species
1. Capsella bursa鄄pastoris; 2. Raphanus sativus; 3. Raphanus sativus; 4. Brassica juncea; 5. Rorippa indica; 6. Orychophragmus violaceus;
7. Lobularia maritima; 8. Cardamine hirsuta; 9. Matthiola incana; 10. Lepidium apetalum; 11. Descurainia sophia;
12. Cheiranthus cheiri; 13. Erysimum cheiranthoides; 14. blank; 15. DL2000
表 5摇 8 个基因的系统学信息
Table 5摇 The systematic information of 8 genes
基因 Gene 序列长度Gene length
变异位点数
Variable characters (VC)
信息位点数
Parsimony鄄informative characters (PIC)
信息位点数百分比
Ratio of PIC / %
AT3G26730 842 309 179 21. 3
AT2G47990 722 354 219 30. 3
AT3G54630 1227 724 446 36. 3
MCM5 704 270 139 19. 7
MLH1 1695 444 213 12. 7
ITS 621 256 158 25. 4
matK 1527 392 100 6. 5
rbcL 1447 192 42 3
摇 摇 5 个核基因序列经比对后联合成一个矩阵,
总长度为 4 585 bp, 其中 2 304 个位点为变异位
点, 系统发育信息位点有 1 233 个, 占整个序列
的 27% 。 应用MEGA 5. 0 计算 5 个核基因的碱基
替换率均在 0. 2 ~ 0. 3 之间。 作为对照组的 3 个
常用分子标记基因, 比对后联合为一个矩阵, 总
长度为 3 624 bp, 其中 901 个位点为变异位点,
系统发育信息位点有 314 个, 只占整个序列的
8. 7% , 这 3 个常用分子标记的碱基替换率均在
0. 15 以下。 从联合基因分析上看, 本文介绍的 5
个核基因提供了更多的信息位点。
2. 3摇 基于核基因得到了支持率更高的物种关系
为了比较不同基因用于系统发育的效果, 我
们重建了多个单基因和联合基因系统发育树。 从
这些系统发育树上看, 利用核基因 AT3G54630
建立的系统发育树不但好于利用 3 个常用分子标
记基因 (matK, rbcL 和 ITS) 建立的单基因树,
而且也好于基于 3 个常用分子标记建立的联合基
因树。 以 AT3G54630 和 matK 的 MP 树为例, 利
用 AT3G54630建立的 MP树中 (图 2), 一致性指
数 (CI) 为 0. 662, 保留性指数 (RI) 为 0. 587,
调整后一致性指数 (RC) 为 0. 389。 紫罗兰位
于十字花科的最基部, 利用三种分析方法得到的
支持率分别为 100% (MP), 78% (ML) 和 1. 0
(Bayesian)。 除去诸葛菜和盐芥, 其余 14 个十
字花科植物分为两个分支, 分别为 Clade I 和
Clade II。 在 Clade I 中, 拟南芥与琴叶拟南芥,
荠菜与香雪球, 小花糖芥与桂竹香, 碎米荠与蔊
菜, 独行菜与臭荠分别组成姐妹群, 均得到了最
高支持, 诸葛菜与 Clade I 组成姐妹群后再与盐
芥组成姐妹群。 在 Clade II 中, 白菜与芥菜组成
姐妹群, 两者形成的分支再与萝卜组成姐妹群,
3 种分析方法均得到了最高的支持率。
利用 matK建立的 MP 树中 (图 3), CI、 RI
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和 RC分别为 0. 873、 0. 703 和 0. 614。 香雪球位
于十字花科的最基部, 但只有 MP法得到了 46%
的自展支持率, 其余两种分析方法并不支持此结
论。 MP分析方法中, 紫罗兰、 Clade I 和 Clade II
三支形成梳子状结构。 在 Clade I 中, 物种之间
形成梳子状结构, 亲缘关系无法解决。 在 Clade
II中, 白菜与芥菜组成姐妹群, 得到了最高的支
持率, 它们再与萝卜组成姐妹群, 得到的支持率
图 2摇 利用 AT3G54630 得到的 17 个物种的系统发育树, 分支上的数字分别表示 MP / ML / Bayesian
分析得到的支持率及后验概率。 星号代表自展支持率和后验概率分别为 100%和 1. 0
Fig. 2摇 MP tree based on AT3G54630 for 17 Brassicaceae species
The numbers on each node are support values of MP, ML and Bayesian analyses, respectively.
Asteriks stand for bootstrap of 100% or Posterior Probability of 1. 0
图 3摇 利用 matK得到的 14 个物种的系统发育树, 分支上的数字分别表示 MP / ML / Bayesian
分析得到的支持率及后验概率。 星号代表自展支持率和后验概率分别为 100%和 1. 0
Fig. 3摇 MP tree based on matK for 14 Brassicaceae species
The numbers on each node are support values of MP, ML and Bayesian analyses, respectively.
Asteriks stand for bootstrap of 100% or Posterior Probability of 1. 0
7123 期摇 摇 摇 丁摇 铭等: 初探低拷贝核基因在低等分类阶元系统发育重建中的适用性———以十字花科为例摇 摇 摇 摇 摇
也是最高, 以上物种再与诸葛菜组成姐妹群, 得
到的支持率为 98% (MP), 100% (ML) 和 1. 0
(Bayesian)。 由此可见, 相对于 AT3G54630, matK
不能提供较好的分辨率。
基于 matK、 rbcL和 ITS 3 个基因的联合矩阵
建立的 MP 树中 (图 4), CI、 RI 和 RC 分别为
0. 730、 0. 510 和 0. 372。 在 Clade I 中, 荠菜、 拟
南芥与琴叶拟南芥形成梳子状结构, 小花糖芥与
以上梳子结构形成姐妹群, 得到的支持率分别为
83% (MP), 54% (ML) 和1. 0 (Bayesian), 碎米
荠与蔊菜组成姐妹群, 得到的支持率为 100%
(MP), 98% (ML) 和 1. 0 (Bayesian), 独行菜、
播娘蒿和以上两大分支组成梳子状结构。 在
Clade II中, 白菜与芥菜组成姐妹群, 两者形成
的分支再与萝卜组成姐妹群, 诸葛菜再与以上物
种形成姐妹群, 支持率与 AT3G54630 的进化树
相比都有所降低。 臭荠和盐芥形成姐妹群, MP
法的支持率和后验概率分别为 100%和 1. 0, 它
们再与 Clade II中的其他物种组成姐妹群。 紫罗
兰与 Clade I和 Clade II组成姐妹群后, 再与香雪
球组成姐妹群, 只有 MP 法得到了 83%的支持
率。 因此在本进化树中, 利用 3 种分析方法得到
的支持率并不高。 可见, 利用核基因 AT3G54630
得到的系统树不但比基于 matK序列和 3个基因建
立的联合基因树得到更高的支持率, 而且物种之
间的关系也和已知关系具有较高的一致性。
利用 5 个核基因建立的联合基因树可以良好
地展示 17 个十字花科物种之间的系统关系 (图
5)。 利用 MP和 Bayesian分析方法重建的联合基
因树, 每个节点的支持率均为 100% 。 整棵树分
为两个大的分支, 在 Clade I 中, 拟南芥和琴叶
拟南芥, 小花糖芥和桂竹香分别组成姐妹群后,
两支之间组成姐妹群, 3 种分析方法均得到了最
高的支持率, 以上物种形成的分支与播娘蒿组成
姐妹群, MP 树的支持率和 Bayesian 树的后验概
率分别为 100%和 1. 0。 碎米荠与蔊菜组成姐妹
群, 两者形成的分支又与荠菜组成姐妹群, 3 种
分析方法均得到了最高的支持; 独行菜与臭荠组
成姐妹群后位于 Clade I 的基部。 在 Clade II 中,
白菜与芥菜组成姐妹群后与萝卜组成姐妹群, 诸
葛菜和盐芥依次与以上 3 个物种组成姐妹群。
MP 树的支持率和 Bayesian 树的后验概率均为
100%和 1. 0, 利用ML法得到的支持率至少 79%。
另外紫罗兰位于整个十字花科植物的基部, 而香
雪球则为除紫罗兰以外的基部分支, 得到的自展
支持率和后验概率均分别为 100%和 1. 0。
图 4摇 利用 3 个分子标记基因 (matK, ITS和 rbcL) 联合矩阵得到的 17 个物种的系统发育树, 分支上的数字分别表示
MP / ML / Bayesian得到的支持率及后验概率。 星号代表自展支持率和后验概率分别为 100%和 1. 0
Fig. 4摇 MP tree based on three concatenated molecular markers (matK, ITS, and rbcL) for 17 Brassicaceae species. The numbers on each
node are support values of MP, ML and Bayesian, respectively. Asteriks stand for bootstrap of 100% and Posterior Probability of 1. 0
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图 5摇 基于 5 个核基因 (MCM5, MLH1, AT3G54630, AT3G26730 和 AT2G47990) 的联合矩阵得到的 17 个物种系统发育树,
分支上的数字分别表示 MP / ML / Bayesian分析得到的支持率及后验概率。 星号代表自展支持率和后验概率分别为 100%和 1. 0
Fig. 5摇 MP tree based on five concatenated nuclear genes (MCM5, MLH1, AT3G54630, AT3G26730, and AT2G4799) for 17
Brassicaceae species. The numbers on each node are support values of MP, ML and Bayesian
3摇 讨论
在被子植物分子系统学的发展过程中, 现有
研究大多利用细胞器基因重建物种间的亲缘关
系。 由于细胞器基因多为单亲遗传, 而且物种间
序列差异较小, 使得被子植物分子系统还存在没
有解决的问题 (Chase 等, 2009), 在一些亲缘
关系较近、 进化速率较快的物种间, 高度保守的
细胞器基因的作用显得比较有限 (Lu 等, 2010)。
另外, 细胞器基因可能出现水平基因转移甚至从
寄生植物中丢失, 使得现有的分子标记不能有效
地被运用到这些植物中, 从而也不能被纳入生命
之树 ( tree of life) ( Keeling 和 Palmer, 2008)。
另一方面, 核基因保留了双亲的遗传信息, 较好
地反映了物种的进化历史。 与细胞器基因相比,
大多数核基因在物种间差异较大, 能提供更多的
系统发育信息位点。 目前少量的核基因已应用到
分子系统学的研究中, 以 ITS 为例, Bailey 等
(2006) 利用 ITS 分析了 146 个属的 461 个种,
新的进化树细化了十字花科物种的系统关系, 将
整个十字花科分为 25 个族, 但进化树主干的自
展支持率仍然很低。 ITS 序列为多拷贝的核糖体
基因编码区之间的间隔序列, 在某些类群中由于
不完全地致同进化导致了拷贝间的差异, 进而影
响了系统发育重建的准确性; 另外, ITS 序列长
度也较短, 提供的信息位点较少, 可见仅仅依靠
ITS并不能解决所有问题, 尤其是低等分类阶层
之间的关系。 适合系统学研究的核基因应该具备
3 个条件: (1) 基因应该具有保守序列, 以便进
行比对 (alignment); (2) 基因的序列长度足够
长, 这样才能提供足够的信息位点; (3) 用于
研究的核基因应为直系同源基因。 在本研究中,
我们利用 5 个低拷贝核基因 MCM5、 MLH1、
AT3G54630、 AT3G26730 和 AT2G47990 的编码区
序列来研究 17 个十字花科植物之间的系统关系,
以便验证这些核基因在系统分类上的适用性。
应用 MEGA 5. 0 计算 5 个核基因的碱基替换
率均在 0. 2 ~ 0. 3 之间, 可见这些编码蛋白的核
基因的进化速率较快, 长达 4 585 bp的矩阵共提
供了 1 233 个信息位点, 占整个序列的 27% 。 而
3 个常用的分子标记的碱基替换率均在 0. 15 以
下, 变异速率较慢, 在 3 624 bp的序列中提供了
314 个信息位点, 只占整个序列的 8. 7% 。 另外,
AT3G54630 和 AT2G47990 基因中没有内含子序
列, 扩增时可以直接用 DNA 进行扩增。 因此,
在物种采集时, 无需在干冰中保存 RNA 样品,
减少了材料采集时的困难, 以 DNA 为模板的基
9123 期摇 摇 摇 丁摇 铭等: 初探低拷贝核基因在低等分类阶元系统发育重建中的适用性———以十字花科为例摇 摇 摇 摇 摇
因扩增在实验操作上也更加快捷便利。
从得到的进化树上看出, 利用 5 个核基因建
立的系统进化树结构合理, 物种之间的系统关系
明确, 用 MP、 ML及 Bayesian 3 种方法都得到了
支持率很高的进化树, 而利用 3 个常用分子标记
建立的系统进化树却未能解决本研究中 17 个十
字花科物种间的亲缘关系。 例如, 在利用常用分
子标记基因得到的联合基因树中, 拟南芥和琴叶
拟南芥形成梳子状结构。 另外, 运用这 3 个常用
分子标记中的单基因建立的系统进化树更是形成
了大量的梳子状结构。 可见, 利用核基因建立的
系统进化树具有更高的分辨率和支持率。
在利用 5 个核基因建立的系统进化树中,
Clade I中将过去确定亲缘关系较近的物种聚到
了一支, 并在自展支持率和后验概率上均得到了
100%和 1. 0 的支持率。 另外, 独行菜族中的物
种臭荠, 独行菜和荠属之间的关系有了新的诠
释; 在 Takhtajan 分类系统以及 Beilstein 利用叶
绿体基因 ndhF重建的十字花科系统关系中, 臭
荠、 独行菜和荠并入独行菜族 ( Beilstein 等,
2008)。 但 Couvreur 通过研究 8 个基因表明, 荠
属与独行菜的关系较远, 并不属于独行菜族, 而
独行菜与臭荠的关系较近; 因此, Al鄄shehbaz 将
臭荠 (Coronopus didymus) 改成 Lepidium corono鄄
pus, 得到了 88%的自展支持率 (Al鄄Shehbaz 等,
2002)。 我们的结果表明臭荠和独行菜形成姐妹
群, 利用 3 种分析方法得到的支持率为 100% ,
100%和 0. 8, 支持 Al鄄shehbaz的说法。 另外, 在
我们的研究中, 小花糖芥和桂竹香是姐妹群, 3
种方法得到的支持率均为最高。 Yang 等 (1998)
利用 5s rRNA序列的研究结果发现, 碎米荠与蔊
菜在系统关系上很近, 而本研究中, 碎米荠和蔊
菜组成姐妹群, 得到的支持率分别为 100% ,
100%和 1. 0, 支持了 Yang 等的结论。 拟南芥和
琴叶拟南芥组成姐妹群关系, 支持率分别为
100% , 100%和 1. 0, 说明利用 5 个核基因建立
的联合基因树可以得到合理的系统关系。
在 Clade II中, 芸薹属中的两个物种, 芥菜
和白菜组成了姐妹群, 自展支持率和后验概率分
别为 100%和 1. 0, 以上两个物种与萝卜组成姐妹
群, 利用 3 种方法得到的支持率分别为 100%,
93%和 1. 0, 诸葛菜又与以上 3个物种形成了姐妹
群, 利用 3 种方法得到的支持率分别为 100%,
90%和 1. 0。 在传统分类中, 以上 4个物种都属于
芸薹族, Bailey等 (2006) 利用 ITS研究了461个
十字花科物种, Koch 等 (2001) 研究十字花科
的线粒体基因 nad4 intron1 同样也支持这样的分
类关系, 其中芥菜和白菜属于芸薹属, 萝卜与芸
薹属物种关系较近也得到了以上研究的支持。 可
见本研究中选取的核基因可以真实反映以上物种
的亲缘关系。
在本次研究中, 我们采集的物种只占中国十
字花科植物的一小部分 (约为 3% ), 并且采集
地点多集中在华东地区, 得到的系统关系并不能
完整反映整个十字花科的系统关系。 本次实验的
目的只是以十字花科为例检验核基因在低等分类
阶元系统分类上的适用性。 分析结果表明, 属于
芸薹族的 4 个物种聚为一个大的分支, 自展支持
率和后验概率均为 100%和 1. 0, 独行菜和臭荠,
碎米荠和蔊菜, 小花糖芥和桂竹香, 拟南芥和琴
叶拟南芥之间均是姐妹群关系, 自展支持率和后
验概率也均为 100%和 1. 0。 以上结果表明我们
选取的编码蛋白的核基因在十字花科的系统分类
中能得到与前人相似的结论。 另外, 在核基因建
立的系统发育树中, 无论是主干, 还是属与属之
间的关系都得到了极高的支持率, 在 5 个核基因
建立的联合基因树上, 每个节点的自展支持率和
后验概率均为 100%和 1. 0, 可见本实验中所选
取的 5 个核基因可以科学地揭示 17 个十字花科
物种之间的亲缘关系。 因此, 我们可以利用这 5
个基因来研究其他低等分类阶元之间的系统发育
关系、 杂交引起的物种形成以及由于快速分化引
起的近期物种爆发等问题。
致谢摇 复旦大学植物研究所郭长奎、 尤辰江和崔洁在实
验操作过程中给予指导; 复旦大学生命科学院陆帆老师
在标本鉴定过程中给予帮助; 尹越在论文写作中提供宝
贵意见。
也参摇 考摇 文摇 献页
周太炎, 郭荣麟, 蓝永珍等, 1987. 中国植物志第 33 卷 [M].
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