全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 8期 2014年 4月

·1143·
铁皮石斛咖啡酰辅酶 A 氧甲基转移酶基因的分离与表达分析
张 岗 1, 2，胡本祥 1，张大为 2，陈 伟 1，郭顺星 2*
1. 陕西中医学院药学院 陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 西安 712046
2. 中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193
摘 要：目的 分离珍稀濒危药用植物铁皮石斛咖啡酰辅酶 A氧甲基转移酶（caffeoyl CoA O-methyltransferase，CCoAOMT）
基因（DoOMT）并进行生物信息学和表达模式分析。方法 采用 RT-PCR和 RACE技术获取基因 cDNA全长；利用生物信
息学软件预测蛋白的理化性质、结构域和三维建模等分子特性；用 DNASTAR 6.0和MEGA 4.0分别进行氨基酸多序列比对
和进化关系分析；借助实时定量 PCR检测基因表达模式。结果 分离到 DoOMT（GenBank注册号 KF876839），cDNA全
长 1 005 bp，编码一条由 239个氨基酸组成的多肽，相对分子质量为 2.708×104，等电点 5.03；DoOMT蛋白不含跨膜域和
信号肽，具有氧甲基转移酶 family 3、甲基转移酶的保守结构域（13～238、31～238）和 8 个保守基序；DoOMT 与植物
CCoAOMTs蛋白一致性为 49.4%～78.7%，所在分支隶属于 CCoAOMTs分子进化的 1b类群，与单子叶植物香草亲缘关系最
近；DoOMT 基因转录本在石斛根、茎、叶器官中为组成型表达，茎中相对表达量较高，为叶中的 4.562 倍，根和叶中无显
著差异。结论 铁皮石斛 CCoAOMT 基因 DoOMT 的分子特征为进一步研究其在铁皮石斛次生代谢和生长发育过程中的作
用奠定基础。
关键词：铁皮石斛；咖啡酰辅酶 A氧甲基转移酶；基因克隆；序列分析；实时定量 PCR
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)08 - 1143 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.08.019
Isolation and expression analysis of caffeoyl CoA O-methyltransferase gene in
Dendrobium officinale
ZHANG Gang1, 2, HU Ben-xiang1, ZHANG Da-wei2, CHEN Wei1, GUO Shun-xing2
1. Shaanxi Provincial Key Laboratory for Chinese Medicine Basis & New Drugs Research, College of Pharmacy, Shaanxi
University of Chinese Medicine, Xi’an 712046, China
2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China
Abstract: Objective To isolate the caffeoyl CoA O-methyltransferase (CCoAOMT) gene (DoOMT) in a rare endangered medicinal
orchid species Dendrobium officinale, and to carry out the bioinformatics and expression mode analysis. Methods RT-PCR and
RACE technologies were used to obtain the full length cDNA of DoOMT gene. The characteristics of physiochemical properties,
conserved domains, and three dimensional structure of the deduced DoOMT protein were determined using a series of bioinformatic
tools. The analyses of multiple alignment and phylogenetic tree were performed using DNASTAR 6.0 and MEGA 4.0 softwares,
respectively. Real time quantitative PCR was used for gene expression analysis. Results The full length cDNA of DoOMT was 1 005
bp in length and encoded a 239-amino acid protein with a molecular weight of 2.708×104 and an isoelectric point of 5.03; The deduced
DoOMT protein, without transmembrane or signal peptide residues, contained the oxygen methyltransferase family 3,
methyltransferase conserved domains (13—238 and 31—238), and eight conserved signature sequences. DoOMT had high identities
(49.4%—78.7%) with CCoAOMTs proteins from various plants; DoOMT belonged to the 1b subgroup of the CCoAOMT evolutionary
tree, and was closely related to the monocot Vanilla planifolia. DoOMT transcripts were constitutively expressed in the leaves, stems,
and roots. The transcription level of DoOMT was markedly higher than that in the leaves with 4.562 fold, whereas the transcript amount
showed no significant difference in the leaves and roots. Conclusion Molecular characterization of DoOMT will be useful for the

收稿日期：2013-12-02
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31070300，31101608）；陕西省青年科技新星项目（2012KJXX-44）；陕西省教育厅专项科研计划项目（2013JK0829）
作者简介：张 岗，男，博士，副教授，主要从事药用植物分子生物学研究。E-mail: zhanggang2006@gmail.com
*通信作者 郭顺星，男，博士，研究员，主要从事药用植物菌根生物学研究。Tel/Fax: (010)62829619 E-mail: sxguo1986@163.com
网络出版时间：2014-03-19 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20140319.1849.009.html
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 8期 2014年 4月

·1144·
further functional determination of the gene involving in the secondary metabolism along with growth and development in D. officinale.
Key words: Dendrobium officinale Kimura et Migo; caffeoyl-CoA O-methyltransferase; gene cloning; sequence analysis; real time quantitative PCR

氧甲基转移酶（O-methyltransferase，OMT）以
S-腺苷-L-甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）
为甲基供体，催化类黄酮、生物碱、木质素前体等
化合物的甲基化反应，在植物细胞生理代谢中起重
要作用[1]。底物特异性和氨基酸序列特征将植物
OMTs分为 2大类型。II型 OMTs主要包括咖啡酸氧
甲基转移酶（caffeic acid OMT，COMT），相对分子
质量较大，无需金属离子激活即可催化木质素前体
咖啡醛或 5-羟基松柏醛等物质的甲基化[2]。咖啡酰辅
酶A氧甲基转移酶（caffeoyl-CoA OMT，CCoAOMT）
则属于 I 型，相对分子质量较小，需要 Mg2+激活，
以咖啡酰辅酶 A为底物，将 SAM上的甲基转移到木
质素单体的苯环碳 3 位置上，形成阿魏酰辅酶 A，
是木质素合成途径中的关键酶[2]。CCoAOMTs 蛋白
的氨基酸序列具有 8 个保守基序，其中 A、B 和 C
为植物 OMTs所共有，而 D、E、F、G和 H 5个基
序为 CCoAOMTs特有的标签序列[2]。
植物 CCoAOMTs 通常以多基因家族成员形式
存在，以满足植物各种生理需求。大量研究已经证
实 CCoAOMTs 基因对植物细胞木质素合成至关重
要。CCoAOMTs 基因参与愈创木基（G）和紫丁香
基（S）木质素的生物合成，抑制 CCoAOMTs基因
表达会使拟南芥和苜蓿木质素量普遍降低[3-4]。对烟
草 CCoAOMT和 COMT基因沉默分析发现，单独抑
制前者的转基因株系木质素下降幅度显著大于抑制
后者，2个基因同时被下调导致木质素量急剧降低，
说明二者的协同效应[5]。关于香草 Vanilla planifolia
CCoAOMT 的最新研究证据表明，Vp-OMT4 和
Vp-OMT5 基因原核表达产物最适底物为 3′-五羟黄
酮，而非咖啡酰辅酶 A 或咖啡酸等，暗示
CCoAOMTs 基因在植物细胞苯丙烷类代谢中的新
机制[6]。同时，CCoAOMTs基因在植物抵御生物、
非生物胁迫过程中也起重要作用。西瓜[7]、拟南
芥[8]和龙眼[9]CCoAOMTs分别调控植物对干旱、高
盐或低温等逆境胁迫的生理适应。在番茄-青枯雷尔
氏菌 Ralstonia solanacearum亲和互作体系中，病菌
侵染导致宿主 CCoAOMT基因表达量降低，说明该
基因参与植物对病原菌固有的防御反应[10]。
铁皮石斛 Dendrobium officinale Kimura et Migo
为兰科（Orchidaceae）石斛属 Dendrobium Sw. 多年
生草本植物，药用部位为新鲜或干燥茎，具有益胃
生津、滋阴清热、润肺止咳、明目强身等作用，是
石斛属药用植物中最为珍稀名贵的种[11]。石斛属植
物主要含有多糖、茋类、酚类、木质素类等活性成
分，具有重要的药理作用[12]。前期，本课题组利用
SSH技术富集菌根真菌侵染铁皮石斛根的差异表达
基因[13]，分离得到一条 447 bp的 EST，BLASTx分
析显示其与香草 Vp-OMT4（GenBank 注册号
ADZ76153）相似性较高（73%）。鉴于 CCoAOMTs
基因在植物细胞生理代谢中的重要作用，该差异基
因可能在铁皮石斛生长发育中起作用。本研究利用
RACE技术从铁皮石斛中分离到一个 CCoAOMT基
因 cDNA 全长 DoOMT，并进行生物信息学及表达
模式分析，为进一步揭示其在铁皮石斛次生代谢以
及生长发育过程中的生物学功能提供依据。
1 材料
材料采自云南西双版纳，经笔者鉴定为野生铁
皮石斛 Dendrobium officinale Kimura et Migo全株，
取石斛根、茎、叶组织样品，液氮速冻后置−80 ℃
保存备用。
2 方法
2.1 RNA 提取和 cDNA 合成
按照 EASYspin 植物 RNA 快速提取试剂盒
（Aidlab，China）操作说明制备各样品总 RNA，
NanoDropTM 2000 分光光度计（Thermo Fisher，
USA）分析 RNA 质量、纯度，琼脂糖凝胶电泳检
测完整性。按照 M-MLV Reverse Transcriptase kit
（Promega，USA）操作说明，逆转录合成 cDNA第
一链，−20 ℃保存备用。
2.2 5’RACE 和 RT-PCR 验证
根据原始 EST序列，设计 2条 5’-RACE引物：
DoOMT-R1 5’-GCCCATTTTTATTGGCGACAC-3’；
DoOMT-R2 5’-ATCCATTCCAGTTCAAACGAC G-3’，
按照 SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit
（Clotech，Japan）说明书，分别与 Nested Universal
Primer A（NUP）引物组合进行 2次巢式 5’-RACE。
2次 PCR反应体系均为 25 μL，包括 10×Advantage®
2 PCR 缓冲液 2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL，
DoOMT-R1或 DoOMT-R2（10 μmol /L）各 0.5 μL，
10×NUP 0.5 μL，5’-RACE ready cDNA（第 1次 PCR
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 8期 2014年 4月

·1145·
模板）或第 1次 PCR产物（第 2次 PCR模板）各
1.0 μL，50×Advatange® 2 Polymerase Mix（5 U/L）
0.5 μL，ddH2O 19.5 μL。PCR程序为：95 ℃、 3 min，
95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、1 min 32个循
环；72 ℃、7 min，4 ℃保温。PCR产物经 1.5%琼
脂糖凝胶电泳，TianGen胶回收试剂盒（TianGen，
中国）纯化目的条带，连接至 pMD18-T vector
（Takara，中国），转化大肠杆菌 Escherichia coli
JM109感受态细胞，随机挑选 3个克隆送上海生工
测序。所获 cDNA序列与原 EST拼接，设计跨开放
阅读框（open reading frame，ORF）引物 DoOMT-S1：
5’-CTCCCTATCTCGAAATGGACG-3’，DoOMT-
AS1 5’-CACACAGAACATAGCAATACAGCA-3’，
进行全长基因 RT-PCR验证。
2.3 序列分析
使用一系列网络在线工具进行 DoOMT 基因核
酸及编码蛋白的生物信息学序列分析。利用 NCBI
的 BLASTx（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）和
ORF Finder（http://www.ncbi.nlh.nih.gov/gorf/gorf.html）
分析 cDNA序列；用 ExPASy Proteomics Server 的
InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/iprscan/）
和 PROSITE SCAN（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/-
npsa_automat.pl?page＝ /NPSA/npsa_proscan.html）
分析 DoOMT 蛋白质的结构域和基元；Protparam
（http://web.expasy.org/protparam/）和 SOPMA（http://
npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）分析蛋白
质理化性质和二级结构；采用 SWISS-MODEL
（http://swissmodel.expasy.org/）进行蛋白质三维建模
分析；SignalP 4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/
SignalP/）和 TMpred（http://www.ch.embnet.org/soft-
ware/ TMPRED_form.html）预测蛋白质信号肽和跨
膜区域；PSORT（http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/f orm.-
html）进行蛋白质亚细胞定位分析。采用 DNASTAR
6.0进行氨基酸序列比对分析；借助MEGA 4.0构建
系统进化树。
2.4 实时定量 PCR 分析
分别用 2 μg根、茎、叶样品总 RNA反转录合
成 cDNA，DoEF1α 作为内参基因[14]，qPCR 分析
DoOMT 基因的组织表达模式。 qPCR 引物
DoOMT-S2 5’-CATTCATCAAGGAAGCAGGAGT-3’
和 DoOMT-AS2 5’-CCAAAGGGTGTTGTCAT AG-
CAT-3’的扩增产物长 215 bp。用 ABI PRISM 7500
实时荧光定量 PCR仪（Applied Biosystems，美国）
进行 qPCR。反应体系 25 μL包括 2×SYBR® Premix
Ex TaqTM Master Mix（Takara，中国）12.5 μL，正
反向引物（10 μmol/L）0.5 μL，ROX 0.5 μL，cDNA
2 μL，ddH2O 9 μL。每个反应重复 3次，包括不加
模板的对照，实验重复 3次。PCR程序为 95 ℃、
30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s，40个循环，反应
结束绘制熔解曲线。根据 ABI PRISM 7500 SDS软
件（Applied Biosystems，美国）生成的循环阈值
（cycle threshold，Ct），用 2−ΔΔCt方法[15]计算相对表
达量。
3 结果与分析
3.1 DoOMT 基因克隆和全长验证
经过 2次巢式 5’-RACE反应，扩增产生长度约
为 850 bp的目标条带（图 1），克隆、测序获得 807
bp的序列，拼接分析获得了一条 1 005 bp的 cDNA。
BLASTx分析表明其与GenBank中已注册的多种植
物咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因有很高的相似性
（52%～79%），因此将其定名为 DoOMT，提交
GenBank获得注册号 KF876839。DoOMT基因的开
放阅读框（open reading frame，ORF）长 720 bp，
5’-UTR长 68 bp，3’-UTR长 186 bp，具有真核生物
mRNA加尾信号“AATAA”以及 polyA尾巴，起始
密 码 子 附 近 碱 基 序 列 GAAATGG （ 即
A/GNNATGG）。使用 DoOMT-S1/AS1引物，RT-PCR
扩增产生单一条带（图 1），克隆、测序获得 814 bp
的序列包含完整 ORF，与拼接序列一致，进而验证
已成功获得 DoOMT基因全长。

1-5’-RACE产物 2-全长基因 M-Marker
1-5’-RACE product 2-Full length gene M-Marker
图 1 铁皮石斛 DoOMT 基因全长 cDNA 克隆
Fig. 1 Cloning of full length cDNA of DoOMT gene
in D. officinale
2 M M 1

2 000 bp

1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 8期 2014年 4月

·1146·
3.2 DoOMT 基因的编码蛋白理化特性分析
Protparam预测 DoOMT基因编码蛋白分子式
C1223H1966N314O362S7，等电点 5.03，相对分子质量
为 2.708×104，介于植物 CCoAOMTs相对分子质
量 2.6×104～2.9×104 [2]；DoOMT蛋白带负电残
基（Asp＋Glu）为 39，带正电残基（Arg＋Lys）
为 28。该蛋白不稳定系数为 40.48，脂肪系数为
113.01，亲水性系数为 −0.020。 SOPMA 分析
DoOMT蛋白的二级结构主要由 α螺旋（44.77%），
少量 β转角（7.95%），延伸链（17.99%）和随机
卷曲（29.29%）。
3.3 DoOMT 蛋白结构域、定位和跨膜区分析
InterProScan分析显示（图 2），DoOMT基因编码
蛋白含有保守的氧甲基转移酶家族 3 结构域（13～
238）和甲基转移酶结构域（31～238）。DoOMT蛋白
包括5个酪蛋白激酶 II磷酸化位点（7～10、100～103、
144～147、160～163、219～222）和 3个N-豆蔻酰化
化位点（79～84、175～180、231～236），这些基元
可能对蛋白结构和功能有重要作用。SignalP 4.0分析

图 2 InterProScan 分析 DoOMT 蛋白的保守结构域
Fig. 2 InterProScan analysis of conserved domains
of deduced DoOMT protein
DoOMT 蛋白不含信号肽，TMpred 分析蛋白具有 1
个跨膜区（76～93）。PSORT预测DoOMT蛋白定位
于细胞质可能性较高为 65%，定位在线粒体基质和叶
绿体内囊体膜的可能性均为 10%。
3.4 DoOMT 与植物 CCoAOMT 蛋白的氨基酸序
列比对分析
运用 DNAStar 6.0 中的 MegAlign 程序，对
DoOMT基因编码蛋白与 7种植物的 CCoAOMTs蛋
白进行多序列比对分析（图 3）。结果表明，DoOMT
与香草Vanilla planifolia VpOMT4蛋白（ADZ76153）


A、B和 C为植物甲基转移酶普遍存在的保守元件, D、E、F、G和 H为 CCoAOMTs特有的标签序列
A, B, and C are conserved elements in plant methyltransferase, D, E, F, G, and H are signatures of CCoAOMTs
图 3 DoOMT 与植物 CCoAOMTs 蛋白的多序列比对
Fig. 3 Multiple sequence alignment of DoOMT and CCoAOMTs proteins from other plants

IPR002935 氧甲基转移酶家族 3
PTHR10509
PF01596

1
1
1
1
1
1
1
1

45
40
40
58
31
32
44
35


100
95
95
113
86
89
101
92

157
152
152
170
143
145
158
149

214
209
227
199
202
215
206


氧甲基转移酶相关
甲基转移酶_3

紫花苜蓿 AAC28973
烟草 AAC49915
葡萄 Q43237
水稻 NP_001056910
拟南芥 NP_567739
毛白杨 AFZ78549
香草 ADZ76153
铁皮石斛 KF876839
紫花苜蓿 AAC28973
烟草 AAC49915
葡萄 Q43237
水稻 NP_001056910
拟南芥 NP_567739
毛白杨 AFZ78549
香草 ADZ76153
铁皮石斛 KF876839

紫花苜蓿 AAC28973
烟草 AAC49915
葡萄 Q43237
水稻 NP_001056910
拟南芥 NP_567739
毛白杨 AFZ78549
香草 ADZ76153
铁皮石斛 KF876839
紫花苜蓿 AAC28973
烟草 AAC49915
葡萄 Q43237
水稻 NP_001056910
拟南芥 NP_567739
毛白杨 AFZ78549
香草 ADZ76153
铁皮石斛 KF876839

紫花苜蓿 AAC28973
烟草 AAC49915
葡萄 Q43237
水稻 NP_001056910
拟南芥 NP_567739
毛白杨 AFZ78549
香草 ADZ76153
铁皮石斛 KF876839

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 8期 2014年 4月

·1147·
的一致性最高为78.7%，与毛白杨Populus tomentosa
（ AFZ78549 ）、 拟 南 芥 Arabidopsis thaliana
（NP_567739）、水稻 Oryza sativa（NP_001056910）、
烟草 Nicotiana tabacum（AAC49915）、紫花苜蓿
Medicago sativa（AAC28973）和葡萄 Vitis vinifera
（Q43237）等植物 CCoAOMTs蛋白的一致性分别为
53.6%、53%、51%、49.8%、49.8%和 49.4%。DoOMT
蛋白包含植物甲基转移酶普遍存在的 A、B、C 保
守基序以及 CCoAOMTs特有的 5个保守基序（D、
E、F、G 和 H）。其中，除 B 基序与其他植物
CCoAOMTs差异较大，其余基序相对高度保守。
3.5 DoOMT 编码蛋白三维建模
在 SWISS-MODEL 依据保守结构域作图工具
中，以蛋白质数据库（Protein Data Bank，PDB）中
已提交的紫花苜蓿Medicago sativa咖啡酰辅酶A氧
甲基转移酶（PDB No.：1SUI）A链晶体分子[16]为
模板，对 DoOMT蛋白进行三维结构建模（图 4），
结果显示 DoOMT 与该蛋白有 52.19%的序列相似
性，空间结构类似。

图 4 基于 SWISS-MODEL 的 DoOMT 蛋白三维建模
Fig. 4 Three-dimensional structure of deduced
DoOMT protein using SWISS-MODEL
3.6 DoOMT 基因编码蛋白的系统进化树分析
为分析 DoOMT 基因编码蛋白的进化关系，从
GenBank数据库中选取来自细菌、藻类和高等植物
中具有代表性的 25个物种的 31条CCoAOMT蛋白
序列，利用MEGA 4.0构建 DoOMT蛋白的系统进
化树。图 5 结果表明，以吸水链霉菌 Streptomyces
hygroscopicus CCoAOMT 蛋白（AAF86386）为外
类群，所选 CCoAOMTs被聚成 1a、1b和 1c 3个分
支，DoOMT蛋白隶属于 1b分支，与单子叶植物香
草亲缘关系最近。
3.7 基因表达模式分析
分别提取石斛根、茎、叶等样品总 RNA，利用
qPCR技术检测 DoOMT的组织表达模式。图 6结果

图 5 DoOMT 与不同物种 CCoAOMT 蛋白的进化树分析
Fig. 5 Phylogenetic tree of DoOMT with CCoAOMTs
from other species

图 6 利用 qPCR 分析 DoOMT 基因的组织表达模式
Fig. 6 Tissue-specific expression pattern of DoOMT
gene using qPCR analysis
表明，DoOMT 在 3 种组织中为组成型表达，但相
对表达量存在差异。以叶为校正样本，DoOMT 在
茎中表达量最高，为叶中的 4.562 倍，根和叶中无
差异。
4 讨论
CCoAOMTs 通过参与木质素合成代谢调控植
物体生长发育、次生代谢、抗逆胁迫和抗病等多种
生命活动过程。CCoAOMTs基因系统性分析已在苜

相
对
表
达
量

5
4
3
2
1
0
1.00
0.804
4.562
叶 根 茎
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 8期 2014年 4月

·1148·
蓿[3]、拟南芥[4,17]、杨树和葡萄[18]中广为报道。在
烟草[5,10]、棉花[19]、水稻[20]和绿竹[21]等植物中也有
相关分析。药用植物中仅有香草[6,22]和龙眼[9]的研究
报道。植物 CCoAOMTs呈多基因家族，拟南芥、烟
草、棉花和水稻等已鉴定有 2、4、2和 3个成员，
香草中有 5个，其中 Vp-OMT4和 Vp-OMT5在细胞
苯丙烷类代谢中发挥重要作用 [6,22]。本研究利用
RACE 技术首次从珍稀濒危药用铁皮石斛分离到一
个 CCoAOMT 基因，起始密码子附近序列遵循
KOZAK 规则[23]；该基因编码蛋白具有氧甲基转移
酶家族 3、甲基转移酶的保守结构域。DoOMT与多
种植物 CCoAOMTs 蛋白序列相似性较高，含有
OMTs和CCoAOMTs特有的 8个保守基序，其中A、
B、元件可能并非底物的特异结合位点，而与甲基
供体 SAM 的结合有关，三者间距离的保守性可能
与结合 SAM“口袋”结构的形成有关[2]。DoOMT
蛋白三维结构和紫花苜蓿CCoAOMT A链晶体结构
类似[16]，与单子叶植物香草 Vp-OMT4 蛋白高度相
似，二者聚成的子分支隶属于植物 I型 OMTs系统
进化树的 1b分支。1a分支的 CCoAOMTs基因主要
参与木质素合成[3-4]；1b 分支中的冰叶日中花[24]、
葡萄[25]和香草[6]等植物CCoAOMTs基因被证实同时
参与木质素合成和类黄酮、花青素等次生代谢产物
的修饰，因此推测处于 1b分支中的 DoOMT基因可
能执行类似的功能。
基因表达分析是研究基因功能的重要前提。植
物 CCoAOMTs基因的组织表达模式存在较大差异。
不同植物或同一植物的不同器官，木质素合成关键
酶基因的表达部位和表达量都有差异。拟南芥
CCoAOMT 基因在幼苗的各个部位表达，但不能在
成 熟 植 株 的 成 熟 叶 脉 处 表 达 [4] 。 棉 花 的
GhCCoAOMT1和GhCCoAOMT2基因在根和茎中表
达量较高，在叶、子叶、花瓣、雄蕊和胚珠等部位
表达量较低[19]。龙眼 DLCCoAOMT基因根和茎中表
达量较高[9]。本研究 qPCR分析结果显示，DoOMT
基因为组成型表达，在石斛茎中表达量显著高于根
和叶中。铁皮石斛的药用部位是富含生物碱和多糖
等有效成份的直立茎，DoOMT 基因在石斛茎中的
高丰度表达特征，暗示其很可能主要调节茎中木质
素的合成代谢，以赋予植株一定的机械强度。高木
质素含量的植物能在工业上能高效转化为生物质能
源，但在造纸或饲料业等方面严重影响生产。农艺
性状优良的药用植物从基源上可为临床治疗提供高
质量的中药材。众多药用植物的类黄酮、酚或酸类
等活性成分是由苯丙烷类化合物衍生而来，抑制苯
丙烷类代谢途径中木质素合成关键酶基因可使代谢
产物流向酚或酸类化合物，已成为通过生物技术手
段培育优良品种的新策略。抑制肉桂酰辅酶 A还原
酶基因的丹参转基因株系，酚酸类物质的含量显著
提高[26]。本研究后续将利用 RNAi或过量表达技术
研究 DoOMT 基因在铁皮石斛次生代谢和生长发育
中的生物学功能，为通过遗传工程手段改良铁皮石
斛种质奠定基础。
参考文献
[1] Lam K C, Ibrahim R K, Behdad B, et al. Structure,
function and evolution of plant O-methyltransferases [J].
Genome, 2007, 50: 1001-1013.
[2] Joshi C P, Chiang V L. Conserved sequence motifs in plant
S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferases [J].
Plant Mol Biol, 1998, 37: 663-674.
[3] Guo D, Chen F, Inoue K, et al. Downregulation of caffeic
acid 3-O-methyltransferase and caffeoyl CoA 3-O-methyl-
transferase in transgenic alfalfa: impacts on lignin
structure and implications for the biosynthesis of G and S
lignin [J]. Plant Cell, 2001, 13(1): 73-88.
[4] Do C T, Pollet B, Thevenin J, et al. Both caffeoyl
Coenzyme A 3-O-methyltransferase 1 and caffeic acid
O-methyltransferase 1 are involved in redundant
functions for lignin, flavonoids and sinapoyl malate
biosynthesis in Arabidopsis [J]. Planta, 2007, 226:
1117-1129.
[5] 赵华燕 , 张景昱 , 刘惠荣 , 等 . 抑制 COMT 与
CCoAOMT 调控植物木质素的生物合成 [J]. 科学通
报, 2002, 47(8): 71-78.
[6] Widiez T, Hartman T G, Dudai N, et al. Functional
characterization of two new members of the caffeoyl CoA
O-methyltransferase-like gene family from Vanilla planifolia
reveals a new class of plastid-localized O-methyltransferases
[J]. Plant Mol Biol, 2011, 76(6): 475-488.
[7] Yoshimura K, Masuda A, Kuwano M, et al.
Programmed proteome response for drought
avoidance/tolerance in the root of a C3 xerophyte (wild
watermelon) under water deficits [J]. Plant Cell Physiol,
2008, 49(2): 226-241.
[8] Kim J K, Bamba T, Harada K, et al. Time-course metabolic
profiling in Arabidopsis thaliana cell cultures after salt
stress treatment [J]. J Exp Bot, 2007, 58(3): 415-424.
[9] 陈 虎, 何新华, 罗 聪, 等. 龙眼咖啡酰辅酶 A-O-甲
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 8期 2014年 4月

·1149·
基转移酶 (DLCCoAOMT) 基因的克隆和表达分析
[J]. 中国农业科学, 2012, 45(1): 118-126.
[10] Miao L, Shou S, Zhu Z, et al. Isolation of a novel tomato
caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase gene following
infection with the bacterium Ralstonia solanacearum [J].
J Phytopathol, 2008, 156(10): 588-596.
[11] 曾淑华, 文国松, 徐绍忠, 等. 铁皮石斛磷酸烯醇式丙
酮酸羧化酶基因的克隆及表达分析 [J]. 中草药, 2012,
43(4): 766-771.
[12] 陈晓梅, 王春兰, 杨俊山, 等. 铁皮石斛化学成分及其
分析的研究进展 [J]. 中国药学杂志 , 2013, 48(19):
1634-1640.
[13] 李 标, 唐 坤, 张 岗, 等. 菌根真菌诱导的铁皮石
斛根差减 cDNA 文库构建 [J]. 中国药学杂志, 2012,
47(22): 1790-1795.
[14] 张 岗, 赵明明, 宋 超, 等. 铁皮石斛促分裂原活化
蛋白激酶基因 DoMPK1 的克隆及特征分析 [J]. 药学
学报, 2012, 47(12): 1703-1709.
[15] Pfaffl M W. A new mathematical model for relative
quantification in real-time RT-PCR [J]. Nucl Acids Res,
2001, 29(9): e45.
[16] Ferrer J, Zubieta C, Dixon R A, et al. Crystal structures of
alfalfa caffeoyl coenzyme A 3-O-methyltransferase [J].
Plant Physiol, 2005, 137: 1009-1017.
[17] Raes J, Rohde A, Christensen J H, et al. Genome-wide
characterization of the lignification toolbox in
Arabidopsis [J]. Plant Physiol, 2003, 133: 1051-1071.
[18] Barakat A, Choi A, Yassin N B M, et al. Comparative
genomics and evolutionary analyses of the
O-methyltransferase gene family in Populus [J]. Gene,
2011, 479: 37-46.
[19] 吕 萌 , 倪志勇 , 王 娟 , 等 . 棉花甲基化酶基因
COMT 和 CCoAOMT 的组织特异性表达分析 [J]. 核
农学报, 2010, 24(4): 713-719.
[20] 赵华燕, 沈庆喜, 吕世友, 等. 水稻咖啡酰辅酶 A-O-甲
基转移酶基因 (CCoAOMT) 表达特性分析 [J]. 科学
通报, 2004, 49(14): 1390-1394.
[21] 李雪平, 高志民, 彭镇华, 等. 绿竹咖啡酰辅酶 A-O-甲
基转移酶基因的克隆与分析 [J]. 分子植物育种, 2008,
6(3): 587-592.
[22] Li H M, Rotter D, Hartman T G, et al. Evolution of novel
O-methyltransferases from the Vanilla planifolia caffeic
acid O-methyltransferase [J]. Plant Mol Biol, 2006, 61:
537-552.
[23] Kozak M. An analysis of 50-noncoding sequences from
699 vertebrate messenger RNAs [J]. Nucl Acids Res,
1987, 15(20): 8125-8132.
[24] Ibdah M, Zhang X H, Schmidt J, et al. A novel
Mg2+-dependent O-methyltransferase in the phenylpro-
panoid metabolism of Mesembryanthemum crystallinum
[J]. J Biol Chem, 2003, 278: 43961-43972.
[25] Lucker J, Martens S, Lund S T. Characterization of a Vitis
vinifera cv. Cabernet Sauvignon 3′, 5′-O-methyl- transferase
showing strong preference for anthocyanins and
glycosylated flavonols [J]. Phytochemistry, 2010, 71:
1474-1484.
[26] Wang Z J, Cui L J, Chen C, et al. Downregulation of
cinnamoyl CoA reductase affects lignin and phenolic
acids biosynthesis in Salvia miltiorrhiza Bunge [J]. Plant
Mol Biol Rep, 2012, 30(5): 1229-1236.