全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 16 期 2014 年 8 月

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• 药材与资源 •
滇龙胆 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因 GrDXR 的克隆、序列分析
与原核表达
张晓东 1，赵 静 1，李彩霞 1，李 涛 1，王元忠 2*
1. 玉溪师范学院资源与环境学院，云南 玉溪 653100
2. 云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650223
摘 要：目的 从滇龙胆 Gentiana rigescens 幼叶中克隆萜类合成关键酶 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因 GrDXR，
进行序列分析和原核表达。方法 根据滇龙胆转录组中 GrDXR 基因序列，设计引物，通过 RT-PCR 扩增得到 GrDXR 开放
阅读框（ORF）序列，并进行 TA 克隆、测序和序列分析；构建原核表达载体 pGEX-4T-1-GrDXR，转入大肠杆菌 Rosetta
（DE3）中，在 IPTG 诱导下进行表达。结果 GrDXR ORF 全长 1 425 bp，编码 474 个氨基酸。序列分析表明，GrDXR 基
因是 DXR 家族成员；蛋白质序列系统发育分析表明，GrDXR 与萝芙木 RvDXR、橡胶树 HbDXR 和长春花 CrDXR 亲缘关系
较近。构建 pGEX-4T-1-GrDXR 重组质粒，获得稳定的原核表达体系。SDS-PAGE 结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。
结论 克隆了 GrDXR 基因，建立其稳定的原核表达体系，为进一步纯化 GrDXR 蛋白，研究其结构和功能奠定基础。
关键词：滇龙胆；1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因；基因克隆；序列分析；原核表达
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)16 - 2378 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.16.019
Cloning, sequence analysis, and prokaryotic expression of 1-deoxy-D-xylulose-5-
phosphate reductoisomerase GrDXR gene in Gentiana rigescens
ZHANG Xiao-dong1, ZHAO Jing1, LI Cai-xia1, LI Tao1, WANG Yuan-zhong2
1. College of Resources and Environment, Yuxi Normal University, Yuxi 653100, China
2. Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650223, China
Abstract: Objective To clone the 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase gene GrDXR which is the key enzyme involving in the
terpenoid biosynthesis from young leaves of Gentiana rigescens, and to perform its sequence analysis and prokaryotic expression. Methods
According to the GrDXR gene sequence of G. rigescens transcriptome, a pair of primers were designed, and the ORF of cDNA sequence was
obtained by RT-PCR. Then TA cloning, sequencing, and sequence analysis were performed. Prokaryotic expression vector pGEX-4T-1-GrDXR
was constructed and transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3) for expression under the induction of IPTG. Results The ORF of GrDXR
had a length of 1 425 bp coding for 474 amino acids. Sequence analysis showed that GrDXR was the member of DXR family. Results of
phylogenic analysis showed that GrDXR was close to RvDXR, HbDXR, and CrDXR. The pGEX-4T-1-GrDXR recombinant plasmid was
constructed and the stable prokaryotic expression system was obtained. The SDS-PAGE results displayed that the expressed proteins were
consistent with the anticipated size. Conclusion The GrDXR gene is successfully cloned, and the stable prokaryotic expression system is
established. This study will provide a foundation for further purification, structural and functional research of GrDXR protein.
Key words: Gentiana rigescens Frach. ex Hemsl.; GrDXR; gene cloning; sequence analysis; prokaryotic expression

龙胆苦苷是滇龙胆 Gentiana rigescens Frach. ex
Hemsl.、龙胆 G. scabra Bge.、三花龙胆 G. triflora
Pall. 和条叶龙胆 G. manshurica Kitag. 等龙胆科植
物中的主要有效成分[1]。龙胆苦苷的生物合成主要
来源于甲羟戊酸（MVA）途径和 2-C-甲基-D-赤藓
糖醇-4-磷酸（MEP）途径。在 MEP 途径中，1-脱

收稿日期：2014-03-15
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81260608）；科技部“十二五”国家科技支撑计划项目（2011BAI13B02-04））；云南省教育厅科学研
究基金重点项目（2013Z075
作者简介：张晓东，男，博士，讲师，主要从事植物代谢基因工程方面的研究。Tel: 15925236961 E-mail: zxd95@126.com
*通信作者 王元忠，男，助理研究员，主要从事药用植物资源评价与利用的研究。Tel: 13888829994 E-mail: boletus@126.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 16 期 2014 年 8 月

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氧 -D-木酮糖 -5-磷酸还原异构酶（ DXR ， EC
1.1.1.267）是限速酶[2]，它能够催化 1-脱氧-D-木酮
糖 5-磷酸（DXP）异构化并还原生成 MEP，该反应
需要 Mg2+或 Mn2+的参与。目前，DXR 基因已从拟
南芥、水稻、玉米、番茄、橡胶树、喜树和银杏等
许多植物中分离[3]，而且橡胶树[4]、大豆[5]、节节麦、
拟南芥等植物中存在 2个或多个DXR基因。Rohdich
等[6]将拟南芥 AtDXR 基因在大肠杆菌中表达，结果
其纯化蛋白可催化 DXP 形成 MEP。DXR 基因的表
达受光、茉莉酸甲酯、机械损伤、真菌诱导子和植
物根共生菌等的调控[3,7-9]。在薄荷中过表达 DXR 基
因，能够使薄荷精油产量提高 50%[10]。在长春花
Catharanthus roseus (Linn.) G. Don 中，CrDXR 基因
表达量与单萜吲哚生物碱的累积呈正相关[11]。过表
达DXR基因刺激MEP途径衍生的类异戊二烯精油[9]
和转基因拟南芥中紫杉烯[12]的合成，而减少 DXR
基因表达则导致彩斑现象、色素减少和叶绿体发育
停滞。在烟草叶绿体中过表达 NtDXR 基因，导致叶
绿素 a、β-胡萝卜素、叶黄素、百合黄素、玉米黄
素和谷固醇等各种类异戊二烯萜类量增加[13]。在马
达加斯加长春花 Madagascar periwinkle Herb 中，异
恶草酮（clomazone）和膦胺霉素（fosmidomycin）
对 DXR 蛋白的表达影响却很小[14]。因此，植物 DXR
蛋白在萜类合成和代谢中起着重要作用。
滇龙胆为传统中药材龙胆的主要植物来源之
一[15]。目前，国内外对龙胆的研究主要集中在种子
萌发[16-17]、DNA 条码[18-19]、转录因子功能[20-21]、育
种等方面，而对滇龙胆 GrDXR 基因克隆和功能分
析尚未有报道。本研究根据滇龙胆转录组中 GrDXR
基因序列，设计特异性引物，通过 RT-PCR 技术成
功从滇龙胆幼叶中扩增到 GrDXR 基因，进行序列
分析和原核表达。结果表明 pGEX-4T-GrDXR 工程
菌在 37 ℃、终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG 诱导下成
功表达出目的蛋白。本研究为滇龙胆 GrDXR 蛋白
的功能研究及通过在龙胆中过表达 GrDXR 基因提
高龙胆苦苷量的研究奠定基础。
1 材料和试剂
1.1 材料
滇龙胆 Gentiana rigescens Frach. ex Hemsl.
植株栽培于玉溪师范学院资源环境学院分子生物
学实验室。实验材料为滇龙胆无菌苗的幼叶。大
肠杆菌 DH5α 和 Rosetta（DE3）菌种购买于北京
全氏金公司。
1.2 试剂
多糖植物组织提取试剂 RNAiso、反转录试剂
盒、TA 克隆试剂盒、限制性内切酶、IPTG、X-gal
等均购自于宝生物工程（大连）有限公司；质粒提
取试剂盒和胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术
有限公司；原核表达载体 pGEX-4T-1 由玉溪师范学
院分子生物学实验室保存；引物由上海捷瑞生物工
程有限公司合成；测序由生工生物工程（上海）股
份有限公司完成。
2 方法
2.1 叶片总 RNA 提取、GrDXR 全长 cDNA 的克隆
和测序
按照多糖植物组织提取试剂 RNAiso 说明书提
取滇龙胆幼叶的总 RNA；按照逆转录试剂盒说明书
合成 cDNA。根据原核表达载体 pGEX-4T-1 多克隆
酶切位点和转录组中滇龙胆 GrDXR 基因序列，设
计一对特异引物 GrDXR BamHI-F：GGATCCATGG-
CTTTGAATTTGCTCTCC，GrDXR XhoI-R：CTCG-
AGTCACACTAAAGCAGGGCTCT。以 cDNA 为模
板进行 PCR 扩增，反应条件：94 ℃、3 min；94 ℃
30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30 个循环；72 ℃
延伸 7 min。GrDXR 基因 PCR 产物经 1.0%琼脂糖
凝胶电泳分离，割胶后，使用胶回收试剂盒按照
说明书对目的片段进行回收，将其连接到
pMD19-T 载体上，转化大肠杆菌 DH5α 感受态细
胞，涂布于添加 100 mg/L 氨苄青霉素＋IPTG＋
X-gal 的 LB 固体平板上，37 ℃培养 13 h 后挑取
白斑，37 ℃、250 r/min 摇床培养后提取质粒，经
酶切鉴定正确后进行测序，获得重组质粒 pMD19-
GrDXR。
2.2 GrDXR 基因的原核表达载体构建
对质粒 pGEX-4T-1 和 pMD19-GrDXR 分别进行
BamHI 和 XhoI 双酶切，回收载体片段和目的基因，
按物质的量比 1∶4 进行过夜连接，然后转化大肠杆
菌 DH5α 感受态细胞，涂布于添加 100 mg/L 氨苄青
霉素的 LB 固体平板，12 h 后挑取克隆摇菌后提质粒，
经 酶 切 检 测 正 确 后 ， 获 得 表 达 载 体
pGEX-4T-1-GrDXR。
2.3 GrDXR 基因的生物信息学分析
使用 NCBI 网站上的 BLAST 程序（http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/BLAST ）进行序列比对，应用
Genetyx 进行翻译，并预测蛋白质相对分子质量和等
电点（PI）等，使用DNAMAN 7 进行多序列比对；使
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 16 期 2014 年 8 月

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用 Clustal X2.1 进行比对，然后使用 MEGA6.0 软
件内置的 NJ 法构建系统进化树，设置 Bootstrap＝
1 000；利用在线数据库（http://molbiol. edu.ru/eng/
scripts/01_11.html）进行稀有密码子分析。使用
ChloroP 服务器 v1.1（http://www.cbs.dtu.dk/ services/
ChloroP）进行叶绿体转运肽预测；使用 Interpro 软
件（http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html）进行保
守结构域预测；使用 ProtScalee 软件进行疏水性分
析（http://web.expasy.org/protscale）；使用 Predic-
tProtein（https://www.predictprotein.org）对二级结构
预测，使用 SWISS-MODEL 服务器（http://swiss-
model.expasy.org/workspace）对三级结构预测；利
用 Expasy 中的 TMHMM 工具（http://www.cbs.dtu.
dk/services/TMHMM-2.0）预测 GrDXR 蛋白的跨膜
螺 旋 区 ； 利 用 在 线 工 具 WOLF PSORT
（http://www.wolfpsort.org）预测 GrDXR 的亚细胞
定位情况。
2.4 重组质粒pGEX-4T-1-GrDXR在大肠杆菌中的
表达
利用热激法将重组质粒 pGEX-4T-1-GrDXR 转化
大肠杆菌 Rosetta（DE3）感受态细胞，挑取单菌落接
种于3 mL含100 mg/L氨苄青霉素LB液体培养基中，
37 ℃、250 r/min 培养 12 h。然后以 1∶100 比例转接
到无抗生素的 LB 液体培养基中，37 ℃、250 r/min
培养 3 h 至 A600≈0.8，在 37 ℃、终浓度为 1 mmol/L
IPTG诱导下进行表达，同时以相同条件的pGEX-4T-1
转化菌作为对照。分别诱导 0、2、4、6 h 后收集菌液
2 mL。4 ℃、8 000 r/min 离心 1 min，弃上清，加入
100 μL ddH2O、25 μL 的 5×SDS-PAGE 上样缓冲液，
震荡悬菌，沸水煮 5 min。4 ℃、13 000 r/min 离心 5
min。取 20 μL 上清上样，进行 SDS-PAGE（5%浓缩
胶和 10%分离胶）电泳检测。
3 结果与分析
3.1 滇龙胆 GrDXR cDNA 序列的克隆
以滇龙胆幼叶 cDNA 为模板，扩增出 1 500 bp
左右的片段（图 1）。通过 TA 克隆获得重组质粒
pMD19-GrDXR，酶切检测正确后进行测序，结果表
明所扩增序列与转录组测序序列一致。
3.2 GrDXR 基因的生物信息学分析
利用 Genetyx 软件对 GrDXR 的序列进行分析，
结果显示 GrDXR 基因的开放阅读框（ORF）为 1 425
bp，编码 474 个氨基酸，将该序列上传至 GenBank
数据库，获得登录号 KF941189；Gentyx 推测 GrDXR

M-Marker 1-PCR 扩增结果
M-Marker 1-PCR result of GrDXR gene
图 1 GrDXR 基因的 PCR 结果
Fig. 1 PCR result of GrDXR gene
蛋白相对分子质量为 51 340，pI 为 5.60。
利用 GeneBank 数据库中的 BLASTp 程序对
GrDXR 的氨基酸进行同源性分析，结果表明滇龙胆
GrDXR 蛋白与萝芙木 HvDXR 蛋白和橡胶树 HvDXR
蛋白相似性最高（89.64%），与银杏 GbDXR 蛋白和
紫杉 TcDXR 蛋白序列的相似性较低（75.85%）。
利用 MEGA 软件将 GrDXR 氨基酸序列与从
NCBI 中挑选的同源性较高的部分已知序列进行
系统进化分析，结果表明滇龙胆与萝芙木、橡胶
树和长春花亲缘关系较近，与银杏、紫杉和喜树
等植物中的 DXR 亲缘关系较远（图 2）。
利用 DNAMAN 将 GrDXR 氨基酸序列与从
NCBI 中挑选的同源性较高的部分已知序列进行多
序列比对分析，结果表明 GrDXR 蛋白与已知蛋白
序列高度保守（图 3）。
通过使用 ExPASy ProtParam tool 进行分析，

图 2 GrDXR 蛋白与其他植物 DXR 蛋白的系统发育分析
Fig. 2 Phylogentic relationship of GrDXR protein
and some other DXR proteins

4 500 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 200 bp
800 bp
500 bp
200 bp
M 1
萝芙木
橡胶树
长春花
滇龙胆
金鱼草
胡黄连
番茄
烟草
杜仲
蓖麻
巴豆
毛果杨
阳春砂
水稻
玉米
大麦
东北红豆杉
喜树
银杏
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76GrDXR
71CsDXR
77RvDXR
77CrDXR
70RcDXR
74PtDXR
77HbDXR
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图 3 GrDXR 与其他植物中 DXR 序列的比对结果
Fig. 3 Multiple sequence alignment of GrDXR with DXR sequences in other plants
GrDXR 蛋白相对分子质量为 51 350，理论 pI 值为
5.66，分子式为C2312H3682N606O687S12。半衰期为 30 h，
不稳定指数为36.78，属于稳定蛋白；脂肪指数为101.86，
总平均疏水性（GRAVY）为 0.013。蛋白质的疏水性
通常依据蛋白的 GRAVY 值来预测，GRAVY 值在
2～−2，若为正值，则此蛋白为疏水蛋白，反之则为亲
水性蛋白。因此，GrDXR 为疏水蛋白（图 4）。GrDXR
蛋白含有 20 种氨基酸，其中亮氨酸的量最高，为
10.5%；其次是丙氨酸和丝氨酸，分别为 9.5%和 8.2%；
色氨酸量最低，为 1.3%。对 GrDXR 进行稀有密码子
分析，结果表明GrDXR 基因中稀有密码子占 1.05%，

图 4 GrDXR 蛋白的疏水性分析
Fig. 4 Hydrophobicity analysis of GrDXR protein
5 55 105 155 205 255 305 355 405 455
位点
3
2
1
0
−1
−2
−3
得
分

GrDXR
CsDXR
RvDXR
CrDXR
RcDXR
PtDXR
HbDXR
相同部分

GrDXR
CsDXR
RvDXR
CrDXR
RcDXR
PtDXR
HbDXR
相同部分

GrDXR
CsDXR
RvDXR
CrDXR
RcDXR
PtDXR
HbDXR
相同部分

GrDXR
CsDXR
RvDXR
CrDXR
RcDXR
PtDXR
HbDXR
相同部分

GrDXR
CsDXR
RvDXR
CrDXR
RcDXR
PtDXR
HbDXR
相同部分

GrDXR
CsDXR
RvDXR
CrDXR
RcDXR
PtDXR
HbDXR
相同部分

76
71
77
77
70
74
77


156
151
157
157
150
154
157


236
231
237
237
230
234
237


316
311
317
317
310
314
317


396
391
397
397
390
394
397


473
466
473
473
466
470
473
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无二联或三联稀有密码子连续出现的情况，因此可选
用 BL21 或 Rosetta（DE3）进行原核表达。
利用 SSpro 方法对 GrDXR 进行二级结构分析。结
果表明该蛋白二级结构中 α-螺旋（H）占 39.03%，β-
折叠（E）占14.14%，无规则卷曲（C）占46.84%。利
用 Swiss-Model Workspace 预测 GrDXR 蛋白的三级结
构，从图中可以看到GrDXR 的三级结构主要由α-螺旋
结构和无规则卷曲组成，与二级结构预测结果一致；另
外，其三级结构形成能够结合底物的凹形区域（图 5）。
采用 InterProScan在线工具预测GrDXR蛋白的
保守结构域。结果表明 GrDXR 蛋白具有 4 个保守
结构域（图 6），分别为 NAD (P)-binding domain

图 5 GrDXR 的三级结构预测
Fig. 5 Predicted three dimensional structure
of GrDXR protein

图 6 GrDXR 蛋白保守结构域的预测
Fig. 6 Prediction of conserved domains of GrDXR protein
（IPR016040，71-225），1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate
reductoisomerase，N-terminal（IPR013-512，79-207），
1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase ，
C-terminal （ IPR013644 ， 221-304 ） 和 DXP
reductoisomerase C-terminal domain（ IPR026877，
336-462）。利用 ExPASy SignalP 4.0 Server 分析
GrDXR 蛋白，未发现信号肽，表明该蛋白为非分泌
型蛋白。利用 Expasy 中的 TMHMM 工具预测
GrDXR 蛋白的跨膜螺旋区，结果表明 GrDXR 蛋白
为非膜蛋白。利用在线工具 WOLF PSORT 预测
GrDXR 蛋白的亚细胞定位情况，结果显示该蛋白可
能定位于叶绿体。使用 ChloroP 在线软件对叶绿体转
运肽进行预测，结果表明 GrDXR 蛋白含有叶绿体转
运肽，为第 1～50 个氨基酸。
3.3 GrDXR 原核表达载体构建
使用 BamHI 和 XhoI 双酶切质粒 pGEX-4T-1-
GrDXR，可切出目的片段（图 7），表明 GrDXR 基因
已成功插入载体 pGEX-4T-1 中。重组表达质粒
pGEX-4T-1-GrDXR 测序结果表明，目的基因与原序
列一致，且未出现碱基突变及移码现象。这些结果
表明已获得正确的重组质粒 pGEX-4T-1-GrDXR。
3.4 GrDXR 蛋白的原核表达
将重组质粒 pGEX-4T-1-GrDXR 转化大肠杆菌

M-Marker 1-质粒 pGEX-4T-1-GrDXR 的 BamHI 和 XhoI 双酶切结果
M-Marker 1-digestion result of plasmid pGEX-4T-1-GrDXR by
BamHI and XhoI
图 7 质粒 pGEX-4T-1-GrDXR 酶切检测
Fig. 7 Digestion of pGEX-4T-1-GrDXR plasmid
Rosetta（DE3）后进行 IPTG 诱导表达。在 37 ℃、
IPTG 终浓度为 1 mmol/L 下，分别诱导表达 0、2、
4、6 h 后，提取总蛋白进行 SDS-PAGE 分析。结果
表明，与对照相比，pGEX-4T-1-GrDXR 工程菌经
IPTG 诱导后，在相对分子质量 77 340（含 GST 蛋
白）左右有 1 条蛋白条带，表明重组质粒
pGEX-4T-1-GrDXR 在大肠杆菌 Rosetta（DE3）中诱
导表达了 GrDXR 蛋白。当温度为 37 ℃、诱导时间
为 6 h 时，蛋白表达量最大（图 8），可直接用于下
一步的蛋白纯化。
M 1
4 500 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 200 bp
800 bp
500 bp
200 bp
Domain
Domain
1 50 100 150 200 250 300 350 400 474
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·2383·

M-Marker 1～2-pGEX-4T-1 转化菌诱导 0 和 6 h 的总蛋白 3～
6-pGEX-4T-1-GrDXR 工程菌诱导 0、2、4 和 6 h 的总蛋白
M-Marker 1—2-pGEX-4T-1 bacteria with 1 mmol/L of IPTG
induction for 0 and 6 h 3—6-pGEX-4T-1-GrDXR bacteria induced
for 0, 2, 4, and 6 h
图 8 37 ℃下不同诱导时间对 GrDXR 蛋白表达量的影响
Fig. 8 Effect of different inducing time on expression
of GrDXR protein at 37 ℃
4 讨论
DXR 是 MEP 途径的限速酶[2]，因此克隆和鉴
定 DXR 基因功能对于 MEP 途径研究非常重要。
一般地，在植物基因组中 DXR 基因仅有 1 个拷贝[5]。
目前，在滇龙胆转录组中，仅检测到 1 个 GrDXR
基因。本研究从滇龙胆幼叶中成功扩增出 GrDXR
基因，序列分析结果表明 GrDXR 蛋白与萝芙木、
橡胶树和长春花中的 DXR 蛋白亲缘关系最近，暗
示着它们具有相同或相似的功能。DXR 蛋白催化
DXP 的反应需要 NADPH 的存在[2]，因此 NADPH
结合结构域对 DXR 酶的活性至关重要。结构域预
测结果表明，GrDXR 在其 N 端具有 NAD（P）结
合结构域 GSTGSIGT 和 LAAGSNV、中间具有
LPADSEHSAI 和 NKGLEVIEAHY 2 个底物结合
结构域、DXR 的 N 末端和 C 末端结构域，这与
其他植物中的 DXR 高度同源[22]（图 7），进一步
表明所克隆基因编码 GrDXR蛋白。所有植物 DXR
成熟蛋白在 N 端都有 1 个富含脯氨酸的区域，而
在原核生物中却没有[7]。在 GrDXR 蛋白 N 端 56～
64 位存在富含脯氨酸的 PPPAWPGRA 结构域。叶
绿体或质体转运肽存在于所有植物 DXR 蛋白中，
能够介导酶进入存在 MEP 途径的质体中[23]。本研
究中，预测到 GrDXR 蛋白中存在叶绿体转运肽，
长度为 50 个氨基酸。酶基因的功能体现在蛋白质
上 ， 本 研 究 构 建 了 原 核 表 达 载 体
pGEX-4T-1-GrDXR，转入大肠杆菌 Rosetta（DE3），
并成功诱导表达出 GrDXR 蛋白。该研究为滇龙胆
GrDXR 蛋白结构和功能研究奠定基础，也为萜类
代谢工程提供候选基因。
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120 000
100 000
80 000

60 000
50 000
40 000


30 000
20 000
M 1 2 3 4 5 6
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