全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 3 期 2015 年 2 月

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白及中 1 个新颖含氯甾体化合物
仰 莲 1，彭 成 1，杨雨婷 1，王亚男 2，郭 力 1，戴 鸥 1*
1. 成都中医药大学药学院 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137
2. 中国医学科学院 北京协和医学院 药物研究所 天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京 100050
摘 要：目的 研究白及 Bletilla striata 的低极性化学成分。方法 采用硅胶、Sephadex LH-20 柱色谱和制备薄层色谱等分
离纯化方法，结合高分辨质谱和核磁共振波谱分析鉴定化合物的结构；运用 MTT 法测定化合物的生物活性。结果 在白及
化学成分研究过程中分离得到 1 个新的含氯甾体化合物，其结构为 4-氯-β-谷甾酮（1）；细胞毒活性实验表明，该化合物对
正常的 293A 人胚肾细胞具有一定的毒性。结论 该新化合物为人工产物，为白及甾体化合物在三氯甲烷中经过长时间的强
阳光照射后产生，反应机制推测为强光诱导下的自由基取代反应。
关键词：白及；甾体化合物；4-氯-β-谷甾酮；肾毒性；自由基取代反应
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)03 - 0325 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.03.003
A new chlorinated-steroid isolated during study on chemical constituents from
Bletilla striata
YANG Lian1, PENG Cheng1, YANG Yu-ting1, WANG Ya-nan2, GUO Li1, DAI Ou1
1. State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources,
College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China
2. State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy
of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
Abstract: Objective To study the low polar chemical constituents from the tubers of Bletilla striata. Methods Silica gel, Sephadex
LH-20 column chromatography, and preparative thin layer chromatography were used for the isolation and purification, the chemical
structure was identified by the methods of high resolution mass spectrometry (HRMS) and NMR spectroscopic analyses, and the
bioactivity of the compound was examined by the method of MTT. Results A new chlorinated-steroid was obtained during the study
on the chemical constituents of B. striata, its structure is 4-chloro-β-sitosterone (1). In addition, the compound showed potential
toxicity to 293A cells of human. Conclusion Further analysis finds that the new compound may be an artifact which is produced by
exposing a steroid to strong sunlight in chloroform for a long time, and the reaction mechanism is speculated as the radical substitution
reactions induced by strong light.
Key words: Bletilla striata (Thunb.) Rchb. f.; steroids; 4-chloro-β-sitosterone; nephrotoxicity; radical substitution reactions

白及为兰科（Orchidaceae）珍稀植物白及 Bletilla
striata (Thunb.) Rchb. f. 的干燥根茎，又名苷根、白
根、白芨等。据文献报道，白及的化学成分主要为联
苄类[1-2]、菲类[3-4]、苹果酸异丁酯类[5]等。此外，白及
中还含有一定量的甾体类化合物[6]，如 β-谷甾醇[7]、
胡萝卜苷、bletilnoside A 和 bletilnoside B[8]，而本课题
组此前对白及的化学成分研究中发现了特殊的 C-31、
C-32 环菠萝蜜烷型三萜[9]，在已报道的甾体和三萜化
合物中，C-3 位均被氧化为羟基或羰基。本实验进一
步对白及醋酸乙酯部位的低极性成分进行研究，意外
发现 1 个新的氯代甾体人工产物：4-氯-β-谷甾酮，产
生原因可能为含有 α,β-不饱和酮结构的甾体化合物
长时间放置于三氯甲烷溶剂中，经强光照射诱导自
由基取代反应产生的[10]。本实验运用高分辨质谱和

收稿日期：2014-11-27
基金项目：国家科技支撑计划（2011BAI13B05）
作者简介：仰 莲，硕士研究生，主要从事天然药物化学研究。E-mail: yanglian080910@163.com
*通信作者 戴 鸥，硕士，讲师，从事中药药理药效研究。Tel: (028)61800045 E-mail: haiou0505@126.com
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核磁共振波谱鉴定出新化合物的结构，并对该化合
物的生物活性进行测定，发现其对正常的 293A 人
胚肾细胞具有一定的毒性。
1 仪器与材料
Bruker AVIIIHD-600 核磁共振波谱仪，Waters
Synapt G2 高分辨质谱仪。薄层色谱硅胶 GF254、柱
色谱硅胶（200～300 目），制备薄层预制板均为青
岛海洋化工厂生产。 Sephadex LH-20 为瑞典
Amershan Pharmacia 公司生产。酶标仪（Thermo
3001）为 Thermo Fisher Scientific 公司生产；超净台
[MCV-B161F (T)] 为日本 SANYO 公司生产；显微
镜（Primo Vert，AxioCam ERc 5s）为 ZEISS 公司
生产；CO2 培养箱（HH. CP-T）为上海齐欣科学仪
器有限公司生产。DMEM、RPMI 1640 培养基、胎
牛血清均为 Hyclone 公司生产；胰蛋白酶由美国
Gibco 公司生产；MTT 为美国 Amresco 公司生产；
DMSO 为美国 Sigma 公司生产。所用其他试剂均为
分析纯。肺癌细胞 A549、黑素瘤细胞 A375、人肝
癌细胞 HEPG-2、人非小细胞肺癌细胞 H1975、人
胚肾细胞 293A 均来源于美国 ATCC 公司。
白及药材于 2012 年 8 月采自四川省内江市，经
成都中医药大学李敏教授鉴定为白及 Bletilla striata
(Thunb.) Rchb. f. 的块茎。
2 提取与分离
干燥的白及药材粗粉（3 kg），以 95%乙醇回流提
取 3 次（30 L×3），每次 2 h。乙醇提取液经减压浓缩
干燥得半固体流浸膏 510 g，将流浸膏混悬于水中，
以醋酸乙酯萃取，回收溶剂得醋酸乙酯部位 160 g。
醋酸乙酯部位以硅胶柱色谱进行分离，石油醚-丙酮
（0∶1→1∶0）进行梯度洗脱，洗脱液经薄层色谱法
检测，合并得 25 个洗脱部分 Fr. 1～25。Fr. 7 部分经
Sephadex LH-20 柱色谱分离，石油醚-三氯甲烷-甲醇
（5∶5∶1）为洗脱剂，共洗脱得到 4 个洗脱部分 Fr.
7-1～7-4。Fr. 7-4 部分再经过反复的硅胶柱色谱（石
油醚-醋酸乙酯 0∶1→1∶0）、Sephadex LH-20 柱色谱
（石油醚-三氯甲烷-甲醇 5∶5∶1）、制备薄层色谱（石
油醚-醋酸乙酯 15∶1）等进行分离，制备薄层板刮板
后以重蒸三氯甲烷溶剂洗脱，得到化合物 1（3 mg）。
在此分离纯化过程中，均使用了大量的三氯甲烷溶
剂，并在强阳光照射下进行过储存。
3 结构鉴定
化合物 1：淡黄色针状结晶（三氯甲烷），从质
谱图中可以明显看到 m/z 447 的准分子离子峰及其
m/z 449 的同位素峰，推测该化合物分子结构中可能
含有氯原子。进一步经高分辨质谱 HR-ESI-MS 表
明分子式为 C29H47OCl（m/z 447.339 7 [M＋H]+，计
算值为 C29H48OCl，447.339 4），不饱和度为 6。化
合物 1 的 1H-NMR 显示 2 个单峰甲基信号（δH 0.71,
1.23）、3 个双峰甲基信号（δH 0.81, J = 6.6 Hz；0.84,
J = 7.2 Hz；0.92, J = 6.6 Hz）、1 个三重峰甲基信号
（δH 0.85, J = 7.2 Hz）以及多个脂肪族亚甲基和次
甲基信号。化合物的 13C-NMR 显示 29 个碳信号，
其中 δC 191.1, 165.4 和 127.4 的 13C-NMR 信号表明
分子中可能存在 1 个 α,β-不饱和酮片段。综合以上
MS 和 NMR 信息，推测化合物 1 为 β-谷甾酮的类
似物[11]。仔细比较两者的 1H-NMR 信号，发现化
合物 1低场区未见 β-谷甾酮在 δ 5.72附近的特征性
烯氢单峰信号，而且在 13C-NMR 和 DEPT 谱中，
化合物 1 的双键均为季碳信号，表明化合物 1 的
C-4 位被取代。进一步结合 δC 127.4 的双键季碳化
学位移以及化合物的元素组成，推断化合物 1 为
4-氯-β-谷甾酮。
为确证化合物 1 的结构，进行了 2D NMR 测试。
根据 HSQC 谱推断氢与相邻碳原子之间的连接关
系。另外，在化合物的 HMBC 谱中，18-CH3 与 C-12、
C-13、C-14、C-17 相关；19-CH3 与 C-1、C-5、C-9、
C-10 相关；21-CH3 与 C-17、C-20、C-22 相关；26-CH3
和 27-CH3同时与C-24、C-25相关； 29-CH3与C-24、
C-28 相关；H-8 与 C-6、C-7、C-9、C-10、C-11、
C-13、C-14、C-15 相关；H-17 与 C-13、C-14、C-15、
C-16、C-18、C-20、C-21、C-22 相关。以上信号证
实化合物 1 具有谷甾烷骨架。此外，HMBC 谱中显
示 H-1 与 C-2、C-3、C-5、C-10、C-19 相关；H-2
与 C-1、C-3、C-4、C-10 相关；H-6 与 C-4、C-5、
C-7、C-8、C-10 相关（图 1），表明 α,β-不饱和酮片
段位于 C-3、C-4 和 C-5 位。综合以上 NMR 信息，
确定化合物 1 的结构为 4-氯-β-谷甾酮。具体核磁数
据见表 1。
O
Cl
18
29
19
21
26
27
11
28
15
25
22
1
810
13
24
9
17
4 5 O
Cl
图 1 化合物 1 的化学结构和主要的 HMBC 相关图
Fig. 1 Structure and key HMBC correlations of compound 1
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表 1 化合物 1 的 1H-NMR (600 MHz, CDCl3) 和 13C-NMR (150 MHz, CDCl3) 数据
Table 1 1H-NMR (600 MHz, CDCl3) and 13C-NMR (150 MHz, CDCl3) data of compound 1
碳位 δH δC 碳位 δH δC
1 1.98 (m), 1.70 (m) 34.6 16 1.84 (m), 1.24 (m) 28.4
2 2.53 (m), 1.32 (m) 34.3 17 1.08 (m) 56.2
3 — 191.1 18 0.71 (s) 12.1
4 — 127.4 19 1.23 (s) 17.9
5 — 165.4 20 1.33 (m) 36.3
6 3.22 (ddd, J = 15.0, 3.6, 2.4 Hz), 2.15 (dt, J = 15.0, 5.4 Hz) 29.3 21 0.92 (d, J = 6.6 Hz) 18.9
7 1.88 (m), 1.02 (m) 31.4 22 1.01 (m) 34.1
8 1.51 (m) 35.4 23 1.13 (m) 26.3
9 0.94 (m) 54.2 24 0.89 (m) 46.0
10 — 41.6 25 1.63 (m) 29.4
11 1.51 (m), 1.46 (m) 21.3 26 0.84 (d, J = 7.2 Hz) 19.1
12 2.01 (m), 1.14 (m) 39.8 27 0.81 (d, J = 6.6 Hz) 19.9
13 — 42.6 28 1.24 (m) 23.3
14 0.96 (m) 56.0 29 0.85 (t, J = 7.2 Hz) 12.2
15 1.59 (m), 1.09 (m) 24.3

4 细胞毒活性实验
分别取处于对数生长期、状态良好的 A549、
A375、HEPG-2、H1975 肿瘤细胞和 293A 人胚肾细
胞，制成单个细胞悬液，使细胞密度为 3×103个/mL，
接种于 96 孔板，每孔加入细胞悬液 100 μL，置于
37 ℃、5% CO2 培养箱内培养 24 h。然后将 1 mg
样品溶于 10 μL 的 DMSO 溶液中，以培养基稀释样
品，再以质量浓度为 50、25、12 μg/mL 每孔加药
100 μL，每个质量浓度设 3 个复孔。阴性对照组为
含有适量 DMSO 的培养基溶液，空白对照组为不含
细胞的培养基和溶媒。72 h 后，避光条件下每孔加
入 MTT 溶液（5 g/L）15 μL，继续温育培养 4 h 后，
弃掉上清，每孔加入 100 μL DMSO，置于摇床上慢
速振摇 10 min，使甲臜充分溶解后，用酶标仪测量
570 nm 波长处的吸光度（A）值，按下列公式计算
细胞增殖抑制率。
抑制率＝1－(A 给药－A 空白)/(A 阴性－A 空白)
结果表明，化合物 1 对 4 种肿瘤细胞 A549、
A375、HEPG-2、H1975 无明显抑制活性，但在 50、
25 和 12 μg/mL 质量浓度下，对正常人胚肾细胞
293A 具有抑制作用，抑制率分别为 50%、40%和
29%，表明该化合物具有一定的肾毒性。
5 讨论
在对中药化学成分进行研究时，从原药材到获
得具有固定化学性质和物理性质的化合物，期间经
历了各种物理和化学环境的变化，尤其在化学溶剂
和试剂的作用下，一些中药成分就不可避免发生变
化，产生人工产物。
正如本实验结果一样，新人工产物 4-氯-β-谷甾
酮的生成也有其必然的原因：（1）白及药材中含有
一定量的甾体类化合物，在三氯甲烷中溶解性很好。
（2）三氯甲烷不稳定，在长时间强阳光照射和氧气
存在下易被氧化分解为氯化氢和剧毒的光气
（COCl2）。（3）三氯甲烷经强光照射产生的自由基
与白及中的 α,β-不饱和甾酮化合物发生了自由基取
代反应[10]。由于本实验中使用了大量三氯甲烷，而
且在该溶剂中进行过长时间的强光下放置。因此，
可以初步确定该新化合物应为人工产物，其在白及
中的原始天然成分应为 β-谷甾酮。
本研究的发现表明：（1）在天然药物研究中要
注意溶剂的使用和样品的贮存，以避免样品被破坏。
尤其是在氯仿作为提取分离溶剂时，更应注意避光
等操作；（2）在天然成分提取分离过程中，应避免
高温、强光、强氧化等条件。（3）若样品因一些客
观原因发生了变化，也不能忽视变质后的人工产物。
因为可能在某些未知因素下，一些化合物因结构改
变而变得有价值或者产生毒性，进一步影响药材的
作用；（4）本实验还提示含氯的甾体化合物可能对
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正常的肾细胞有毒性，在甾体化合物的结构修饰时
应注意。
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