全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 2 期 2016 年 1 月

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• 药材与资源 •
铁皮石斛 WRKY5 基因的克隆与表达分析
蒋 园，朱玉球*，高燕会，斯金平
浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地 浙江省铁皮石斛产业技术创新战略联盟，浙江 临安 311300
摘 要：目的 克隆铁皮石斛 DoWRKY5 基因，并对生物信息学和表达模式进行分析。方法 通过转录组测序和 RT-PCR
方法相结合首次从铁皮石斛中克隆到一个 WRKY 基因，利用生物信息学工具对其进行分析，并利用荧光定量 PCR 分析其在
铁皮石斛中的组织表达模式及在低温胁迫、脱落酸（ABA）胁迫和蔗糖渗透胁迫下的表达模式。结果 获得长 1 336 bp 的
DoWRKY5 基因转录因子 cDNA 全长序列，开放阅读框为 834 bp，编码 277 个氨基酸残基，含有一个 WRKY 基因保守结构
域和一个 C2H2 锌指结构域，属于 WRKY 基因家族的第 II 类成员。qRT-PCR 分析表明，DoWRKY5 基因在铁皮石斛根、茎、
叶中均有表达，但在叶中的表达量最高。在不同低温和 4 ℃不同时间诱导处理后，该基因表达量均显著升高，并且该基因
在 ABA 胁迫和蔗糖渗透胁迫下均可被诱导表达。结论 DoWRKY5 基因在铁皮石斛应答低温胁迫等多种非生物胁迫中可能
起重要的调控作用，为进一步研究铁皮石斛的抗寒机制和抗寒性品种的选育提供基础。
关键词：铁皮石斛；WRKY 转录因子；实时荧光定量 PCR；低温胁迫；脱落酸胁迫
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)02 - 0301 - 08
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.02.020
Cloning and expression analysis of WRKY5 gene in Dendrobium officinale
JIANG Yuan, ZHU Yu-qiu, GAO Yan-hui, SI Jin-ping
Nurturing Station for State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang Agricultural and Forestry University, Zhejiang
Provincial Strategic Alliance for Technical Innovation in Industry of Dendrobium officinale, Lin’an 311300, China
Abstract: Objective In order to isolate and analysize the bioinformatics and expression pattern of DoWRKY5 gene from
Dendrobium officinale. Methods A WRKY gene was first obtained by transcriptome sequencing and reverse
transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) from D. officinale and analyzed by bioinformatics tools. The tissue expression
pattern and the low temperature stress, abscisic acid (ABA) stress, and sucrose stress responses were analyzed by qRT-PCR. Results
The cDNA sequence of DoWRKY5 gene was isolated, which was 1 336 bp in length, with an open reading frame (ORF) of 834 bp and
an encoded polypeptide of 277 amino acid. The amino acid sequence contained a conserved WRKY domains and a zinc finger
structures (C2H2), belonging to Group of WRKY family. Expression analysis by qRTⅡ -PCR showed that DoWRKY5 was expressed in
the roots, stems, and leaves of D. officinale, and the most abundant in leaves. The amount of DoWRKY5 expression were significantly
increased under low temperature of 4 ℃ and different time. Moreover, the expression of DoWRKY5 could be induced by ABA and
source. Conclusion DoWRKY5 may be an important transcription factor to response cold stress and other abiotic stresses in D.
officinale, which provides a foundation for further study of cold tolerance mechanism and cold-resistant breeding of D. officinale.
Key words: Dendrobium officinale Kimura et Migo; WRKY transcription factor; RT-PCR; low temperature stress; abscisic acid stress

植物在长期的进化过程中形成了一系列用于调
节自身生长发育、抵御生物和非生物胁迫逆境的机
制。植物接受胁迫信号后，通过一系列的信号传递
途径，最终诱导相关基因的表达来抵御各种胁迫。
在调节基因表达的过程中，转录因子起着重要的作
用[1]。WRKY 转录因子是近年来在植物中发现的一
类广泛参与植物逆境胁迫的转录因子，因其 N-末端
含有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列而得名[2-3]。
WRKY 转录因子可以通过结合启动子序列中的
W-box（TTTGACC/T）和 SURE（sugar-responsive cis-

收稿日期：2015-09-19
基金项目：浙江省重大科技专项（2012C12912-9）；浙江省林学重中之重一级学科研究生创新项目（201530）
作者简介：蒋 园（1989—），女，硕士在读，研究方向为药用植物遗传育种。Tel: 18358106027 E-mail: 1250194527@qq.com
*通信作者 朱玉球，高级实验师，主要从事植物生物技术和铁皮石斛新品种选育的研究。Tel: 18267136776 E-mail: gaoyanhui408@126.com
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element）来调控相应基因的表达[4-5]。
温度是自然界影响植物生长与分布的主要限制
因素，已有研究表明，一些 WRKY 蛋白参与植物
低温胁迫反应[6-9]。李立芹[10]从烟草中获得与低温胁
迫相关的 WRKY12 基因，并通过 Northern Blot 试
验证明，该基因表达受 4 ℃低温胁迫诱导表达。在
低温条件下，大麦的 HvWRKY38 基因会通过非脱
落酸（ABA）依赖的途径早期暂时上调表达，但在
冰冻条件下，该转录因子会持续的上调表达，表明
它在低温胁迫中的调节作用[11]。Zhou 等[12]把大豆
的 3 个转录因子过量表达到拟南芥中，发现过量表
达 GmWRKY21 的转基因植株的抗寒性明显提高。
Hwang 等[13]在分析辣椒中的基因在冷胁迫条件下
的表达特性时发现CaWRKY1基因受冷胁迫诱导表
达。目前尚没有关于铁皮石斛 Dendrobium officinale
Kimura et Migo WRKY 转录因子的研究报道，尤其
是在低温胁迫下 WRKY 转录因子的调控机制。铁
皮石斛为兰科石斛属多年生草本植物，是传统名贵
珍稀中药材，国家中药材保护品种[14]。20 世纪 90
年代以来，随着铁皮石斛组织培养、设施栽培等一
系列关键技术的突破，铁皮石斛产业取得了跨越式
发展[15]。但由于铁皮石斛抗寒性较差，导致其生长
区域局限，因此选育抗寒性品种是实现原生态栽培
的关键[16]。本研究在铁皮石斛冷胁迫后基因的差异
表达分析结果中筛选到 23 个 WRKY 基因
（CoWRKY），按顺序从 1 到 23 编号，其中
DoWRKY5 基因被冷胁迫诱导后的表达量变化较
大，因此，本实验重点对铁皮石斛 DoWRKY5 序列
进行生物信息学分析，并研究 DoWRKY5 基因在不
同低温、低温（4 ℃）诱导不同时间、ABA 处理不
同时间和不同质量浓度蔗糖处理下的表达模式，为
进一步研究 WRKY 基因的功能和抗寒机制提供基
础数据，并为铁皮石斛分子标记辅助育种提供支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料经浙江农林大学天然药物研发中心斯
金平教授鉴定为铁皮石斛 Dendrobium officinale
Kimura et Migo，为浙江省临安市清凉峰国家自然保
护野生居群 F1（C15，铁皮石斛分布的北缘，30°17′N，
118°52′E），铁皮石斛幼苗于（25±2）℃，16 h/d 组
织培养 240 d 后，用于相关处理及 RNA 提取。
1.2 铁皮石斛总RNA提取与DoWRKY5 基因的克隆
参照李东宾[17]改良的CTAB法提取铁皮石斛的
总 RNA。根据 PrimeScriptTM II 1 st Strand cDNA
Synthesis Kit（TaKaRa）试剂盒说明书进行反转录
合成 cDNA 的第 1 条链。根据转录组测序结果设计
DoWRKY5 基因序列的特异引物（表 1），以上述
cDNA 为模板进行 PCR 扩增，反应体系（20 μL）
包括 10×Buffer、1.5 mmol/L Mg2+、0.1 mmol/L
dNTPs、0.4 μmol/L 引物、0.5 U rTaq DNA 聚合酶、
cDNA 模板 200 ng。PCR 扩增反应程序为 95 ℃、5
min；95 ℃、10 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，
32 个循环；72 ℃、7 min。PCR 扩增产物于 1.0%
的琼脂糖凝胶电泳检测，并用 DNA 凝胶回收试剂
盒（AxyGen）回收目的片段，回收产物连接到
pMD18-T 载体（TaKaRa）上，转化大肠杆菌 DH5α
感受态细胞，于 37 ℃培养过夜，进行蓝白斑筛
选和菌液 PCR 鉴定，将阳性克隆于生工生物工程
（上海）股份有限公司测序。
表 1 铁皮石斛 DoWRKY5 基因的克隆及表达分析所用引物
Table 1 Primers used to isolate and analyze expression of
DoWRKY5 in D. officinale
引物名称 引物序列 (5’-3’)
WRKY5-F CAAGGATACTTCTACGCTCTCCCCT
WRKY5-R TATTCACAACATTAGCATTGGGCAG
qRT-WRKY5-F ATATCCTTAACCCATCTCCTTCCCT
qRT-WRKY5-R TTCATGTTCTCCTCTGTAACACGCT
Actin-F TTGTGTTGGATTCTGGTGATGGTGT
Actin-R TTTCCCGTTCTGCTGTTGTTGTGAA

1.3 铁皮石斛 DoWRKY5 基因的生物信息学分析
通过 NCBI 中 Vecscree 工具（http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/tools/vecscreen/）去除载体序列；用 ORF
Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）
查找基因的开放阅读框（ORF）；利用 NCBI 中
BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）进行核苷酸
和氨基酸序列的同源搜索；通过在线软件
ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）预测
蛋白结构，分析目的基因编码蛋白质的氨基酸组
成、蛋白质相对分子质量、理论等电点及稳定性
等参数；运用 TMMHMM（http://www.cbs.dtu. dk/
services/ TMHMM/）在线工具进行蛋白质跨膜分
析；通过 ExPASY 中的 SOPMA 工具分析蛋白质
序列的二级结构；采用 ClustalX 进行多序列比对，
并通过 MEGA5.0 软件构建进化树。
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1.4 非生物胁迫下铁皮石斛 DoWRKY5 基因的表达
分析
选取生长良好、发育状态一致的 6 个月的铁皮
石斛 C15 幼苗分别进行以下处理：不同低温处理：
将铁皮石斛幼苗于低温培养箱（MC 1000HE-EV-
MC17E，SNIJDERS）中，分别于 4、0、−4、−8 ℃
（其他条件与组培室培养条件相同）处理 2 h。4
℃处理：将铁皮石斛幼苗置于低温培养箱中，4
℃（其他条件与组培室培养条件相同）分别培养
2、4、8、12、24 h。ABA 处理：用蒸馏水将根
部培养基洗净，然后将组培苗置于浓度为 100
μmol/L 的 ABA 溶液中处理 2、4、8、12、24、
48、72 h。蔗糖处理：将其分别移入添加了 20 g/L
（即原培养基作为空白对照）、30、40、50 g/L 蔗
糖的培养基中培养 1 个月，分别用未经处理的幼
苗作为空白对照，取嫩叶于液氮速冻后−80 ℃冰
箱保存备用。
提取不同处理的铁皮石斛 RNA ，根据
PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser
（TaKaRa）试剂盒进行反转录 cDNA 第一链的合成，
利用铁皮石斛转录组序列中 WRKY 基因的保守区
特点，设计 qRT-PCR 引物，内参基因为铁皮石斛
Actin 基因（表 1）；引物由生工生物工程（上海）
股份有限公司合成。
参照 SYBR® Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH
Plus）（TaKaRa）试剂盒的说明书，反应在 BIO-RAD
的 CFX96TM Real-Time System 实时定量 PCR 仪上
完成。PCR 反应体系为 10 μL，包括 SYBR Prenix Ex
Taq 5 μL，上、下游引物各 0.4 μL，cDNA模板 0.5 μL，
扩增程序为 95 ℃预变性 3 min，95 ℃变性 5 s，53
℃复性 30 s，共 40 个循环；每个循环第 3 步进行荧
光采集；最后 95 ℃变性 1 min，退火至 60 ℃，保
温 1 min 后以 0.2 ℃/s 的速度升至 95 ℃，在此过程
中连续检测其荧光值并绘制熔解曲线。每个样品设
3 次重复。利用软件 GraphPad Prism 5.0 对实验数据
进行制图分析。
2 结果与分析
2.1 铁皮石斛 DoWRKY5 基因的克隆及序列分析
从冷胁迫下铁皮石斛转录组测序文库中获得
DoWRKY5基因的 cDNA序列，经NCBI的BLASTx
比对及 ORF 分析显示其具有完整的 ORF，因此推
测为全长基因。设计其特异性引物，以铁皮石斛叶
片 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增，经 1.0%琼脂糖
凝胶电泳检测（图 1），回收目的片段，连接到
pMD18-T 载体上，转化大肠杆菌 DH5α。测序的序
列结果与转录组序列基本一致，该序列长 1 336 bp，
利用 ORF Finder 对其进行 ORF 预测，得到 834 bp
的最大 ORF，编码 277 个氨基酸，含有一个 WRKY
保守结构域，锌指结构为 C2H2 型（图 2），属于
WRKY 家族的第 II 类成员。

图 1 铁皮石斛 DoWRKY5 基因 PCR 扩增结果
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis analysis of DoWRKY5
gene fragments in D. offiecinal
2.2 铁皮石斛 DoWRKY5 基因编码蛋白质的特征
分析
通过 Protparam 软件预测其编码的蛋白相对分
子质量为 29 900，理论等电点为 6.84，不稳定系数
II 为 52.11，属于不稳定蛋白，总平均亲水性 GRAVY
为−0.584，为亲水性蛋白；TMHMM 工具对该蛋白
的跨膜结构进行预测发现其无跨膜区。
运用 ExPASY 中的 SOPMA 工具预测铁皮石斛
DoWRKY5 基因的二级结构，结果显示该蛋白的二
级结构由 37.55%的随机卷曲（random coil）、38.27%
的 α-螺旋（α-helices）、16.97%的延伸链（extended
strand）和 7.22%的 β-折叠（β-turn）组成（图 3），
推测 α-螺旋是其最大量的二级结构元件，而随机卷
曲、延伸链和 β-折叠散布于整个蛋白中。
2.3 铁皮石斛 DoWRKY5 基因编码蛋白质的同源
性及进化分析
利用 NCBI 的 BLASTp 对铁皮石斛 DoWRKY5
基因编码的氨基酸序列进行检索并下载同源序列，
结果表明，该序列与其他植物 WRKY 氨基酸序列
具有较高的同源性，与中国水仙 Narcissus tazetta L.
var. chinensis Roem （AIZ00534.1）、大豆 Glycine
max (Linn.) Merr. （NP 001237392.1）、啤酒花
Humulus lupulus L.（CDP90453.1）和油菜 Brassica
napus L. （ACQ76806.1）的同源性分别为 98%、
97%、96%、94%。用 DNAMAN 软件对下载的序列
及 DoWRKY5 基因进行多重比对（图 4），除湖北
海棠 Malus hupehensis L.（AGG23550.1）的氨基酸
Marker WRKY5
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 336 bp
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起始密码子（ATG）和终止密码子（TGA）用*表示；灰色区域为 WRKY 转录因子的保守结构域；下划线部分是锌指结构域 C2H2；其中 C 和
H 残基用方框表示
*stands for start codon and stop codon; Gray area indicated conserved structural domain of WRKY transcription factor; Conserved C2H2 domain was
highlighted by an underline in which motif C2H2 was labeled by box
图 2 铁皮石斛 DoWRKY5 基因的 cDNA 序列及编码的氨基酸序列
Fig. 2 cDNA and amino acid sequences of DoWRKY5 in D. offiecinal

图 3 铁皮石斛 DoWRKY5 编码蛋白的二级结构
Fig. 3 Predicted secondary structure of DoWRKY5 protein in D. offiecinal
序列的保守结构域为 WRKY，其他氨基酸序列均含
一个典型的 WRKY 保守结构域和C2H2锌指结构域，
说明 DoWRKY5 基因为典型的 WRKY 家族成员。为
进一步分析DoWRKY5与其他植物WRKY之间的关
系，在多重比对的基础上，利用 MEGA5.0 对 15 种
植物的WRKY蛋白构建系统进化树进行系统进化分
析（图 5），结果表明，植物 WRKY 序列的进化明显
分为双子叶植物和单子叶植物两类，铁皮石斛
DoWRKY5 与来自单子叶植物石蒜科的中国水仙
（AIZ00534.1）聚在一起，符合植物分类学地位。
E R α β
50 100 150 200 250
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1 021
1 081
1 141
1 201
1 261
1 321
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Bh-牛耳草（ACI62177.1） Bn-欧洲油菜（ACQ76806.1） Dl-龙眼（AEO31523.2） Ga-旱地锦（AIY62465.1） Gh-陆地锦（AIE43892.1）
Gm-大豆（NP_001237392.1） Hl-啤酒花（CDP90453.1） Lt-三齿拉瑞阿（AAW30662.1） Mh-湖北海棠（AGG23550.1） Mt-蒺藜苜蓿
（XP_003604245.1） Nt-中国水仙（AIZ00534.1） Pc-香芹（AAG35658.1） Pt-欧洲大叶杨（XP_006368511.1） Sm-丹参（AKA27900.1）
Bh-Boea hygrometrica (ACI62177.1) Bn-Brassica napus (ACQ76806.1) Dl-Dimocarpus longan (AEO31523.2) Ga-Gossypium aridum
(AIY62465.1) Gh-Gossypium hirsutum (AIE43892.1) Gm-Glycine max (NP_001237392.1) Hl-Humulus lupulus (CDP90453.1) Lt-Larrea tridentata
(AAW30662.1) Mh-Malus hupehensis (AGG23550.1) Mt-Medicago truncatula (XP_003604245.1) Nt-Narcissus tazetta var. chinensis (AIZ00534.1)
Pc-Petroselinum crispum (AAG35658.1) Pt-Populus trichocarpa (XP_006368511.1) Sm-Salvia miltiorrhiza (AKA27900.1)
图 4 铁皮石斛 DoWRKY5 与其他植物 WRKY 氨基酸多序列比对
Fig. 4 Alignment of predicted amino acid sequences of DoWRKY5 in D. offiecinal and those of several other plants
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图 5 铁皮石斛 DoWRKY5 与其他植物的系统进化树分析
Fig. 5 Phylogenetic tree analysis of DoWRKY5 in D.
officinale and other plants
2.4 铁皮石斛 DoWRKY5 基因的表达模式分析
2.4.1 铁皮石斛 DoWRKY5 基因组织特异性表达
分析 利用实时荧光定量 qPCR 对 DoWRKY5 基因
在根、茎、叶中的表达模式进行分析的结果表明（图
6），DoWRKY5 基因在叶中的表达量最高，其次是
根，在茎中的表达量最低。虽然在铁皮石斛根、茎、
叶中都有 DoWRKY5 基因的表达，但不同组织器官
中的表达量存在明显差异，说明 DoWRKY5 基因在
铁皮石斛中具有组织表达特异性，主要在叶片中进
行表达。
2.4.2 铁皮石斛 DoWRKY5 基因在非生物胁迫下

图 6 DoWRKY5 基因在根、茎、叶中的表达
Fig. 6 Expression profiles of DoWRKY5 gene in roots,
stems and leaves
的表达模式 利用荧光定量 PCR 对 DoWRKY5 基
因在不同低温、4 ℃不同时间、ABA 处理不同时间
及不同质量浓度蔗糖处理下的表达模式进行分析，
发现其表达量均有明显的变化。在不同低温处理下
（图 7-A），DoWRKY5 基因的表达量均极显著高于
对照，且在 0 ℃时表达量最高，说明低温处理
DoWRKY5 基因可被诱导表达；而在 4 ℃诱导处理
下，DoWRKY5 基因在 4 ℃处理时其表达量均极显
著高于对照，且在处理 24 h 时表达量达到最高（图
7-B），说明 DoWRKY5 基因在 4 ℃处理时可被迅
速诱导，且持续增长；ABA 处理 2 h 时（图 7-C），
叶片中 DoWRKY5 基因的表达量达到最高，在 8 h
时迅速降低，48 h 时达到最低，而后在 72 h 时又迅
速升高，说明 DoWRKY5 基因能在 ABA 胁迫的早
期响应这一生理过程；30 g/L 蔗糖渗透处理时（图
7-D），DoWRKY5 基因的表达量极显著高于对照且
达到最高，而后随蔗糖质量浓度的升高，其表达量
逐渐降低，说明高质量浓度的蔗糖可抑制
DoWRKY5 基因的表达。

*P＜0.05 **P＜0.01
图 7 铁皮石斛 DoWRKY5 基因在不同低温 (A)、4 ℃处理不同时间 (B)、ABA (C) 和蔗糖 (D) 胁迫下的表达
Fig. 7 Expression profiles of DoWRKY5 gene in D. officinale induced by different low-temperature (A), 4 ℃ at different times
(B), abscisic acid (C), and sucrose stress (D)
4
3
2
1
0Do
W
R
K
Y
5
基
因
相
对
表
达
量

根 茎 叶
**
**
** **
**
1.5
1.0
0.5
0.0
D
oW
R
K
Y
5
基
因
相
对
表
达
量
CK 4 ℃ 0 ℃ −4 ℃ −8 ℃
1.5
1.0
0.5
0.0
D
oW
R
K
Y
5
基
因
相
对
表
达
量
CK 4 h 8 h 12 h 24 h
1.5
1.0
0.5
0.0 Do
W
R
K
Y
5
基
因
相
对
表
达
量
1.5
1.0
0.5
0.0Do
W
R
K
Y
5
基
因
相
对
表
达
量
CK 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 48 h 72 h CK 30 40 50
*
**** ** **
A
C
B
D
4 ℃
ABA 蔗糖/(g·L−1)
MhWRKY40a
HiWRKY
PtWRKY40
GmWRKY78
MtWRKY
BnWRKY40
PcWRKY4
SmWRKY
BhWRKY1
DiWRKY5
GhWRKY73
GaWRKY28
LtWRKY21
NtWRKY40
DoWRKY5
0.05
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3 讨论
自 1994 年 Sumei 等[18]首次在甘薯中分离得到第
一个 WRKY 蛋白（SPF1）后，人们陆续在拟南芥[19]、
烟草 [20]、土豆 [21]和水稻 [22]等多种植物中克隆到
WRKY 转录因子。目前已确定拟南芥基因组中有 74
个 WRKY 基因[23]，水稻基因组已明确 105 个完整的
WRKY 基因[24]。近年来 WRKY 转录因子的功能受到
许多研究者的关注，越来越多的研究表明 WRKY 家
族在植物抵御生物和非生物胁迫逆境的防卫反应中
起到重要的调节作用[25-27]。仇玉萍等[28]从低温（4 ℃）
诱导的水稻叶片 cDNA 文库中克隆获得 13 个WRKY
基因，其中有 10 个 WRKY 基因的表达受到低温（4
℃）、高温（42 ℃）、NaCl、PEG 等非生物逆境的影
响。Wu 等[6]对小麦中的 8 个 WRKY 基因进行低温（3
℃）处理，其中 6 个基因在 30 min 时迅速上调表达，
说明低温诱导 WRKY 基因的表达。本研究中铁皮石
斛DoWRKY5基因在不同低温处理2 h和4 ℃不同时
间处理下，均可上调表达，说明 DoWRKY5 基因受低
温胁迫的诱导表达，且能快速响应低温胁迫，这和前
人研究低温胁迫的研究结果相似。许多研究者还发
现，一些冷诱导基因的表达不仅受低温的调控，还受
ABA 的影响[29]。Talanova 等[30]研究表明，小麦一个
WRKY 基因在低温处理 15 min 时表达量迅速上升，
处理 1 d 后逐渐降低，然而，在加入外源 ABA 后低
温处理时，其表达量逐渐升高，但显著低于未加入
ABA 时的表达量。铁皮石斛 DoWRKY5 基因在 ABA
处理下，先被诱导表达，然后又被抑制，在处理 72 h
时又被迅速诱导。WRKY 基因表达还具有组织特异
性，在植物不同器官如根、茎、叶、花、果实中发现
都有相关 WRKY 基因的表达，且表达量有所不同[31]。
本研究 DoWRKY5 基因组织表达分析结果显示在铁
皮石斛根、茎、叶中均有表达，但表达量不同，在叶
中的表达量最高，其次是根，在茎中的表达量最低，
表明 DoWRKY5 基因的表达量具有明显的组织特异
性。这一研究结果与小麦 4 个 WRKY 基因
（TaWRKY13、TaWRKY46、TaWRKY68-a、TaWRKY68-b）
在小麦的组织特异性表达结果是一致的[7]。
铁皮石斛 DoWRKY5 基因在低温胁迫、ABA
胁迫和蔗糖胁迫下均被诱导表达，因此推测
DoWRKY5 基因在铁皮石斛应答低温胁迫等多
种非生物胁迫中可能起重要的调控作用，对铁皮
石斛抗寒机制的研究及耐低温品系选育有积极
的意义。
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