全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 20 期 2015 年 10 月

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黄芪饮片 miRNA 谱及热力学的稳定性研究
沈朝斌，蔡 红，郁 兰
上海中医药大学附属上海市中西医结合医院，上海 200082
摘 要：目的 为更好了解药用黄芪微小 RNA（miRNA）被机体摄入和吸收的情况，试图建立黄芪 miRNA 谱，为今后黄
芪饮片药理学研究奠定基础。方法 以经干燥、高温和微波处理的黄芪煎煮液为样本，采用高通量深度测序方法以获取未知
的 miRNA 序列。结果 经测序得到药用黄芪 9 931 049 个小 RNA 读数。经与 miRBase 21 数据库所有植物种类潜在发卡型
结构比对，分析和构建了黄芪饮片煎煮液 miRNA 谱，并确定了 1 个保守的 miRNA 和 9 个新发现的 miRNA。经进一步生物
学信息分析，发现 12 种 I 类小干扰性 RNA（small interfering RNAs，siRNAs）序列，其 5’端对热力学不稳定，3’端种子区
域对热力学高度稳定。结论 首次揭示了经热力学处理后黄芪饮片的 miRNA 谱，I 类 siRNAs 是潜在的可利用的植物药的生
物化学分子，有助于今后中药在表观遗传学方面的深入研究。
关键词：微小 RNA；膜荚黄芪；高通量测序；小干扰性 RNA；热力学稳定性；中药
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)20 - 3079 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.20.020
miRNA library and thermodynamic stability of Astragali Radix decoction pieces
SHEN Chao-bin, CAI Hong, YU Lan
Affiliated Shanghai TCM-Integrated western Medicine Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai
200082, China
Abstract: Objective To establish a small RNA library of Astragalus membranaceus, in order to understand the intake and absorption
of miRNAs in human body, and to lay the foundation for pharmacological research of Astragali Radix decoction pieces (ARP).
Methods The decoction of A. membranaceus after desiccation, high temperature and microwave treatment was used as sample, and
using high-throughput sequencing technology, the unknown miRNA sequence was obtained. Results Totally 9 931 049 small RNA
sequences were identified from ARP by the high-throughput sequencing technology. After compared with all hairpin-forming
precursors in miRBase 21 database, the miRNA library of ARP decoction was established, and one conserved miRNA and 9 novel
miRNA sequences were confirmed. Twelve class I small interfering RNAs (siRNAs) were obtained by further bioinformatic analysis
and we found that the 5’ terminal was unstable while the 3’ terminal was stable thermodynamically. Conclusion The miRNAs
expression profiles of ARP is first revealed by thermodynamic treatment. Our study suggests that class I siRNA can be used as a
potential biochemistry components of phytomedicine, which might contribute to the epigenetic studies on Chinese materia medica.
Key words: miRNA; Astragalus membranaceus (Fisch) Bge.; high-throughput sequencing technology; small interfere RNA;
thermodynamic stability; Chinese materia medica

黄芪属被子植物门、双子叶植物纲、原始花被
亚纲、蔷薇目、豆科植物。我国使用的药用黄芪有蒙
古黄芪 Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var.
mongholicus (Bge.) Hsiao 或膜荚黄芪 Astragalus
membranaceus (Fisch.) Bge. 的干燥根。黄芪是临床
常用品种之一，《中国药典》2015 年版记载黄芪具
有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌等功效[1]。
膜荚黄芪主要含有的化学成分包括多糖、皂苷、黄
酮、氨基酸和微量元素等[2]。临床和实验室研究证实
黄芪具有显著的免疫调节功能和抗肿瘤等作用[3-7]。
虽然膜荚黄芪全基因组学尚未被解码，但其全转录
组和表达序列标志（expressed sequence tag，EST）
已完成检测[8]。742 721 个高质量序列读数中包括了
已知的 9 893 个独特序列。这将有利于今后黄芪的

收稿日期：2015-06-21
基金项目：上海市中医药发展办公室中西医结合重点专病基金资助项目（zxbz2012-003）
作者简介：沈朝斌（1961—），男，主任医师，教授，硕士生导师，研究方向为免疫学。Tel: (021)65415910 E-mail: sbsys1303@aliyun.com
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生物合成和生物化学改良研究，同时黄芪的代谢和
生物合成通路也被明确。
微小 RNA（microRNA、miRNA）是一类小的内
源性非编码 RNA。它们来源于 miRNA 初级转录产
物（primary transcripts miRNA，pri-miRNAs），具有
1 个发夹型结构[9]。在植物中，miRNA 是通过直接
裂解转录物调节靶基因[10-11]或抑制其转录水平[12]。
miRNA 对植物的生长发育和逆境胁迫（ stress
responses）起着重要的调节作用[13]。赵春丽等[14]也
研究了地黄栽培种85-8的miRNA对地黄生长发育、
逆境胁迫响应和代谢调控的影响。Wu 等[15]采用高
通量测序技术对新鲜人参的各部位确定了 miRNA
谱以及靶基因的预测。
自从首次发现植物拟南芥 miRNA 后，miRNA
的研究飞速发展[16]。到目前为止，已确定了 206 种
24 521 个 miRNA 基因，根据 miRNA 基因库
（miRBsse 21）资料显示，经计算机分析处理已明确
30 424 个成熟 miRNA 序列[17]。但目前尚未见对热
力学处理后中药饮片miRNA图谱研究的文献报道。
中药饮片是植物药原材料经干燥炮制加工后的
特殊药品，一般经中医师处方后煎煮饮用。本课题
组以黄芪饮片为实验材料，试图建立中药饮片经煎
煮后 miRNA 谱，为今后研究潜在的调节靶基因的
miRNA 奠定基础。
1 材料
黄芪饮片由养和堂中药饮片公司提供（批号
140924），10 g/袋，经上海中医药大学附属上海市
中西医结合医院药剂科主管药师王嵩鉴定为生黄
芪，基原植物为豆科黄芪属植物膜荚黄芪Astragalus
membranaceus (Fisch.) Bge.。黄芪产地为甘肃省陇
西县。
2 方法
2.1 黄芪煎煮液制备
参照文献方法[18]，用微波炉（功率 325 W）加
热 2 min，干燥灭菌，然后用灭菌注射用水 100 mL
浸泡 30 min。将黄芪浸泡溶液置微波炉加热（功率
525 W）6 min，移去黄芪，得到黄芪煎煮液，冷却
备用。
将冷却后的黄芪煎煮液置入超滤容器装置（产
品号 VFPPES122250，美国 Membrane Solutions LLC
公司，该装置滤膜孔径为 0.22 μm），收集滤液 1 mL
于无菌干燥试管。
收集滤液以 1∶9 体积加入 Trizol 试剂（美国
Invitrogen 公司），并立即用聚乙烯薄膜覆盖封口，
置−20 ℃保存待测。
2.2 小分子 RNA cDNA 文库构建和高通量测序
2.2.1 RNA 样本质量控制 使用 NanoDrop ND-
1000 设备纯化和确定黄芪煎煮液总 RNA 的量，并
建立样本质量控制报告。
2.2.2 文库构建和测序 将样本总 RNA 用于小
分子 RNA 文库构建。经纯化后的小分子 RNA 分
别经 5’和 3’接头连接后经 RT-PCR 扩增，形成小
分子 RNA 的 cDNA 文库，直接用于深度测序。长
度控制在 130～150 bp，相当于 15～30 核苷酸
（nucleotide，nt）小分子 RNA[19]。RNA 深度测序
使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 设备，由康成生物
技术有限公司完成。
2.3 序列的初步分析
采用美国 Agilent 公司 llumina HiSeq 2000 测序
仪测序得 15～30 nt 序列，通过去接头、去低质量、
去污染、统计序列长度分布等过程完成初级分析[20]。
将初级分析得到的序列进行分类注释，以获得样品
中包含的各组分及表达量信息。剩余的小分子 RNA
序列与 miRNA 数据库（miRBase 21）所有植物的
miRNA 序列进行比对，得到样品中已知 miRNA 的
量、首位点碱基分布及表达丰度等信息。
2.4 生物信息学分析
使 用 novoalign 10.1 软 件 （ Novocraft
Technologies Sdn Bhd）对已知所有的植物 miRNA
序列进行对比，确定 miRNA 特征。通过前体序列
分析，确定其茎环结构和成熟 miRNA 序列。后期
采用手工方法查找经热力学处理后的黄芪所含
miRNA，并与 miRNA 数据库（miRBase 21）标准
序列比对差异，建立经热力学处理后黄芪饮片的
miRNA 谱。
3 结果与分析
3.1 黄芪小分子 RNA 的基本描述
经 Agilent 2100 Bioanalyzer 对黄芪煎煮液样本
的 RNA 深度测序，获得初步描述性结果。黄芪煎
煮液深度测序后可得到 9 931 049 读数，这些读数代
表了 4 606 460 种类型的小分子 RNA 片段，其中成
熟 miRNA 序列为 24 994 条。序列长度分布和读
数见表 1。小分子 RNA 分布呈斜率直线分布，各
长度类型随核苷酸增长而减少。长度为 16～20 nt 读
数为 3 875 742，占总数的 48.12%，为主要部分。这
类小分子 RNA 经常被视为小干扰性 RNA（small
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表 1 黄芪小分子 RNA种类分析 (长度分布和读数)
Table 1 Category analysis on miRNA from A.
membranaceus (length distribution and reading)
去接头修剪后
读数长度/nt
全部读数
去接头修剪后
读数长度/nt
全部读数
16 497 115 24 206 146
17 484 864 25 164 923
18 446 749 26 115 767
19 436 296 27 88 301
20 394 291 28 60 094
21 371 321 29 41 130
22 326 557 30 25 141
23 267 047

interfere RNA，siRNA）。其中 16 nt 占 12.83%，17 nt
占 12.51%。而长度在 20～24 nt 占 40.39%。20～24
nt 长度的 RNA 往往被认为主要是 miRNA。本次研
究发现小分子 RNA 数量上高于可能的 miRNA。
24～30 nt 所占比例较低。
3.2 黄芪成熟 miRNA及前体分析
使用 Novoalign10.1 软件对黄芪煎煮液与已知
所有植物 miRNA 序列进行对比，仅得到 1 个豆科
MIR6300 保守序列。鉴于黄芪煎煮液是经历了干
燥、储存、加热和微波等热力学处理后的标本，本
实验采用了手工查找对比方法，研究发现有 510 种
前体 miRNA 序列，分别属于 23 个家族。根据文献
报道[21]设置读数阈值为 10，其中读数超过 10 的有
11 个序列（表 2）。对高丰度表达的 miRNA 继续进
行分析，研究表明其中存在 46 个保守或非保守或残
缺不全的 miRNA 序列，这些 miRNA 的长度在 15～
21 nt，大多短于 miRBase 21 同名序列。它们在大豆
表 2 前体miRNA主要种类 (读数＞10) 和读数
Table 2 Main categories and reading of miRNAs
precursors (reading > 10)
miRNA 前体种类 读数 miRNA 前体种类 读数
miR8175 25 miR2916 254
miR5054 11 miR894 16
miR5368 23 miR398 17
miR6300 35 miR1103 34
miR9728 11 miR398b 17
miR2592b 19

Glycine max Merr.、拟南芥 Arabidopsis thaliana
Heynh. 和水稻 Oryza sativa Watt. 等植物上均存在
进化上的保守性，以豆科类 miRNA 种类表达为最
多见（表 3）。其中高度保守并耐高温和微波等处理
的仅 1 个 miRNA（tcc-miR396d）。而新发现的非保
守并耐高温和微波等处理的 miRNA 有 9 个序列，
包括 miR166i、miR396 和 miR5077（表 4）。其中
miR396 家 族 序 列 包 含 了 7 个 相 同 序 列
（mdm-miR396e、mdm-miR396f、mdm-miR396g、
pab-miR396b 、 pab-miR396c 、 ptc-miR396f 、
ptc-miR396g-5p）。
3.3 黄芪煎煮液的 miRNA 根据种子区域分类的
表达
文献报道[22]，根据经热力学处理后核苷酸结构
特性与 siRNA 靶基因识别功能的相互作用，将
siRNA 分为 3 类，其中 I 类 siRNA 分子具有最强烈
的基因沉默效应，I 类 siRNA 的鉴别标准为 3’端 1～7
核苷肽位点（种子区域）上有 4～7 个 A 或 U [（A＋
U）≥57%]。结果显示，黄芪煎煮液有 5 个 miRNA
序列符合 I 类 siRNA 结构标准（表 3），分别为

表 3 黄芪miRNA谱及与miRBase 21数据库的对比
Table 3 Profile of miRNAs identified from A. membranaceus and comparison with miRBase 21 database
miRNA 名称 核苷酸序列 (5’→3’) nt miRBase 21 数据库核苷酸序列 (5’→3’) nt
ata-miR5168-5p GUUGUCGUCUGGUUCA 16 GGGUUGUUGUCUGGUUCAAGG 21
ath-miR401 AACUGGUGUCGACCG 15 CGAAACUGGUGUCGACCGACA 21
ath-miR5660 CAGGAGGUUAGUGCAAUG 18 CAGGUGGUUAGUGCAAUGGAA 21
ath-MIR8175 CCCCGGCAGCGGCGCC 16 GAUCCCCGGCAACGGCGCCA 21
bdi-miR5054 CCCCACGGUGGGCGCC 16 UCCCCACGGUCGGCGCCA 18
bdi-miR7735-3p CGCCGGUCGGAGCCAC 16 CCGGUCGGAGCCAAGAGACGCGGC 24
bdi-miR7777-5p.1 UGGGUAGAACUGCCUCU 17 CUUUGGUUGGGUAGAACUACC 21
cca-miR6117 CCGGGUUGAAGACAUU 16 GGUUAGGUUGAUCGGGUUGAAGAC 24
cme-miR166i UCUCGGACCAGGCUUCAUUCU 21 UCGGACCAGGCUUCAUUCUC 20
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续表 3
miRNA 名称 核苷酸序列 (5’→3’) nt miRBase 21 数据库核苷酸序列 (5’→3’) nt
cme-miR396e UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20 UUCCACGGCUUUCUUGAACUG 21
cpa-miR8155 CCUGGCUCUGAUACC 15 UAACCUGGCUCUGAUACCA 19
csi-miR3953 UUCUGUAAGCCGUCGA 16 UUGAGUUCUGCAAGCCGUCGA 21
gma-miR171a UCGUUGAGCCGUGCCA 16 UGAGCCGUGCCAAUAUCACGA 21
gma-miR171i-3p UUCGUUGAGCCGUGCC 16 UUGAGCCGUGCCAAUAUCACG 21
gma-miR4995 GGCAGUGGCUUGGUU 15 AGGCAGUGGCUUGGUUAAGGG 21
gma-miR5368 AGGGACAGUGUCAGGUAG 18 GGACAGUCUCAGGUAGACA 19
gma-miR5783 CGGAGACGACGGCGGGG 17 GACGACGACGGGGAGGACGCGC 22
gma-miR6300 UCGUUGUAGUAUAGUGGUAAG 21 GUCGUUGUAGUAUAGUGG 18
gma-miR862a CUUUGAAGGAAUUAGA 16 UGCUGGAUGUCUUUGAAGGAAU 21
gma-miR9728 ACCCGGAGAACUGAAACA 18 CGCAGAACUGAAACAAGUUGA 21
gma-miR9728 ACCCGGAGAACUGAAACA 18 CGCAGAACUGAAACAAGUUGA 21
hbr-miR6173 UAAACGAUGGAUACU 15 AGCCGUAAACGAUGGAUACU 20
lus-miR171i UUCGUUGAGCCGUGCC 16 UUGAGCCGUGCCAAUAUCACG 21
mdm-miR396f UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20 UUCCACGGCUUUCUUGAACUG 21
mdm-miR396g UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20 UUCCACGGCUUUCUUGAACUG 21
mtr-miR2603 GUCCCUGCCCUUUGUA 16 UUUGGUAUUGGUCCCUGCACUU 22
mtr-miR7696a-3p AUGAGAACUUGAAGGACC 18 UUGAAUUAUGAGAACUUGAAG 21
osa-miR5072 CCCCAGCGGAGUCGCC 16 CGAUUCCCCAGCGGAGUCGCCA 22
osa-miR5077 GUUCACGUCGGGUUCACCA 19 GUUCGCGUCGGGUUCACCA 19
osa-miR5083 CUACAAUUAUCUGACC 16 AGACUACAAUUAUCUGAUCA 20
osa-miR5800 CGGAACGGCUGCUUC 15 CCCGGCUAUCGGAACGGCUGC 21
pab-miR3711 GGCGCUAGAAGGAGGGC 17 UGGCGCUAGAAGGAGGGCCU 20
pab-miR396b UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20 UUCCACGGCUUUCUUGAACUU 21
pab-miR396c UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20 UUCCACGGCUUUCUUGAACUU 21
peu-miR2916 UUGGGGGCUCGAAGACGAUC 20 UGGGGACUCGAAGACGAUCAUAU 23
ppe-miR1511-3p CCUGGCUCUGAUACC 15 ACCUGGCUCUGAUACCAUAAC 21
ppt-miR894 UUCACGUCAGGUUCACC 17 CGUUUCACGUCGGGUUCACC 20
ptc-miR396f UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20 UUCCACGGCUUUCUUGAACUG 21
ptc-miR396g-5p UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20 UUCCACGGCUUUCUUGAACUU 21
rgl-miR5139 CCUGGCUCUGAUACC 15 AAACCUGGCUCUGAUACCA 19
smo-miR396 UUCCACGGCUUUCUUG 16 UUCCACGGCUUUCUUGAACC 20
tcc-miR160a GUUCUCCCUGGCUCCCUGA 19 UGCCUGGCUCCCUGAAUGCCA 21
tcc-miR396d UUCCACGGCUUUCUUGAACUU 21 UUCCACGGCUUUCUUGAACUU 21
vvi-miR160b GUUCUCCCUGGCUCCCUGA 19 UGCCUGGCUCCCUGAAUGCCAUC 23
zma-miR398b-5p CGGGGGACGGACUGGGAA 18 GGGGCGGACUGGGAACACAUG 21
miRNA 名称前缀缩写：ata-山羊草，ath-拟南芥，bdi-二穗短柄草，cca-刺菜蓟，cme-香瓜，cpa-番木瓜，csi-甜柳橙，gma-大豆，hbr-巴西橡胶
树，lus-胡麻，mdm-苹果，mtr-蒺藜状苜蓿，osa-水稻，pab-挪威云杉，peu-胡杨，ppe-桃花，ppt-苔藓，ptc-杨树，rgl-地黄，smo-江南卷柏，tcc-
可可树，vvi-葡萄，zma-玉米，下同
miRNA name prefix abbreviation: ata-Aegilops tauschii, ath-Arabidopsis thaliana, bdi-Brachypodium distachyon, cca-Cynara cardunculus,
cme-Cucumis melo, cpa-Carica papaya, csi-Citrus sinensis, gma-Glycine max, hbr-Hevea brasiliensis, lus-Linum usitatissimum, mdm-Malus domestica,
mtr-Medicago truncatula, osa-Oryza sativa, pab-Picea abies, peu-Populus euphratica, ppe-Prunus persica, ppt-Physcomitrella patens, ptc-Populus
trichocarpa, rgl-Rehmannia glutinosa, smo-Selaginella moellendorffii, tcc-Theobroma cacao, vvi-Vitis vinifera, zma-Zea mays, same as below
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表 4 黄芪中新发现的非保守的 miRNA 种类
Table 4 Novel non-conserved miRNAs identified from A.
membranaceus
miRNA 名称 核苷酸序列 (5’→3’) nt
cme-miR166i UCUCGGACCAGGCUUCAUUCU 21
cme-miR396e UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20
mdm-miR396f UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20
mdm-miR396g UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20
osa-miR5077 GUUCACGUCGGGUUCACCA 19
pab-miR396b UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20
pab-miR396c UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20
ptc-miR396f UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20
ptc-miR396g-5p UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20

miR5139、miR6173、miR396、miR8155 和 miR166i。
其中 miR396 家族序列包含了 8 个相同序列
（mdm-miR396e、mdm-miR396f、mdm-miR396g、
pab-miR396b 、 pab-miR396c 、 ptc-miR396f 、
ptc-miR396g-5p、 ttc-miR396d）。同时除了这类
miRNA 与保守和新的非保守 miRNA 序列有部分重
叠之外，均显示了经热力学处理后明显 miRNA 链
的断裂，以 5’端的断裂为主，但种子区域呈现了高
度稳定（表 5）。

表 5 经热力学处理的黄芪煎煮液 I类 siRNA序列与已知数
据库的比较
Table 5 Comparison on class I siRNA sequences from
extract of A. membranaceus after thermodynamic treatment
and known miRBase 21 database
miRNA 名称
miRBase 21 数据库序列与检测
所获得的序列比较 (5’→3’)
miRBase 21
cpa-miRNA8155
UAACCUGGCUCUGAUACCA
CCUGGCUCUGAUACC
miRBase 21
hbr-miR6173
AGCCGUAAACGAUGGAUACU
UAAACGAUGGAUACU
miRBase 21
rgl-miR5139
AAACCUGGCUCUGAUACCA
CCUGGCUCUGAUACC
miRBase 21
cme-miR166i
UCGGACCAGGCUUCAUUCUC
UCUCGGACCAGGCUUCAUUCU
miRBase 21 UUCCACGGCUUUCUUGAACUG
miR-396 家族 UUCCACGGCUUUCUUGAACU
方框内为种子区域
Boxes indicate seed region
4 讨论
黄芪是中医最常用的植物药之一，以往的研究
大多在其化学成分方面进行探索。黄芪的化学成分
包括皂苷、多糖和黄酮等物质[23]，但提纯的单一成
分在实验研究和临床治疗中均未很好显现其疗效。
即使在其他中药研究中，单一化学成分能证明其有
效作用部位的也很少，如青蒿素和三氧化二砷等，
而植物药的多靶点的治疗理论尚缺乏足够的依据。
绝大多数真核细胞都具有通过 20～24 nt RNA
实施基因转录沉默的保守机制，miRNA 是小分子
RNA 中的一类重要的内源性分子。随着非编码小分
子 RNA 在基因沉默中作用的明确和高通量测序技
术的发展，使得生物界纷纷将研究重点从 DNA 基
因组学转入表观遗传学。随着 miRNA 在人类各种
疾病研究的进展，已将大量的特异性 miRNA 作为
生物标记物，并期待 miRNA 可直接用于疾病治疗。
不同于农业部门对 miRNA 的研究，医学研究
的目的主要是针对人类疾病的防治。中药原材料经
加工、销售、储存、配制和煎煮等直至患者服用具
有相当复杂漫长的过程，与一般植物 miRNA 分析
研究目的和方法存在很大差异，植物 miRNA 分析
的主要目的是观察植物进化过程、便于增产改良以
及对抗逆境胁迫等，均采用新鲜植物的各个部位作
为观察研究对象。而中药饮片 miRNA 研究目的是
考虑在热力学作用下小分子 RNA 的稳定性。
中药主要包括植物药、动物药和矿物药等种类，
在临床绝大部分中医处方中使用药物仍以植物药为
主。从人体口服吸收药物角度考虑，除了化学成分
外并不能排除吸收植物小分子 RNA 的可能性，虽
然这可能涉及跨物种（cross-kingdom）遗传影响，
但也不是没有例外[24]。本研究的目的在于从实际使
用的植物药即中药煎煮后服用的状况中明确小分子
RNA 的存在，便于今后寻找可能的靶基因，以探索
黄芪的药理作用机制。
本研究首先检测到了黄芪经炮制、加热和微波
作用后仍存在丰富的长度不等的 15～30 nt 小分子
RNA。与其他中药 miRNA 研究不同[14-15]，本研究
使用的黄芪饮片煎煮液不是新鲜植物标本，是经炮
制、储存、加热和微波等处理加工的，尤其经热力
学和微波的物理处理，小分子 RNA 链的断裂应在
意料之中，因此 16～20 nt 所占比例最高。黄芪煎
煮液经高通量测序后呈现丰富的小分子 RNA 数量，
与其他研究无可比性，同时经文献检索也未发现国
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内外有同类实验研究。
黄芪煎煮液标本经高通量测序后，所得数据由
计算机软件进行生物信息学分析，仅得到豆科类
MIR6300 保守序列，经多家基因和生物信息技术公
司分析，均认为测序所得结果无法进行现有计算机
软件生物信息学分析，因而改为手工对比分析。从
510 种成熟 miRNA 序列中检索出 46 个高丰度表达
的 miRNA，这些 miRNA 在大豆、拟南芥和水稻等
植物上均存在进化上的保守性，以豆科类 miRNA
种类表达为最多见（表 1），符合黄芪植物种类品系
特征。其中能耐受高温、干燥和微波等物理条件的
仅 miR396 家族，呈高度保守。另发现新的非保守
的 miRNA 9 个（表 2），除了 miR166i 和 miR5077
外，均为 miRNA396 家族成员，大部分序列仅 1 个
核苷酸与 miRBase 21 数据库有差异。同时核苷酸长
度均在 19～21 nt。结果表明，在黄芪煎煮液中最能
耐受热力学条件的大部分为 miR396 家族成员。
siRNA 在 RNA 诱导静默复合物（RNA-induced
silencing complex，RISC）中的作用可能存在 2 种
结果：一种是导致 RNA 静默；另一种导致脱靶效
应[25]。热力学决定了小分子 RNA 介导的基因沉默
的干扰活性，其决定因素在于种子区域的保守性，
即 siRNA 的种子区域与 miRNA 经 Watson-Crick 碱
基配对的稳定性。可将 siRNA 分为 3 类：I 类 siRNA
有强大的基因沉默作用，它在 3’→5’ 1～7 个核苷酸
位置上有 4～7 个 A 或 U（腺嘌呤/尿嘧啶），也就是
在 7 个核苷酸位点上 A＋U 的比例≥57%，同时在
19 个核苷酸位点上为 G 或 C（鸟嘌呤/胞嘧啶）。III
类 siRNA 很少有基因沉默作用，它在 3’→5’ 1～7
个核苷酸位置上以 G 或 C 为主。II 类 siRNA 的基
因沉默作用介于 I 类和 III 类之间[22]。文献报道[26]，
经热力学处理的在 5’端不稳定的小分子 RNA 链十
分有利于进入并保留在 RISC 中。本实验研究发现，
有 12 个小分子 RNA 序列符合 I 类 siRNA（表 3）。
I 类 siRNA 在基因沉默机制中作用最强，其最有可
能成为具有药用价值的物质基础分子。
虽然本实验得到了以上探索性的结果，但未将
新鲜黄芪药材作为对照分析样本，因此在确定其物
种的表观遗传学特征和基因保守性方面有待进一步
研究。本实验使用微波加热技术的目的在于实验的
可重复性、可操作性和规范性，以模拟常规中药煎
制方法获取研究样本，探索真实的能进入人体的黄
芪小分子 RNA 的种类，为进一步探索黄芪在多种
疾病治疗中 miRNA 的功效和作用机制提供参考性
基础数据。
5 小结
利用基因高通量深度测序方法，首次明确黄
芪饮片煎煮液中含有大量小分子 RNA，并确定其
miRNA 谱。经干燥、炮制、加热和微波处理，仍
存在保守或非保守的 miRNA，同时存在 12 个 I
类 siRNA 分子，黄芪中 miR396 家族对热力学最
稳定。黄芪中小分子 RNA 的药用价值有待进一步
研究探索。
志谢：本实验得到上海交通大学附属第一人民
医院检验中心谢匡成老师理论方面的指导。
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