全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 24 期 2015 年 12 月

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红花单功能反馈抑制敏感型 CtAK1 基因克隆、序列分析及表达载体构建
王艳芳 1, 2, 3，张 玲 1, 3 #，张 娜 2，张 娟 2，李红群 2，杨 晶 1, 2，杜林娜 2，官丽莉 1, 2，李海燕 1, 2*，
李校堃 1, 2, 3*
1. 吉林农业大学 生物反应器与药物开发教育部工程研究中心，吉林 长春 130118
2. 吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118
3. 吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118
摘 要：目的 分离红花天冬氨酸代谢途径关键酶天冬氨酸激酶（AK）基因的全长 cDNA 序列，进行植物超表达载体构建。
方法 根据红花种子转录组文库注释和 qRT-PCR 鉴定的 AK 基因核心片段及表达分析数据，采用 RACE 技术获得红花 AK
（CtAK）基因的全长 cDNA，利用 DNA 重组技术构建植物超表达载体。结果 生物信息学分析表明，CtAK 基因全长 1 703
bp，ORF 区为 1 626 bp，编码 541 个氨基酸残基，功能结构域分析推测，该基因可能为单功能反馈抑制敏感植物 AK1。通
过 DNA 重组技术成功构建以 35 S 为启动子和 Bar 抗性基因并含有叶绿体转运肽的 pCAMBIA3301-CTP-AK1 植物超表达载
体。结论 获得 CtAK1 基因的编码序列并构建植物超表达载体，为进一步研究其生物学功能及其在红花氨基酸代谢调控中
的作用机制奠定基础。
关键词：红花；天冬氨酸激酶；RACE；生物信息学；植物表达载体
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)24 - 3740 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.24.022
Molecular cloning, sequence analysis, and construction of expression vector of
monofunction feedback inhibition sensitive CtAK1 gene in Carthamus tinctorius
WANG Yan-fang1, 2, 3, ZHANG Ling1, 3, ZHANG Na2, ZHANG Juan2, LI Hong-qun2, YANG Jing1,2, DU
Lin-na2, GUAN Li-li2, LI Hai-yan1, 2, LI Xiao-kun1, 2, 3
1. Engineering Research Center of Bioreactor and Pharmaceutical Development, Ministry of Education, Jilin Agricultural
University, Changchun 130118, China
2. College of Life Sciences, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
3. College of Traditional Chinese Medicine, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
Abstract: Objective To separate the full length cDNA of gene encoding the key enzyme AK in aspartate metabolic pathways of
Carthamus tinctorius and to construct plant overexpression vector. Methods According to annotation on transcriptome library of C.
tinctorius and core fragments and expression analysis data of CtAK identified by qRT-PCR, we separated the full length cDNA of AK
gene of C. tinctorius (CtAK) using RACE technology and constructed plant expression vector using recombinant DNA technology.
Results Bioinformatics analysis showed the full length CtAK was 1 703 bp and ORF area was 1 626 bp, encoding 541 amino acid
residues. The function structure domain analysis showed the gene might be a monofunction feedback inhibition sensitive AK1 from
plant. We successfully constructed plant expression vector pCAMBIA3301-CTP-AK1 which contained 35 S promoter and Bar resistance
genes and chloroplast transit peptide by recombinant DNA technology. Conclusion The gene encoding CtAK1 is obtained and the plant
overexpression vector is constructed, which lays the foundation for researching on biological function and mechanism of action in
amino acid metabolism regulation of C. tinctorius .
Key words: Carthamus tinctorius L.; monofunction aspartokinase gene; RACE; bioinformatics; plant overexpression vector

收稿日期：2015-05-19
基金项目：国家高技术研究“863”发展计划（2011AA100606）；国家自然科学基金资助项目（31401445）；吉林省科技厅医药产业推进计划项
目（20140311034YY）；教育部博士点基金（20122223120002）
作者简介：王艳芳（1982—），女，吉林人，在读博士，研究方向为植物生物反应器。
*通信作者 李海燕（1971—），女，吉林人，教授，博士生导师，研究方向为生物反应器。Tel: (0431)84533427 E-mail: hyli99@163.com
李校堃（1964—），男，吉林人，教授，博士生导师，研究方向为生物反应器。Tel: (0431)84533348 E-mail: xiaokunli@163.net
#共同第一作者
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 24 期 2015 年 12 月

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红花是我国传统中药材，自印度引种到中国
已有 2 100 余年的栽培历史[1]，主产于新疆、四川、
云南等地。目前红花的研究多集中在花冠的色素
及种子油脂，对于红花种子氨基酸的研究国内外
极少见报道。在红花主产区，红花去油籽粕被当
作一种废料弃去，没有得到充分利用[2]。研究表
明，红花籽粕含有丰富的蛋白质和微量氨基酸[3]，
可以作为一种动物饲料，目前国外已将红花种子
作为鸟类食物得到广泛应用。红花种子中赖氨酸、
苏氨酸、蛋氨酸等必需氨基酸含量甚微，人类和
动物必须通过额外摄取才能满足营养需求。为了
提高红花种子中必需氨基酸的的量，通过代谢工
程技术超表达正调控关键基因和 RNA 阻断负调
控关键基因有可能会显著提高必需氨基酸量，大
大增加红花籽粕的经济价值，但是，由于赖氨酸
的合成受多基因控制，且与一些不良性状紧密连
锁，常规育种方法很难获得高赖氨酸量的红花新
品种[4]。因此，结合现代基因挖掘手段（包括转
录组测序和基因表达谱分析技术），在分子水平深
度挖掘红花种子赖氨酸合成途径的关键基因资
源，是提高红花种子赖氨酸量的品质改良分子育
种领域迫切需要的基础性工作。目前，在基因水
平上调控红花氨基酸量的研究国内外尚未见报
道。本研究在获得红花天冬氨酸激酶（CtAK）基
因核心片段并进行表达模式分析的基础上，通过
RACE 技术获得该基因的全长 cDNA 序列，利用
生物信息学技术预测该基因的基本理化性质及功
能结构域，同时运用 DNA 重组技术构建该基因的
植物超表达载体。为阐明该基因的生物学功能及
其在红花氨基酸代谢调控中的作用分子机制奠定
基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红花种子购自新疆红花缘科技有限公司，经吉
林农业大学中药材学院杨世海教授鉴定为川红 1 号
红花 Carthamus tinctorius L. 品种，种植于吉林农业
大学生物反应器与药物开发教育部工程中心基地，
于初花期开始采集种子，液氮速冻后，存于−80 ℃
冰箱备用。
RNAisoPLUS 提取试剂盒（Takara 公司），DNA
凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒（Axygen 公司），
反转录酶、Smarter TM RACE cDNA Amplication kit
（Clontech），pEASY-T1 Vector、限制性内切酶、T4
DNA 连接酶（promega）和其他工具酶（TaKaRa 公
司），PCR 引物由北京金唯智生物技术有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 红花种子总 RNA 的提取 取出在−80 ℃冰
箱中保存的红花种子，按照 RNAisoPLUS 说明，提
取红花种子总 RNA，NanoDrop2000 微量核酸蛋白
检测仪检测 RNA 的纯度及浓度；甲醛变性电泳检
测 RNA 的完整性，−80 ℃贮存备用。
1.2.2 CtAK 基因全长 cDNA 的分离 以反转录获
得的 cDNA 为模版，利用 Vector11.5 和 DNAStar 软
件设计 3’-RACE 和 5’-RACE 引物，分别为 3ak1：
5’-GGGTCAATTTGGATTCCTGGC-3’和 3ak2：
5’-TGGGTATATCTGTAGATGTC-3’；5ak1：5’-GGTTTG-
CGAGAAATTCAGGT-3’和 5ak2： 5’-TACCTGAAT-
TTCTCGCAAACC-3’。按照Smarter TM RACE cDNA
Amplication kit 说明书操作进行两轮巢式 PCR 反
应，扩增 CtAK 基因的 3’末端和 5’末端，根据 3’端
和 5’ 端序列设计全长 cDNA 引物 AKP1 ：
5’-ATGGCTGCATACCTATGTGGGGTTG-3’， AKP2：
5’-GCCTTTCCATAATCCCCAATCTTAC-3’，以红花
种子 cDNA 为模板进行全长 cDNA 扩增，扩增产物
经 T/A 克隆后，送北京金唯智生物科技公司测序。
1.2.3 CtAK 基因编码产物生物信息学分析 根据
CtAK 基因编码蛋白的氨基酸序列，利用在线软件
ExPasy Protparam 进行理化性质分析，利用
InterProScan、NCBI Conserved Domains 和 ExPasy
Prosite 进行蛋白质结构域和功能位点分析，利用
SOPMA 进行蛋白质二级结构分析。Signa IP4.0
Server 进行分泌蛋白分析、WOLF PSORT 进行亚细
胞定位、TMHMMServer 进行跨膜区分析，ExPasy
ProScale 进行疏水性预测。利用 SWISS-MODEL 进
行蛋白三维结构预测。
1.2.4 红花 CtAK 基因植物超表达载体构建 以植物
双元表达载体 pCAMBIA3301 为骨架结构，以
CaMV35S 为启动子，Bar 作为安全筛选标记基因，在
含有叶绿体转运肽的基因两端设计含有 NcoI 和 BgL
II 酶切位点的引物，对克隆载体和 pCAMBIA3301 进
行双酶切，回收目的片段，通过 T4 DNA 连接酶将基
因片段插入到表达载体上，通过菌液 PCR 和双酶切
鉴定，确定超表达载体是否构建成功。
2 结果与分析
2.1 红花种子总 RNA 的提取
从川红 1 号红花种子中提取总 RNA，经凝胶
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 24 期 2015 年 12 月

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电泳检测，结果显示 28 S rRNA 和 18 S rRNA 条
带清晰，前者亮度约是后者的 2 倍，说明所提取
的 RNA 完整性较好；经微量核酸蛋白检测仪测得
A260/A280＝1.99，A260/A230＝2.02，无 RNA 降解和 DNA
污染，表明 RNA 纯度较高，可用于 RT-PCR 扩增。
2.2 CtAK 基因全长 cDNA 的分离
根据在红花转录组中验证的 CtAK 基因核心片
段序列，设计 RACE 特异引物。
根据分别扩增红花 CtAK 基因的 3’末端序列
（图 1-A）和 5’末端序列（图 1-B），将测序后的 3’、
5’端序列及核心序列拼接后得到全长为 1 703 bp 的
红花 CtAK 基因 cDNA 序列，将该基因命名为
CtAK，在基因两端设计全长引物，经 PCR 扩增后
得到全长 1 703 bp 的目的基因（图 2），测序结果表
明所得序列与上述拼接结果一致。

图 1 CtAK 基因 3’端 (A) 和 5’端 (B) RACE 扩增电泳图
Fig. 1 RACE electrophoresis of 3’ (A) and 5’ (B) terminals
M 1 2 3 4 5 6 7 8
2000bp
1000bp

M-Marker 1-阴性对照 2～8-PCR 扩增 CtAK 基因
M-Marker 1-negative control 2—8 Amplified by PCR full length
of gene encoding CtAK
图 2 CtAK 基因全长 cDNA PCR 扩增电泳图
Fig. 2 PCR electrophoresis of full-length cDNA of CtAK
2.3 CtAK 基因编码产物生物信息学分析
2.3.1 CtAK 基因理化性质分析 利用 Vector11.5 软
件将 cDNA 翻译为氨基酸序列发现，CtAK 基因编码
蛋白由 541 个氨基酸组成，利用在线软件 Expasy 分
析发现：CtAK 分子式 C2641H4258N720O786S24，总原子
数 8 429。相对分子质量 59 442.6，理论等电点 6.41，
带正电残基（Asp＋Glu）60，带负电残基（Asp＋Lys）56。
不稳定系数 32.24（不稳定系数小于 40，表示 CtAK
基因编码蛋白稳定）。脂肪系数 99.98，总平均疏水
指数 0.011，负值表示亲水性，正值表示疏水性，总
平均疏水性介于−0.5～0.5 为两性氨基酸[5]，所以
CtAK 基因编码蛋白为两性氨基酸。通过 ProtParam
工具分析氨基酸组成发现，其氨基酸组成中亮氨酸
的量最多，占总数的 10.7%，其次为缬氨酸，占总
数的 8.7%（表 1）。
表 1 CtAK 蛋白氨基酸组成分析
Table 1 Analysis on amino acid sequence for CtAK
氨基酸 数量 比例/% 氨基酸 数量 比例/%
丙氨酸 39 7.2 赖氨酸 30 5.5
精氨酸 26 4.8 甲硫氨酸 14 2.6
天冬酰胺 23 4.3 苯丙氨酸 20 3.7
天冬氨酸 27 5.0 脯氨酸 25 4.6
半胱氨酸 10 1.8 丝氨酸 41 7.6
谷氨酰胺 16 3.0 苏氨酸 35 6.5
谷氨酸 33 6.1 色氨酸 4 0.7
甘氨酸 34 6.3 酪氨酸 9 1.7
组氨酸 14 2.6 缬氨酸 48 8.9
异亮氨酸 35 6.5 吡咯赖氨酸 0 0.0
亮氨酸 58 10.7 含硒半胱氨酸 0 0.0

2.3.2 CtAK 基因编码蛋白的二级结构及功能位点
分析 采用 SOPMA 预测 CtAK 编码蛋白的二级结
构如图 3 所示，结果表明 CtAK 编码蛋白二级结构
中 α-螺旋（alpha helix）占 39.00%、延伸链（extended
strand）占 21.07%、β-折叠（beta turn）占 8.32%、
无规卷曲（random coil）占 31.61%。利用在线软
件 InterProScan 和 Conserved Domains 进行保守结
构域分析，结果表明该蛋白序列含有 1 个 AAK
superfamily和 2个ACT superfamily保守的结构域，
以上结构域分别位于 76～368 位、387～464 位和
466 ～ 530 位氨基酸残基。通过进一步分析
ACT-Like domain 发现，ACT-AK1-AT-1 位于 C 端，
是单功能赖氨酸敏感型植物 AK1 的催化域，因此
本实验将 CtAK 基因命名为 CtAK1。利用 ExPasy
Prosite 分析 CtAK1 的功能位点，结果表明，天冬
氨酸激酶保守功能位点位于 77～85 位，氨基酸序
列为 VMKFGGSSL，3 种分析工具预测的结果一
致，推测该基因为天冬氨酸激酶家族基因。如图
4-A～C 所示。
Maker 产物 Marker 产物
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
2 0 bp
1 0 bp

M 1 2 3 4 5 6 7 8
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蓝色线代表 α-螺旋，红色线代表延伸链，绿色线代表 β-折叠，长度代表各自所占的百分比
Blue line represented alpha helix, red line represented extended strand, green line represented beta turn, length represented percentage
图 3 CtAK 编码蛋白的二级结构
Fig. 3 Secondary structure of protein encoded by CtAK


USERSEQ1

图 4 CtAK 基因编码蛋白保守结构域 Conserved Domains (A)、Blast (B) 和 InterProScan (C) 分析结果
Fig. 4 Analysis on Conserved Domains (A), Blast (B), and InterProScan (C) of protein encoded by CtAK
2.3.3 CtAK1 编码蛋白跨膜区、信号肽、亚细胞
定位预测分析 利用 TMHMM 预测 CtAK1 编码
蛋白的跨膜区，结果显示该蛋白不具有跨膜区，
由 此 推 断 该 蛋 白 不 经 过 跨 膜 转 运 。 利 用
SignaIP4.1[6]工具预测 CtAK1 编码蛋白没有信号
肽，与跨膜区分析相一致。利用在线工具 WOLF
PSORT 预测该蛋白的亚细胞定位情况：叶绿体的
定位系数为 12.5（chlo：12.5），叶绿体和线粒体
定位系数为 7.5（chlo_mito：7.5）。因此，该蛋
白最可能定位于叶绿体上。
2.3.4 CtAK1 基因编码蛋白亲疏水性分析 利用
ExPASy ProtScale 程序对 CtAK1 基因编码的蛋白做
亲疏水性预测，负值表示亲水性，正值表示疏水性。
结果显示该蛋白的疏水性最大值 2.5，最小值−2.5。
从图 5 可以看出，CtAK1 基因编码蛋白的疏水性区
域与亲水性区域交替出现，没有典型的疏水性区域，
属于两性氨基酸，与 Protparam 预测结果一致。
2.3.5 CtAK1 基因编码蛋白三维结构预测 通过
SWISS-MODEL[7-8]进行同源建模，ACT 结构域中主
要以 α-螺旋的形式存在（图 6）。


图 5 CtAK1 编码蛋白亲疏水性分析
Fig. 5 Hydrophobicity analysis on CtAK1 encoding protein
0 100 200 300 400 500
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
−0.5
−1.0
−1.5
−2.0
−2.5 0 100 200 300 400 500
位点
A







B





C
得
分

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图 6 CtAK1 蛋白 3 维结构
Fig. 6 3D structure of CtAK1 protein
2.4 CtAK1 氨基酸序列同源性分析
在前期研究中，将核心序列构建系统发育树发
现：红花 CtAK 与芝麻 AK 和巨桉 AK 亲缘关系较
近，初步判断 CtAK1 基因属于 AK 家族基因。利用
DNAMAN 软件分析 CtAK1 与芝麻（SeAK）、巨桉
（EgAK）的同源性，结果显示其同源性分别为
81.63%与 75.76%。如图 7 所示。3 个蛋白均具有 2
个 ACT 结构域和天冬氨酸激酶功能位点，这说明所
克隆的 CtAK1 基因属于天冬氨酸激酶家族。
35SeAK
34CtAK
40EgAK
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75SeAK
65CtAK
79EgAK
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115SeAK
105CtAK
119EgAK
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235SeAK
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275SeAK
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KFGG motif
Monofunctional AK box
DRP motif
T-DNA
ACT-Like domain
ACT- domain

图 7 CtAK1 蛋白的多重序列比对
Fig. 7 Alignment of CtAK1 proteins from different plants
2.5 红花 CtAK1 基因植物超表达载体构建
将目的基因与叶绿体转运肽融合后，将植物表
达载体 pCAMBIA3301 和带有含有叶绿体转运肽的
目的基因分别用 NcoI 和 BgL II 进行双酶切，将目
的片段与酶切后的 pCAMBIA3301 载体用 T4 DNA
连接酶连接后，得到植物表达载体 pCAMBIA3301-
CTP-CtAK1，载体构建过程如图 8 所示。将重组载
体转化大肠杆菌 DH5α，对重组质粒进行菌液 PCR
和酶切验证，获得预期大小约为 1 785 bp 的融合基
因，证明该植物超表达载体构建成功，见图 9、10。

图 8 pCAMBIA3301-CTP-CtAK1 重组载体构建示意图
Fig. 8 Constructed recombinant vector of pCAMBIA3301-
CTP-CtAK1
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239

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319


335
344
339

395
384
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475
462
477

515
502
517

543
530
545
NcoI Bg1II
RB 35 S CTP-CtAK1 NOS 35 S Bar NOS LB
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 24 期 2015 年 12 月

• 3745 •
M 1 2 3 4 5 6 7 8
2000bp
1000bp

M-Marker 1-阴性对照 2～8-阳性克隆
M-Marker 1-negative control 2—8-positive
图 9 pCAMBIA3301-CTP-CtAK1重组质粒菌液PCR鉴定
Fig. 9 PCR identification of pCAMBIA3301-CTP-CtAK1
recombinant plasmid

M-Marker 1～2-NcoI/BgL II 双酶切鉴定
M-Marker 1—2-Double enzyme digestion identification of NcoI/BgL II
图 10 pCAMBIA3301-CTP-CtAK1 重组质粒酶切鉴定
Fig. 10 Enzyme digestion identification of pCAMBIA3301-
CTP-CtAK1 recombinant plasmid
3 讨论
天冬氨酸激酶在高等植物中是控制氨基酸代谢
的主要限速酶之一，功能结构域分析推测该酶的活
性受末端产物的反馈抑制，为进一步证实 CtAK1
的酶活性，本研究在获得红花转录组测序分析数据
等前期工作基础上[9]，运用 RACE 技术克隆了红花
CtAK1 基因的全长 cDNA 序列，功能结构域分析发
现该基因为单功能反馈抑制敏感 CtAK1，并成功构
建植物超表达载体，为进一步实验研究提供了参考
依据，为红花在氨基酸代谢调控方面的深入研究提
供理论依据。
AK 基因在植物体内存在复杂的作用机制，其
中 AK 基因以单功能 Lys 敏感型和双功能苏氨酸
敏感型形式存在，均受到代谢终产物的协同反馈
抑制[10]。通过超表达细菌源反馈抑制不敏感天冬氨
酸激酶基因 AK，在苜蓿中赖氨酸的量显著提高，
证实 AK 基因在赖氨酸合成代谢中起着决定性的调
控作用[5-11]。通过在水稻中表达细菌源赖氨酸反馈
抑制不敏感 AK，并干扰其分解代谢，发现赖氨酸
的量在叶片中提高 12 倍，在种子中提高 60 倍，并
且植株的生长无异常表现[12]。孟山都公司通过超表
达细菌源反馈抑制不敏感 AK 突变体，导致大豆种子
赖氨酸量提高 100 倍，达到了动物饲料要求水平[13]。
因此，AK 基因对植物种子赖氨酸生物合成具有重要
调控作用。但是，目前有关天冬氨酸激酶基因 AK 在
红花种子赖氨酸合成途径中的作用机制研究国内外
尚未见报道。本研究一方面为探明红花天冬氨酸激酶
基因的生物学功能奠定基础，另一方面为利用分子育
种技术培育高赖氨酸量的红花新品种奠定基础。
参考文献
[1] 杨玉霞, 吴 卫, 郑有良. 红花研究进展 [J]. 四川农
业大学学报, 2004, 22(4): 365-369.
[2] 赵 钢, 王安虎. 红花的资源及药用价值 [J]. 中国野
生植物资源, 2004, 23(3): 25-26.
[3] 钱学射, 黄奇碧. 红花种子氨基酸分析 [J]. 氨基酸杂
志, 1994(2): 33-34.
[4] 朱 军. 遗传学 [M]. 第3版. 北京: 中国农业出版社, 2010.
[5] Amy C S, Zhu C M, Yanamadala S R, et al.
Threonine-insensitive homoserine dehydrogenase from
Soybean genomic organization, kineticmechanism, and in
vivo activity [J]. J Biol Chem, 2010, 285: 827-834.
[6] Karsten W E, Viola R E. Chemical and kinetic mechanism of
SignalP 4. 0: discriminating signal peptides from
transmembrane regions Petersen TN., Brunak S., von Heijne
G. & Nielsen H [J]. Nat Methods, 2011, 8: 785-786.
[7] Marco B, Stefan B, Andrew W, et al. SWISS-MODEL:
modelling protein tertiary and quaternary structure using
evolutionary information [J]. Nucl Acids Res, 2014, 42(1):
W252-W258.
[8] Arnold K, Bordoli L, Kopp J, et al. The SWISS-MODEL
workspace: a web-based environment for protein structure
homology modeling [J]. Bioinformatics, 2008, 22: 195-201.
[9] Li H Y, DongY Y, Yang J, et al. De novo transcriptome of
safflower and the identification of putative genes for
oleosin and the biosynthesis of flavonoids [J]. PLoS One,
2012, 7(2): 1-10.
[10] Ayse O U, Sami D A F. Biotechnology for enhanced
nutritional quality in plants [J]. Crit Rev Plant Sci, 2013,
32(5): 321-343.
[11] Gad G. The aspartate-family pathway of plants Linking
production of essential amino acids with energyand stress
regulation [J]. Plant Sig Behavior, 2011, 6(2): 192-195.
[12] Long X, Liu Q, Chan M, et al. Metabolic engineering and
profiling of rice with increased lysine [J]. Plant
Biotechnol J May, 2013, 11(4): 490-501.
[13] Qi Q G, Huang J T, James C, et al. Metabolically
engineered soybean seed with enhanced threonine levels:
biochemical characterization and seed-specific expression
of lysine-insensitivevariantso faspartatekinasesfromthe
enteric bacterium Xenorhabdus bovienii [J]. Plant
Biotechnol, 2011, 19: 193-204.
M 1 2 3 4 5 6 7 8
2 000 bp
1 000 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
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