全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 1 期 2013 年 1 月

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白花丹参丙酮酸脱羧酶基因的克隆和表达分析
史仁玖，常正尧，王健美，王德才*
泰山医学院 医药生物技术研究所，山东 泰安 271000
摘 要：目的 获得白花丹参丙酮酸脱羧酶（SmPDC）全长基因，分析该基因在白花丹参不同组织部位，以及缺氧胁迫处
理后的该基因表达差异。方法 利用 cDNA 文库筛选获得 SmPDC 基因全长，利用半定量 RT-PCR，分析 SmPDC 基因在白
花丹参不同部位的表达情况，及缺氧处理条件下的表达情况。结果 获得的 SmPDC 基因由 2 190 个核苷酸组成，编码 605
个氨基酸，蛋白相对分子质量约 6.485×104，等电点 pI 5.49；半定量 RT-PCR 检测，该基因在丹参的根中表达量最高，其次
是茎和叶；缺氧胁迫处理会诱导该基因的表达，随胁迫时间延长表达量逐渐增加。结论 白花丹参 SmPDC 基因是 PDC 家
族新成员，其功能与植物耐缺氧代谢途径有关。
关键词：白花丹参；丙酮酸脱羧酶基因；克隆；RT-PCR；缺氧胁迫
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)01 - 0090 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.01.017
Cloning and expression analysis of pyruvate decarboxylase gene in Salvia miltiorrhiza
SHI Ren-jiu, CHANG Zheng-yao, WANG Jian-mei, WANG De-cai
Institute of Medicinal Biotechnology, Taishan Medical University, Tai’an 271000, China
Abstract: Objective To obtain the fulllength of Salvia miltiorrhiza pyruvate decarboxylase (SmPDC) gene, to analyze the
expression differences in various tissues of S. miltiorrhiza after anaerobic stress treatment. Methods The fulllength of SmPDC gene
was isolated through sequencing cDNA library, and semi-quantitative RT-PCR was used to detect the gene expression levels. Results
The fulllength of SmPDC cDNA has an open reading frame of 2 190 bp. The deduced amino acid sequence of SmPDC has 605 amino
acid residues which form a 6.485 × 104 polypeptide with a calculated pI of 5.49. Semi-quantitative RT-PCR indicated that SmPDC
gene was expressed at a high level in root, followed by stem and leaf of S. miltiorrhiza. Anaerobic stress could induce the expression of
SmPDC gene and the expression was increased with the stress time elongating. Conclusion SmPDC is a new member of the PDC
family and plays an important role in anaerobic respiration pathway.
Key words: Salvia miltiorrhiza Bunge. f. alba C. Y. Wu et H. W. Li; pyruvate decarboxylase gene; cloning; RT-PCR; anaerobic stress

白花丹参 Salvia miltiorrhiza Bunge. f. alba C. Y.
Wu et H. W. Li 是唇形科植物丹参的白花变型，主产
于山东，根入药。丹参有祛瘀止痛、活血通经、清
心除烦的功能，用于月经不调、经闭痛经、瘕积聚、
胸腹刺痛、热痹疼痛、疮疡肿痛、心烦不眠、肝脾
肿大、心绞痛等症[1]。白花丹参除具有丹参的作用和
用途外，对治疗血栓闭塞性脉管炎具有独特疗效[2-3]，
临床应用前景十分广阔。
丙酮酸脱羧酶（pyruvate decarboxylase，PDC）
是一种以焦磷酸硫胺素（thiamine pyrophosphate，
TPP）为辅酶的羧基裂解酶，在植物中广泛存在。作
为发酵途径中的关键酶，PDC 在胞质中结合 TPP 和
Mg2+组成全酶，催化糖酵解所产生的丙酮酸脱羧生
成乙醛[4]。PDC 驱动发酵代谢通路，通过与丙酮酸
脱氢酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）竞争代谢丙
酮酸参与植物体内的能量和物质代谢，响应缺氧、低
温、高盐、机械损伤、ABA 处理、病原菌侵染等多
种生物与非生物胁迫[4-9]，在根瘤组织发育、休眠芽
的释放、果实成熟、花粉发育与花粉管萌发等组织
发育过程中也起着重要作用[10-13]。目前已从水稻[14]、
玉米[15]、草莓[16]、葡萄[17]、拟南芥[5]、薏苡[18]等植
物中克隆出了编码 PDC 的 cDNA 序列，但尚未见白

收稿日期：2012-09-03
基金项目：山东省自然科学基金项目（ZR2010CM063）
作者简介：史仁玖，副教授，主要从事药用植物分子生物学研究。Tel: (0538)62236993 E-mail: shirenjiu@163.com
*通信作者 王德才 Tel: (0538)6236803 E-mail: dcwang@tsmc.edu.cn
网络出版时间：2012-12-18 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20121218.1016.006.html
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 1 期 2013 年 1 月

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花丹参 PDC（SmPDC）基因的相关报道。本研究从
已经建立起的白花丹参全长 cDNA 文库中获得 1 个
PDC 基因的全长 cDNA 序列，并对克隆的基因序列进
行了生物信息学分析，对其表达和功能进行了初步研
究，为进一步深入研究 PDC 基因参与白花丹参响应
逆境和次生代谢产物合成的信号调节功能奠定基础。
1 材料
白花丹参两年生根的全长 cDNA 文库由本实验
室构建、保存；白花丹参播种于蛭石和营养土 1∶1
比例的混合基质中，于 25 ℃，16 h 光照下培养。
cDNA 第 1 链合成试剂盒为 SuperScript VILO
cDNA Synthesis Kit（Invitrogen，11754-050），PCR
试剂购自 Takara（大连），其他生化试剂均为市售分
析纯。
2 方法
2.1 SmPDC 基因 cDNA 的克隆
用灭菌牙签随机从白花丹参 cDNA文库[19]挑取
阳性克隆至 1.5 mL 装有液体培养基的离心管中，形
成穿刺菌，由 TaKaRa 公司完成插入片段的测序。
将测序结果与 GenBank 中登录基因进行同源性比
较和功能预测分析，发现与 PDC 基因 cDNA 一致
性 85%的 cDNA，经进一步核酸和氨基酸序列
BLAST 比对，证实是丙酮酸脱羧酶基因，命名为
SmPDC 基因。
2.2 SmPDC 基因 cDNA 的生物信息学分析
生物信息学分析主要采用 DNAStar 软件包及
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast、http://www.ex-pasy.
org/tools/pi_tool.html、http://www.cbs.dtu. dk/-services/
TargetP 等链接的网上软件包进行。使用 DNAMAN
软件对序列进行多重比对，并用 MEGA 4.0 软件构
建进化树。
2.3 水淹胁迫处理
将生长 2 周的白花丹参幼苗放入 Hogland 营养
液中，水淹时间分别为 0、6、12、24、48、72、96 h。
上述处理完成后，根、茎、叶取样，冷冻保存于−70
℃以备提取 RNA。
2.4 SmPDC 基因的表达分析
采用改良的 CTAB 法[20]提取白花丹参第 1 对真
叶期植株的根、叶、茎总 RNA。用半定量 RT-PCR
检测 SmPDC 基因在不同组织以及在水淹处理后的
表达。按照 SuperScript VILO cDNA SynthesisKit
（invitrogen）进行 RT 反应，PCR 反应的引物是上游
引物 P1：5’-CCAACCAATCGACCCATA-3’，下游
引物 P2：5’-TTCCGCATCCAACCTTTA-3’；反应程
序是 94 ℃、4 min，26 个循环（94 ℃、30 s，57 ℃、
35 s，72 ℃、60 s），72 ℃、5 min。18 SrRNA 作
为半定量 RT-PCR 的内标基因，所使用的特异引
物是 18SF：5’-ATGATAACTCGACGGATCGC-3’，
18SR：5’-CTTGGATGTGGTAGCCGTTT-3’。产物
在 1.2%的琼脂糖凝胶上电泳分离检测。每个 PCR 3
个重复，电泳后使用伯乐凝胶成像系统（IMAGEQ
UAMT400）采集图像，然后利用伯乐凝胶成像系统
的 Quantity One 定量分析软件分析，3 次处理平均。
3 结果
3.1 SmPDC 序列的获得及序列分析
从白花丹参全长 cDNA 文库挑取阳性克隆，测
序，将测序结果与 GenBank 中登录基因进行同源性
比较和功能预测分析，获得2 190 bp的白花丹参PDC
全长序列，命名为 SmPDC，GenBank 登录号为
JF775376，BLAST 显示与百脉根 PDC 84%相似，蓖
麻PDC 84%相似，拟南芥PDC 82%相似，毛果杨PDC
84%相似，山杏 PDC 84%相似，马铃薯 PDC 85%相
似（图 1）。比对表明所获基因属于 PDC 家族。
通过 ORF Finder 寻找该基因的开放读码
（ORF），结果显示包含 1 个 1 818 bp 的 ORF，推
断其编码 605 个氨基酸。由 DNAMAN 软件推算该
编码蛋白的相对分子质量 6.485×104，等电点 pI
5.49。GenBank 工具预测显示这个蛋白质 N 端含有
一个 PDC 和吲哚丙酮酸脱羧酶上与嘧啶碱基结合
的保守区域（TPP_PYR_PDC_IPDC），C 端含一个
结合硫胺素焦磷酸的保守区域（TPP_PDC_IPDC），
进一步证明所获基因属于 PDC 家族（图 2）。
3.2 PDC 序列家族同源基因的氨基酸序列比较
作为一个普遍存在的代谢途径中的酶，PDC 具
有比较保守的结构域。用 DNAMAN 程序对百脉根
（AAO72533.1）、蓖麻（XP002530500.1）、拟南芥
（NP195033.1）、毛果杨（XP002322997.1）、山杏
（ABZ79223.1）和马铃薯（BAC23043.1）PDC 的氨
基酸序列进行多序列比对，结果表明（图 1），发现
SmPDC 与 PDC 家族具有很高的同源性。
在 MEGA 4 软件平台上对不同植物 PDC 氨基
酸序列进行分子系统进化分析（图 3），包括 SmPDC
（JF775376），忽地笑 Lycoris aurea (L’Herit.) Herb
PDC（LaPDC，ABJ99596.1），葡萄 Vitis vinifera L.
PDC（VvPDC，AAG22488.1），香石竹 Dianthus
caryophyllus L. PDC（DcPDC，AAP96920.1），
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LcPDC-百脉根 PDC RcPDC-蓖麻 PDC AtPDC-拟南芥 PDC PtPDC-毛果杨 PDC PaPDC-山杏 PDC StPDC-马铃薯. PDC SmPDC-白花丹参 PDC
LcPDC-Lotus corniculatus PDC RcPDC-Ricinus communis PDC AtPDC-Arabidopsis thaliana PDC PtPDC-Populus trichocarpa PDC
PaPDC-Prunus armeniaca PDC StPDC-Solanum tuberosum PDC SmPDC-Salvia miltiorrhiza PDC
图 1 7 种植物 PDC 基因氨基酸序列比对
Fig. 1 Comparison on amino acid sequence of PDC gene in seven plants
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SMPDC
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ATPDC
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RTPDC
PAPDC
RCPDC
STPDC
SMPDC
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72
71
71
73
58
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150
149
148
148
150
135
148

227
226
225
225
227
212
225

304
303
302
302
304
289
302

381
380
379
379
381
366
379

458
457
456
456
458
443
456

535
534
533
533
535
520
533

606
605
604
604
606
591
604
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中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 1 期 2013 年 1 月

• 93 •

图 2 白花丹参 PDC 推断氨基酸序列的特征性保守区域
Fig. 2 Characteristic conserved domain of amino acid sequence deduced by PDC of S. miltiorrhiza

图 3 15 个物种中的 PDC 同源基因的系统进化分析
Fig. 3 Phylogenetic tree analysis of PDC homologene
in 15 species
PaPDC）（ABZ79223.1），毛果杨 PDC（PtPDC，
XP002322997.1），RcPDC（AAO72533.1），AtPDC
（NP 195033.1），LcPDC（AAO72533.1），玉米 Zea
mays PDC（ZmPDC，NP 001105052.1），水稻 Oryza
sativa L. PDC（OsPDC，NP 001049811.1），大麦
Hordeum vulgare L. PDC（HvPDC，BAJ94428.1），
二 色 高 粱 Sorghum bicolor (L.) Moench PDC
（SbPDC，XP_002465414.1），StPDC（BAC23043.1），
烟草 Nicotiana tabacum L. PDC（NtPDC，P51846.1）。
发现 SmPDC 与 LaPDC 最为接近，与 VvPDC、
DcPDC、PaPDC、PtPDC 整体亲缘关系比较接近，
先聚为一簇，与其他植物 PDC 也有较高的相似度，
与多序列比对的结果相吻合。可见 PDC 在进化过程
中相对保守。
3.3 SmPDC 在丹参植株不同部位中的表达以及对
环境胁迫的响应
采用半定量RT-PCR方法分析 SmPDC基因在白
花丹参不同组织的表达和对水淹环境胁迫的响应情
况。结果表明，SmPDC 在白花丹参幼苗根、茎和叶
组织中均有转录水平的表达（图 4），但是在根部表
达最强。显示 SmPDC 在转录水平具有组织特异性。
图 4 SmPDC 在白花丹参不同组织中的表达情况
Fig. 4 Expression of SmPDC in different tissues
of S. miltiorrhiza
实验表明水淹处理参与 SmPDC 基因表达的调
控。在 Hogland 营养液中培养不同时间，半定量
RT-PCR 的方法检测结果表明，根中 SmPDC 受水淹
缺氧的诱导，随胁迫时间的延长，基因的表达量显
著增加，72 h 的表达量是对照的 4 倍多，继续胁迫
处理，由于长时间胁迫造成的代谢紊乱导致基因表
达减少（图 5）。

图 5 SmPDC 在白花丹参根不同缺氧胁迫时间下的表达
Fig. 5 Expression of SmPDC in roots of S. miltiorrhiza
for different time of anaerobic stress treatment
1 100 200 300 400 500 605
TPP 结合位点
PYR/FR 结合面
二聚体结合面
TPP_PYR_PDC_IPDC_类似区
TPP_酶_PYR 超家族 TPP_酶_M 超家族
TPP 结合位点
二聚体结合面
TPP_PDCIPDC
TPP_酶超家族
LaPDC
SmPDC
VvPDC
DcPDC
PaPDC
PtPDC
RcPDC
AtPDC
LcPDC
ZmPDC
OsPDC
HvPDC
SbPDC
StPDC
NtPDC
0.2
49
24
48
77
100
100
65
51
55
100
99
55

1.0
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0.6
0.4
0.2
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叶片 根 茎
SmPDC
18 S rRNA
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Sm
PD
C
/1
8S
R
N
A

0 6 12 24 48 72 96
t / h
SmPDC
18 S rRNA
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 1 期 2013 年 1 月

• 94 •
4 讨论
PDC 催化乙醇发酵的第一步反应，是这一途径
的关键酶。对植物乙醇发酵的研究主要关注其在缺
氧反应中的作用，着眼于提高植株的耐淹水性。本
研究首次从白花丹参中克隆了一条与耐缺氧调节相
关的基因，并利用生物信息学的方法对其核酸及其
推测的蛋白序列组成进行分析。结果表明，该基因
与其他物种中的 PDC 基因有较高的相似性，命名为
SmPDC，并获得含有完整 ORF 的基因全长，推测其
蛋白质序列与结构域与其他植物的 PDC 基因有很高
的同源性，它包括一个 PDC 和吲哚丙酮酸脱羧酶上
与嘧啶碱基结合的保守区域，C 端含有一个结合硫胺
素焦磷酸的保守区域，这些序列在所有的家族成员
中都是保守的，参与丙酮酸脱羧反应。
研究发现 SmPDC 的表达显著受到水淹缺氧的
诱导，PDC 在水稻[21]、玉米[22]、烟草[23]和草莓[24]
中受到缺氧胁迫时表达量显著增加，以适应缺氧环
境，提供能量维持生理代谢。Tadege 等[25]将从酵母
菌中分离的 PDC 基因转入番茄，在水淹胁迫处理下
PDC 过表达，明显提高了耐缺氧能力。证明 PDC
在耐缺氧代谢中的作用。
SmPDC 的表达对缺氧胁迫响应表明对丙酮酸
脱羧反应的调控可能是植物胁迫响应和耐受的一个
方面。缺氧是怎样诱导丙酮酸脱羧酶反应和信号转
导的以及存在什么样的调控等机制值得深入探讨，
为进一步培育白花丹参耐缺氧新品种奠定分子生物
学基础。
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