全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 8 期 2016 年 4 月

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• 药材与资源 •
红花 bZIP20 转录因子基因的克隆、表达分析及植物表达载体构建
官丽莉 1, 2，崔 琪 1，韩怡来 1，顾天瑶 1，武云云 1，胡人阁 1，杜林娜 1，李海燕 1, 2*，李校堃 2*
1. 吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118
2. 吉林农业大学 生物反应器与药物开发教育部工程研究中心，吉林 长春 130118
摘 要：目的 克隆红花花瓣中 bZIP20（Basic region/leucine zipper motif）基因，研究其在不同组织中的表达量并构建其植
物表达载体。方法 根据红花转录组测序结果挑选 bZIP 基因的设计引物，以红花花瓣总 RNA 为模板，采用 RT-PCR 法扩增
bZIP20 基因开放阅读框（ORF）片段，利用 RT-PCR 法分析在红花不同组织以及尖孢镰刀菌侵染后红花根部 bZIP20 基因的
表达量，同时构建植物表达载体 pBASTA-bZIP20。结果 bZIP20 基因 ORF 长 981 bp，编码 326 个氨基酸（GenBank 登录号
为 KT692605）。红花 bZIP20 与其他物种氨基酸具有一定的同源性，其与芝麻、野茶树的氨基酸序列相似性高达 85.41%和
83.99%。实时荧光定量 PCR 分析表明，bZIP20 基因在不同组织中的表达水平具有显著差异，在花中呈现高表达，而在其他
组织中低表达。接种尖孢镰刀菌的红花根部组织中 bZIP20 基因的表达显著上调。结论 成功地对 bZIP20 基因进行克隆及表
达分析，并构建植物表达载体 pBASTA-bZIP20。
关键词：红花；bZIP20 基因；表达分析；RT-PCR；植物表达载体
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)08 - 1369 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.08.021
Cloning and expression analysis of CtbZIP20 transcription factor gene from
Carthamus tinctorius and construction of plant expression vector
GUAN Li-li1, 2, CUI Qi1, HAN Yi-lai1, GU Tian-yao1, WU Yun-yun1, HU Ren-ge1, DU Lin-na1, LI Hai-yan1, 2, LI Xiao-kun2
1. College of Life Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
2. Bioreactor and Drug Development Reseach Center, Ministry of Education, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
Abstract: Objective To clone bZIP20 (basic region/leucine zipper motif) gene from Carthamus tinctorius, analyze the
expression level in different plant tissues, and construct the plant expression vector. Methods The bZIP20 gene was cloned by
RT-PCR techniques, and the protein characteristics were analyzed by bioinformatics, and phylogenetic tree was constructed. The
expression of bZIP20 gene in different tissues and the roots after inoculated by Fusarium oxysporum were analyzed using real
time-PCR, and the plant expression vector pBASTA-bZIP20 was constructed. Results The ORF sequence of bZIP20 gene was 981
bp, encoded a protein of 326 amino acids (GenBank: KT692605). Sequence alignment and phylogenetic tree analyses showed that
bZIP20 had 85.41% and 83.99% of consistency with bZIP of Sesamum indicum and Camellia assamica. Real-time PCR results
showed significant differences, the highest expression level of bZIP20 gene was detected in flower, and was highest in the bud
period, bZIP20 gene was significantly increased in root tissue inoculated with F. oxysporum. The plant expression vector
pBASTA-bZIP20 was obtained. Conclusion The bZIP20 gene of safflower is successfully cloned, and the expression is analyzed.
The plant expression vector pBASTA-bZIP20 is constructed.
Key words: Carthamus tinctorius L.; bZIP20 gene; expression analysis; RT-PCR; plant expression vector

收稿日期：2015-12-28
基金项目：国家高技术研究发展计划（“863”）项目（2011AA100606）；国家自然科学基金资助项目（31201237）；吉林农业大学大学生创新创
业项目（201410193045）；吉林省教育厅“十三五”科学技术研究项目重点项目（吉教科合字[2016]179 号）；吉林省科技厅中青年
领军人才及优秀创新团队项目（20111815）
作者简介：官丽莉（1982—），女，实验师，主要从事药用植物与生物技术研究。E-mail: guanll2004@163.com
*通信作者 李海燕（1971—），女，教授，博士生导师，研究方向为生物反应器。E-mail: hyli99@163.com
李校堃（1964—），男，教授，主要从事生物反应器研究。E-mail: xiaokunli@163.net
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 8 期 2016 年 4 月

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碱性亮氨酸拉链（basic region/leucine zipper
motif，bZIP）转录因子广泛存在于动植物和微生物
中，参与多种生物学过程，由 DNA 结合结构域和亮
氨酸拉链二聚体这 2 个基本结构域组成，是转录因
子中较大的基因家族，同时 bZIP 转录因子是真核生
物中广泛存在且结构十分保守的一类转录因子[1]，主
要功能是通过与特定的顺式作用元件的结合来调控
下游基因的表达[2]。拟南芥 bZIP 转录因子研究得比
较深入且成果显著，分别参与调控组织分化、细胞
生长、糖代谢、生物和非生物胁迫等多个生物过程。
小麦 TabZIP20 转录因子参与小麦对条锈菌的抗病过
程[3]，水稻中的 OsbZIP1 不仅受到 ABA 和 MeJA 等
激素诱导而且参与到稻瘟病菌的防御应答[4]。
红花 Carthamus tinctorius L. 是我国传统的中草
药，又叫草红花、金红花，为 1～2 年生菊科植物红
花的管状花，又是新型的油用植物和工业用植物，经
济价值高，具有较大的开发潜力，是我国各地有待开
发的经济作物。红花为常用中药，用量大，味辛、性
温、归心、肝经，具有活血化瘀、止痛的功能，用于
治疗经闭、痛经、跌打损伤、疮疡肿痛等症，并对冠
心病、心绞痛、血管栓塞性疾病、传染性肝炎也有一
定疗效[5-9]。根腐病是红花生产过程中的重大病害之
一，由尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum 引起，危害幼
苗、成株和花球，造成产量和品质下降，给菜农带来
一定的损失[10-11]。分子育种是培育新品种的重要途径
之一，利用现代分子生物学技术，挖掘与红花抗病、
抗逆以及红花黄色素合成相关的功能基因，将为分子
育种提供重要的目标基因。
本实验室从红花中克隆到 1 个编码 bZIP 蛋
白的基因，命名为 CtbZIP20，之前的转录组
（SRA047279.2）研究显示，红花中有 19 个 bZIP
类转录因子[12]，这些转录因子很可能参与红花生
长发育和次生代谢的调控过程。目前，bZIP 类转
录因子在拟南芥中研究较多，而在红花中只克隆
得到 CtbZIP20 基因。本研究从红花转录组中得
到了 1 条 bZIP 类转录因子的 unigene，在序列分
析的基础上，研究了 CtbZIP20 基因在不同组织
及尖孢镰刀菌侵染下的表达模式，同时构建植物
表达载体，以期为该基因功能鉴定和抗逆分子育
种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
红花样品采自吉林农业大学种植基地，发育至
苗期阶段后经由吉林农业大学胡全德教授鉴定
为药源植物红花 Carthamus tinctorius L.。红花根
腐病病原菌：尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum 由
吉林农业大学植物病理系高杰教授馈赠。
1.2 方法
1.2.1 实验设计与处理 组培红花苗栽培在
无菌石英砂中，培养温度为 28 ℃，相对湿度
为（70±10）%，每天光照时间为 14 h。待红
花幼苗长至 5～6 叶期时，随机选 30 株幼苗在
浓度为 1×106个/mL 的尖孢镰刀菌悬浮液中浸根
2 h，另选 30 株幼苗在无菌水中浸根相同时间。
试验共计 2 个处理，即对照（NI）和接种病原菌
处理（I）。接种病原菌之后，于 2 d 采红花根部[13]。
每次样品采集之后液氮冻干，保存于−20 ℃冰箱
中，样品采集完成后用于提取总 RNA。同时，取
红花的茎、叶、种子和花，不同花期的花瓣经液
氮速冻，−80 ℃保存，用于提取总 RNA。
1.2.2 RNA 提取和 cDNA 合成 取红花组织置于
液氮中研碎，总 RNA 提取方法按照 Trizol 试剂说
明书进行；并于−80 ℃保存备用。cDNA 合成根据
Biotek 公司反转录试剂盒操作进行，反转录产物分
离纯化后置于−20 ℃保存备用。
1.2.3 CtbZIP20 基因的克隆及序列分析 根据基
因编码区序列特异引物 bZIP20-F、bZIP20-R（表 1），
以红花花瓣 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。反应程
序为 94 ℃预变性 5 min；94 ℃、30 s，62 ℃、1 min、
72 ℃、90 s，35 个循环；72 ℃、10 min，4 ℃终
止反应。将目的条带切胶回收后克隆到 pEASY-T1
载体并进行测序，分析测序结果与所拼接得到的全
长序列的一致性。
表 1 扩增 CtbZIP20 基因及 qRT-PCR 所用的引物序列
Table 1 Primers used for amplification of CtbZIP20 genes
and qRT-PCR
引物用途 引物名称及序列 (5’→3’)
bZIP201-F：ATGACAGAGCTCAGTCCAAGCtbZIP20 基因全长
bZIP20-R：TCAATTTTCACGAGGACGTG
qbZIP20-F：GCGATAAGTCGAGGGACCAACtbZIP20 基因
qRT-PCR qbZIP20-R：CACGATTTTGAGCAAGCCG
60 S-F：CATCCATTATCCAACAATC 60 S 基因 qRT-PCR
60 S-R：AAGAGTAATCAGTCTCCA
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 8 期 2016 年 4 月

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1.2.4 CtbZIP20 基因的生物信息学分析 ORF
Finder 在线软件分析 CtbZIP20 基因相应的氨基酸
序列。将获得的 CtbZIP20 基因开放阅读框（ORF）
序列通过 BLAST 搜索 NCBI 的蛋白质和核苷酸数
据库，并通过 DNAMAN 软件翻译成氨基酸序列，
利用 DNAMAN 软件对来源于各种植物的 bZIP 相
关氨基酸序列进行同源比对。相对分子质量与理论
等电点（pI）预测采用 ExPASy 在线服务器的
Compute Pi/Mw 工具，二级结构预测使用 Dublin
大学的 Porter 服务器，三级结构预测使用
Swiss-Model 服务器，结构功能域分析采用 ExPASy
在线服务器 Prosite Scanprosite。利用 TMHMM
Server v. 2.0 在线软件进行跨膜区预测。利用
MEGA5.0 软件中的邻位相连（Neighbor-Joining，
NJ）法构建系统进化树等。
1.2.5 CtbZIP20 基因表达分析 取红花种子、花、茎、
叶、根，提取 RNA，并反转录为 cDNA 用于 real-time
PCR 分析。定量 PCR 反应体系为：SYBR Premix
Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL；上下游
引物（表 1）各 0.4 μL；ROX Reference Dye II
（50×）；DNA 模板 2 μL；ddH2O 6.8 μL。反应条
件：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 5 s，60 ℃退火
30 s，40 个循环。
1.2.6 CtbZIP20 基因植物表达载体的构建 以
多克隆位点上游带有 CaMV 35S 启动子的 pBasta
载体为骨架，在红花 CtbZIP20 基因两侧设计含
有 Xma I 和 EcoR I 酶切位点的引物，克隆到
pEASY-T1 simple 载体上，测序正确的基因片段
经双酶切后连接到 pBasta 表达载体上，通过质粒
酶切和菌液 PCR 鉴定，验证表达载体是否构建
成功。
2 结果与分析
2.1 CtbZIP20 基因 ORF 片段的克隆
根据 CtbZIP20 基因编码区序列特异引物
（bZIP201-F、bZIP201-R），以红花花瓣 cDNA 为
模板扩增出 1 条 981 bp 的条带（图 1）。经回收
纯化后，PCR 产物与 pEASY-T1 载体连接，通过
菌液 PCR 验证及双酶切验证后测序结果正确，
命名该基因为 CtbZIP20（GenBank 登录号为
KT692605）。
2.2 CtbZIP20 蛋白序列分析
将转录组序列通过电子克隆和序列拼接后得到
1 128 bp 的序列，经 ORF Finder 预测，该序列具有
完整的 ORF。利用 RT-PCR 引物进行扩增，获得预
期长度的产物，将该序列和拟南芥的数据库比对后，
由于其具有和拟南芥 AtbZIP20 最高的同源性，
故将其命名为 CtbZIP20。与拟南芥 bZIP 转录因
子中的 TGA 类相似度最高，其中和 AtTGA2（又
名 AtbZIP20，登录号：ABR46126.1）的相似性
达到 59%。CtbZIP20 基因序列具有长为 981 bp
的完整 ORF，共编码 326 个氨基酸，分子式
C1562H2526N482O500S11，总原子数为 5 081。相对分
子质量是 36 410.8；pI：8.65，带正电残基（Arg＋
Lys）为 40，带负电残基（Asp＋Glu）为 38。脂
肪系数为 79.72，亲水性系数为−0.571，表明
CtbZIP20 是 1 个水溶性蛋白。InterProScan 分析
表明 47～71 位氨基酸具有一个保守的 bZIP 结构
域，125～203 位氨基酸具有一个 DOG1 超级家
族保守结构域。

M-Marker 1～2-bZIP20 基因 RT-PCR 电泳
M-Marker 1—2-RT-PCR electrophoresis of bZIP20 gene
图 1 基因的克隆
Fig. 1 Cloning of safflower CtbZIP20 gene
利用 DNAMAN 和 MEGA 5.0 软件对 CtbZIP20
蛋白氨基酸序列与其他物种 bZIP 蛋白进行比对，结
果显示（图 2、3），红花 CtbZIP20 与芝麻 Sesamum
indicum Linn. （ XP-011075851.1 ）、 野 茶 树
（AGD98703.1）的氨基酸序列相似性高达 85.41%和
83.99%，表明它们具有极高的同源性。进一步的进
化 树 分 析 也 表 明 ， 红 花 CtbZIP20 与 芝 麻
（XP-011075851.1）、野茶树 Camellia assamica L.
（AGD98703.1）、大豆 Glycine max (Linn.) Merr.（NP
001237963.1）、可可 Theobroma cacao L.（ XP
00702814.3 ）等亲缘关系较近，但与拟南芥
（P43273.1）及大叶藻 Zostera marina（KMZ62646.1）
的亲缘关系较远。
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2 000 bp

1 000 bp
750 bp
500 bp
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A
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P
P
P
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R
R
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E
E
E
.
N
.

图 2 CtbZIP20 编码蛋白与其他物种 bZIP 的氨基酸序列比对
Fig. 2 Multiple alignment of CtbZIP20 and bZIP from other species

图3 CtbZIP20蛋白与其他11种植物bZIP蛋白的系统进化分析
Fig. 3 Phylogenetic analysis on bZIP20 in safflower with
other 11 plant bZIPs
2.3 CtbZIP20 基因的表达分析
利用RT-PCR技术检测CtbZIP20基因在不同组
织中的相对表达量。组织差异表达可为研究基因的
功能和调控机制提供依据，本实验选取红花的种子、
花、茎、叶和根 5 个组织对 CtbZIP20 基因进行了组
织差异表达分析。由图 4 可知，CtbZIP20 在不同组
织的表达水平具有显著差异，在花中呈现高表达，
而在其他组织中低表达。不同花期 CtbZIP20 基因的
表达水平随着花期的延长逐渐降低，花蕾期最高，
衰花期最低（图 5）。通过对 NI 组和 I 组的红花根
部组织提取 RNA 并进行荧光定量分析，结果表明
（图 6）与对照组相比，接种尖孢镰刀菌的红花根部
组织中 bZIP20 基因的表达显著上调。


图 4 CtbZIP20 基因的组织表达分析
Fig. 4 Tissue expression analysis on bZIP20 gene in safflower

图 5 CtbZIP20 基因在不同花期的表达分析
Fig. 5 Expression analysis on safflower bZIP20 gene in
different blossom periods
芝麻
红花
野茶树
Consensus

芝麻
红花
野茶树
Consensus

芝麻
红花
野茶树
Consensus

芝麻
红花
野茶树
Consensus

芝麻
红花
野茶树
Consensus
66
66
66
132
132
132
198
198
198
264
264
264
328
328
328
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sp r t d t s t d d t d k f q v s d sd k s r d q k t l r r l q n r e a a r k s r l r k k a y
大豆
苜蓿
野生大豆
川桑
苎麻
湖北海棠
可可
红花
芝麻
野茶树
大叶藻
拟南芥
0.02
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
相
对
表
达
量

根 茎 叶 种子 花
花蕾期 初花期 盛花期 衰花期
14
12
10
8
6
4
2
0
相
对
表
达
量

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 8 期 2016 年 4 月

• 1373 •

图 6 接种尖孢镰刀菌前后红花根部CtbZIP20 基因的表达模式
Fig. 6 Transcription pattern of bZIP20 in safflower root
pre- and post- incubation with F. oxysporum
2.4 CtbZIP20 基因植物表达载体的构建
将植物表达载体pBASTA和带有目的基因序列
的重组载体 pEASY-T-bZIP20 分别用 Xma I 和 EcoR
I 进行双酶切，将目的片段与酶切后的 pBASTA 载
体用 T4 DNA 连接酶连接后，获得植物表达载体
pBASTA-bZIP20。将构建好的植物表达载体转化大
肠杆菌 DH5α，对重组阳性质粒进行菌液 PCR 验证
（图 7）和双酶切验证（图 8），都获得预期大小为
981 bp 的目的片段，证明该植物表达载体构建正确。


M-Marker 1 and 2-pBASTA-bZIP20 PCR
图 7 植物表达载体 pBASTA-bZIP20 菌液 PCR 验证
Fig. 7 PCR verification of bacterium of pBASTA-bZIP20

M-Marker 1～4-pBASTA-bZIP20
图 8 植物表达载体 pBASTA-bZIP20 双酶切验证
Fig. 8 Enzyme digestion verification of pBASTA-bZIP20
3 讨论
红花在食品、药品领域起着重要作用，是我国
重要的油料和经济作物。红花病害的发生和流行一
直是影响红花黄色素及红花油产量的重要因素，特
别是根腐病、锈病等病害严重影响了红花的产量及
品质。因此，通过生物技术手段提高红花品种的抗
性，确保红花食品、药品的安全是十分必要的。本
课题组已经对红花中基因的克隆与表达进行了大量
研究[14-16]。
植物 bZIP 转录因子在植物的生命过程中具有
非常重要的作用，bZIP 不仅参与调控植物的生长发
育过程，还参与调控植物抵抗恶劣的自然环境，诸
如重金属胁迫、病原菌的入侵、高盐、干旱、寒冷
等不利条件[17-18]。大豆 GmbZIP44、GmbZIP62 和
GmbZIP78作为ABA信号途径中的负调控因子提高
转基因拟南芥的耐盐性及耐低温特性；大豆
GmbZIP132 受到干旱和高盐胁迫的诱导，过表达
GmbZIP132 的拟南芥表现出低 ABA 敏感性和高失
水率；过表达 GmbZIP1 提高拟南芥和烟草的抗旱
性、耐盐性及耐低温的特性；高表达野生大豆
GsbZIP33 的拟南芥对高盐胁迫的敏感性提高[19-22]。
蛋白质三级结构预测显示，CtbZIP20 蛋白具有高度
保守的由 α-螺旋和亮氨酸形成的 bZIP 结构域，与
报道的拟南芥 AtbZIP 蛋白的三级结构模型相似[18]。
本研究通过对 14 种植物与克隆得到的
CtbZIP20 氨基酸序列进行多重比对发现，红花与芝
麻、野茶树的氨基酸序列相似性高达 85.41%和
83.99%，表明它们具有极高的同源性。组织表达分
析结果表明，CtbZIP20 基因主要在红花花瓣中高表
达，而在其他组织中低表达，具有显著的组织表达
特异性，同时不同花期 CtbZIP20 基因的表达水平随
着花期的延长逐渐降低，花蕾期最高，衰花期最低，
这与刘秀明等[23]报道的 CHI 基因在不同花期表达
趋势相一致，说明 CtbZIP20 基因很可能参与红花主
要药效成分（红花黄色素、黄酮等）的合成；并且
接种尖孢镰刀菌的红花根部组织中 CtbZIP20 基因
的表达显著上调，初步说明 CtbZIP20 很可能参与红
花抗病性的调控；同时构建该基因的植物表达载体，
为进一步利用 CtbZIP20 提高红花的抗性研究奠定
基础，以推动红花转基因育种的进程。下一步实验
会进一步验证 CtbZIP20 基因在红花花瓣不同发育
时期的表达量与红花主要药效成分（红花黄色素或
黄酮等）之间的关系，以及将植物表达载体
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
相
对
表
达
量

NI I
1 2 M
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
981 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
981 bp
M 1 2 3 4
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 8 期 2016 年 4 月

• 1374 •
pBASTA-bZIP20 转化到红花中，进行 CtbZIP20 基
因的表达及功能验证，期望获得抗病抗逆能力增强
或提高红花黄酮类物质量的转基因植物；同时，亦
可构建原核表达载体，获得纯化的 CtbZIP20 蛋白用
于 EMSA 来鉴定 CtbZIP20 蛋白与元件的作用情况
及植物体内 CtbZIP20 蛋白表达水平的检测，为后期
进一步研究红花转录因子 CtbZIP20 的生物化学和
分子生物学功能奠定基础。
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