全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 14 期 2014 年 7 月

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• 药材与资源 •
滇龙胆 GrGPPS 基因的克隆及其序列分析与原核表达
王彩云 1，李富生 1，李 涛 2，李彩霞 2，张晓东 2*，王元忠 3*
1. 云南农业大学农学与生物技术学院，云南 昆明 650201
2. 玉溪师范学院资源与环境学院，云南 玉溪 653100
3. 云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650223
摘 要：目的 从滇龙胆 Gentiana rigescens 幼叶中克隆单萜化合物合成的关键酶牻牛儿基焦磷酸合成酶基因 GrGPPS，进
行序列特征分析和原核表达。方法 根据三年生滇龙胆转录组 GrGPPS 基因序列，设计特异性引物，通过 RT-PCR 扩增得到
GrGPPS cDNA 序列，并进行 TA 克隆、测序及序列分析；构建原核表达载体 pGEX-4T-1-GrGPPS，转入 Escherichia coli Rosetta
（DE3）中，在 37 ℃、1.0 mmol/L IPTG 诱导下进行表达。结果 GrGPPS cDNA 全长 1 107 bp，编码 369 个氨基酸；序列分
析表明，GrGPPS 基因是异戊烯基合成酶家族的成员；氨基酸序列系统发育分析表明，GrGPPS 与金鱼草 AmGPPS 亲缘关系
最近；构建 pGEX-4T-1-GrGPPS 重组质粒，获得稳定的 pGEX-4T-1-GrGPPS 原核表达体系。SDS-PAGE 结果表明所表达蛋
白与预期蛋白大小一致。结论 克隆了 GrGPPS 基因，建立 pGEX-4T-1-GrGPPS 稳定的原核表达体系，为进一步纯化和鉴
定 GPPS 蛋白并研究其结构和功能奠定基础。
关键词：滇龙胆；牻牛儿基焦磷酸合成酶基因；基因克隆；序列分析；原核表达
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)14 - 2060 - 09
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.14.020
Cloning, sequence analysis, and prokaryotic expression of GrGPPS gene
in Gentiana rigescens
WANG Cai-yun1, LI Fu-sheng1, LI Tao2, LI Cai-xia2, ZHANG Xiao-dong2, WANG Yuan-zhong3
1. College of Agriculture and Biological Technology, Yunnan Agriculture University, Kunming 650201, China
2. College of Resources and Environment, Yuxi Normal University, Yuxi 653100, China
3. Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650223, China
Abstract: Objective To obtain the indispensable key enzyme involved in the monoterpene biosynthesis, the geranyl diphosphate synthase
gene GrGPPS was cloned from Gentiana rigescens, and its sequence analysis and prokaryotic expression were performed. Methods
According to the GrGPPS gene sequence of transcriptome of triennial G. rigescens, a pair of specific primers was designed, and the full length
of cDNA sequences was obtained by RT-PCR. Then TA cloning, sequencing and sequence analysing were performed. Prokaryotic expression
vector pGEX-T-1-GrGPPS was constructed and transformed into Escherichia coli Rosetta for expression under 37 and ℃ induced by 1
mmol/L IPTG. Results The GrGPPS cDNA had a length of 1 107 bp coding for 369 amino acids. Sequence analysis showed that GrGPPS
was the member of “short-chain prenyltransferases” super family. Results of phylogenic analysis showed that GrGPPS was at the same
evolutionary branch with AmGPPS. The SDS-PAGE results displayed that the expressed proteins were consistent with the anticipated size.
Conclusion The GrGPPS gene is cloned from G. rigescens, and the stable prokaryotic expression system of pGEX-T-1-GrGPPS is
constructed. This work will provide a foundation for further purification, structure, and functional research of GrGPPS protein.
Key words: Gentiana rigescens Franch.; GrGPPS; gene cloning; sequence analysis; prokaryotic expression

龙胆苦苷（gentiopicroside）广泛存在于龙胆科
植物中，是滇龙胆 Gentiana rigescens Franch. 等药
用植物中一类重要的次生代谢产物[1]，也是龙胆泻
肝丸等多种中药产品的主要药效成分[2]。现代药理学

收稿日期：2014-03-16
基金项目：国家自然科学基金项目（81260608）；云南省教育厅科学研究基金重点项目（2013Z075）；科技部“十二五”国家科技支撑计划项
目（2011BAI13B02-04）
作者简介：王彩云（1989—），女，硕士在读，研究方向为药用植物资源评价与利用。Tel: 15108713725 E-mail: wangcaiyun0716@126.com
*通信作者 张晓东，男，博士，讲师，主要从事植物分子生物学方面的研究。Tel: 15925236961 E-mail: zxd95@126.com
王元忠，男，助理研究员，主要从事药用植物资源评价与利用的研究。Tel: 13888829994 E-mail: boletus@126.com
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研究证实龙胆苦苷具有保肝、利胆、镇痛、抗炎、抗
菌、健胃、抗肿瘤以及诱发神经轴突生长等作用[3-6]。
龙胆苦苷属于裂环烯醚萜类化合物，同所有的单萜化
合物一样起源于相同的底物，即牻牛儿基焦磷酸
（GPP，C10），而该化合物的 C10 骨架由牻牛儿基焦
磷酸合成酶（geranyl diphosphate synthase，GPPS）催
化异戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）及
其异构体二甲基丙烯基焦磷酸（ dimethylallyl
diphosphate，DMAPP）头尾缩合而成[7-8]。GPP 能经
过多步酶学催化过程随后转换为香叶醇、香叶醇 10-
羟化酶、马钱苷酸、裂环番木鳖酸、獐牙菜苷、獐牙
菜苦苷，最后形成龙胆苦苷[9-10]。GPPS 是短链异戊烯
基合成酶家族成员，催化 1 分子的 IPP 与 DMAPP 合
成 GPP，是异戊二烯途径中一个很重要的酶，在吸引
传粉者和次生代谢产物的防御中起重要作用[11]。
Burke 等 [12] 第一次从薄荷属植物辣薄荷
Mentha piperita L. 中分离出 2 个亚基组成的异型
二聚体 GPPS 蛋白，并从 cDNA 文库中筛选得到
了 GPPS 基因全长 cDNA 序列。随后 GPPS 基因
相继从拟南芥 Arabidopsis thaliana L.[13]、啤酒花
Humulus lupulus L. [14] 、长春花 Catharanthus
Roseus (Linn.) G. Don [15]、金鱼草 Antirrhinum
majus L.[16]等植物中克隆得到，并发现 GPPS 分布
在叶绿体以及分泌腺细胞中，且以同型二聚体、
异质二聚体两种形式存在 [15]。据报道，同聚肽
GPPS 在 2 种裸子植物冷杉 Abies Grandis Lindl.、
挪威云杉Picea abies L. Karst [17-19]和 4种被子植物
拟南芥、番茄 Lycopersicon esculentum Miller、夏
栎 Quercus robur L.、蝴蝶兰 Phalaenopsis bellina
L. 中存在[8,13,20-21]；杂聚肽 GPPS 只在被子植物辣
薄荷、金鱼草、仙女扇 Clarkia breweri、啤酒花中
存在[12,14,16]。在结构上，杂聚肽 GPPS 包含非催
化活性小亚基（SSU）和一个大亚基（LSU），这
些亚基在 GPPS 单独存在时无活性和功能，2 种亚
基的相互作用导致杂聚肽 GPPS 的活性[15]。
滇龙胆为龙胆科龙胆属多年生宿根草本植物，
是我国特有物种，主要分布于云南、贵州、四川、
广西等省，其中云南是主要产区。野外主要生长在
海拔 1 100～3 000 m 杂木林下、荒坡地、山谷灌木
丛旁[22]。滇龙胆在云南有悠久的药用历史[23]，被《中
国药典》2010 年版收录，为传统中药材龙胆的植物
来源之一[24]。目前，国内外对滇龙胆的研究主要集
中在栽培、农艺性状、化学成分研究、矿质元素测
定等方面[25-27]，而对滇龙胆 GPPS 基因的扩增和功
能分析至今未见报道。本研究根据三年生滇龙胆转
录组牻牛儿基焦磷酸合成酶（GrGPPS）基因序列，
设计特异性引物，从滇龙胆叶中成功提取到 RNA，
反转录为 cDNA，进而扩增到 GrGPPS 基因，并进
行酶切鉴定、测序以及序列分析，然后进行原核表
达。结果表明 GrGPPS 转化菌在 37 ℃、终浓度为
1 mmol/L IPTG 诱导下成功表达出目的蛋白。本研
究为滇龙胆及龙胆科植物中裂环烯醚萜类化合物生
物合成途径的研究奠定基础，也为其他生物中
GPPS 蛋白的研究提供参考。
1 材料和试剂
1.1 材料
滇龙胆 Gentiana rigescens Franch. 栽培于云南
省农业科学院药用植物研究所种质资源圃（25°08′
04.50″N，102°46′15.05″E）。栽培地海拔 1 942 m，
年平均气温 14.7 ℃，年平均降水量 980～1 050
mm，极端最高温度 30.4 ℃，极端最低温度−0.2 ℃。
试验材料为滇龙胆长势良好的幼叶。大肠杆菌
Escherichia coli Trans 5α和 Rosetta（DE3）菌种购
于宝生物工程（大连）有限公司。
1.2 试剂
RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue
Reagent、反转录试剂盒、限制性内切酶及异丙基硫
代半乳糖苷（isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside，
IPTG）、X-gal 等均为宝生物工程（大连）有限公司
产品；高纯质粒小量制备试剂盒、多功能 DNA 纯
化回收试剂盒均购自北京百泰克生物技术有限公
司；质粒 pGEX-4T-1 由昆明理工大学生物工程技术
研究中心植物组保存；引物由上海捷瑞生物工程技
术服务有限公司合成，测序由上海生工生物工程技
术服务有限公司完成。
2 方法
2.1 叶片总 RNA 提取及 GrGPPS 全长 cDNA 的
克隆
按 照 RNAiso for Polysaccharide-rich Plant
Tissue 试剂盒说明书，提取滇龙胆幼叶的总 RNA；
按照 Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）试
剂盒说明书合成 cDNA，−20 ℃保存备用。根据三
年生滇龙胆转录组 GrGPPS 基因序列和原核表达载
体 pGEX-4T-1 多克隆酶切位点，设计一对特异引物
GrGPPSSalI-F：5’-GTCGACATGGCTTTGATATAT-
TCTACTCCATC-3’；GrGPPSXhoI-R：5’-CTCGAG-
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TCAATTATCCCTATAAGCAATGTAATT-3’。以 cDNA
为模板进行 PCR 扩增，反应条件：94 ℃、3 min；
94 ℃、30 s，53 ℃、30 s，72 ℃、67 s，30 个循
环；72 ℃延伸 7 min。
2.2 GrGPPS 基因的测序与分析
GrGPPS PCR 产物经 1.0%的琼脂糖凝胶电泳
检测，用胶回收试剂盒对目的片段进行纯化，纯化
后将其连接到 pMD19-T 载体上，转化 E. coli Trans
5α 感受态细胞，涂布于添加氨苄青霉素（100
mg/L）、IPTG、X-gal 的 LB 平板上，37 ℃培养 12～
16 h 后随机挑取阳性克隆摇菌后提取质粒，经 PCR
检测和酶切鉴定正确后进行测序，获得重组载体
pMD19T-GrGPPS。
2.3 原核表达载体的构建
对 pMD19T-GrGPPS 重组质粒和 pGEX-4T-1 载体
分别进行 SalI 和XhoI 双酶切，回收目的基因和载体片
段，按摩尔比 1∶4 混合后经 Ligation Solution I 连接
后转化E. coli Trans 5α感受态细胞，涂布于添加氨苄青
霉素（100 mg/L）的 LB 平板，次日随机挑取阳性克
隆摇菌后提取质粒，经 PCR 检测和酶切鉴定正确后
进行测序，获得融合表达载体 pGEX-4T-1-GrGPPS。
2.4 GrGPPS 的生物信息学分析
利用 NCBI 网站上的 BLAST 程序进行序列比
对，应用 DNAMAN 软件推测和比对氨基酸序列，
并预测蛋白质相对分子质量和等电点等；应用
Mega4.0 软件构建系统进化树；利用数据库资源
http://molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_11.html 进行稀有
密码子分析。
2.5 重组质粒 pGEX-4T-1-GrGPPS 在大肠杆菌中
的表达
利用热激法将重组质粒 pGEX-4T-1-GrGPPS
转化大肠杆菌 Rosetta（DE3）感受态细胞，挑取单
菌落接种于 4 mL LB 液体培养基（含 100 mg/L 氨
苄青霉素）中，37 ℃ 200 r/min 培养过夜。次日
以 1∶100 的比例转接到新的不含氨苄青霉素的
LB 液体培养基中，37 ℃ 200 r/min 培养至吸光度
（A600）值 0.6～0.8，在 37 ℃条件下，加入 IPTG
（终浓度为 1 mmol/L）进行诱导表达，同时以加入
IPTG（终浓度 1 mmol/L）的 pGEX-4T-1 质粒转化
菌为对照。诱导 0、1、2、4、6 和 8 h 后分别收集
菌液 2 mL。12 000 r/min 常温离心 1 min 后，弃上
清，加入 20 μL 的 5×SDS-PAGE 上样缓冲液 [250
mmol/L Tris-HCl（pH 6.8）、10% SDS、0.5%溴酚
蓝、50%甘油、5% β-巯基乙醇]，100 μL Milli-Q
water，震荡混匀，100 ℃煮沸 15 min。室温 12 000
r/min 离心 5 min，取 20 μL 样品上样，进行
SDS-PAGE（4%浓缩胶和 12%分离胶）电泳检测。
3 结果与分析
3.1 滇龙胆 GrGPPS cDNA 的克隆
以滇龙胆 cDNA 为模板扩增出的 PCR 产物经
琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明扩增片段在 1 100
bp 左右，是预期的目的片段（图 1）。重组质粒
pMD19T-GrGPPS 经酶切验证连接正确，有明显的、
单一的目的条带，且目的条带与预期条带的大小吻
合（图 1）。测序结果表明 GrGPPS（登录号为
KF922375）全长 1 107 bp。

M-Marker 1-GrGPPS 扩增产物 2-重组质粒 pMD19T-GrGPPS
SalI 和 XhoI 双酶切产物
M-Marker 1-PCR product of GrGPPS 2-product of recombinant
plasmid pMD19T-GrGPPS digested by SalI and XhoI
图 1 RT-PCR 扩增 GrGPPS 基因及双酶切验证
Fig. 1 Fragment of GrGPPS amplified by RT-PCR and
restriction verification of pMD19-GrGPPS
3.2 GrGPPS 序列分析
3.2.1 氨基酸序列同源性分析 利用 DNAMAN 以
及 Genetyx 软件对 GrGPPS 的序列进行分析，结果
显示GrGPPS基因的开放阅读框（ORF）长 1 107 bp，
编码 369 个氨基酸（图 2）。
利用 GeneBank 数据库中的 Blastp 程序对
GrGPPS 的氨基酸进行同源性分析，结果表明滇龙
胆 GrGPPS 与金鱼草 AmGPPS 蛋白的相似性最高，
为 80%；与辣薄荷 MpGPPS 和加拿大薄荷 McGPPS
蛋白序列的相似性最低，为 68%（表 1）。
利用Mega4.0将GrGPPS氨基酸序列与从NCBI
中挑选的同源性较高的部分已知序列进行系统进化
分析，结果表明滇龙胆 GrGPPS 与长春花 CrGPPS
在同一进化枝上（图 3），表明其亲缘关系较近；与
芒果 MiGPPS、啤酒花 HlGPPS 的遗传距离较远（图
3），表明滇龙胆 GrGPPS 与芒果 MiHPPS、啤酒花
HlGPPS 的亲缘关系较远。
4 500 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 200 bp
800 bp
500 bp
200 bp
4 500 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 200 bp
800 bp
500 bp
200 bp
M 1 M 2
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图 2 GrGPPS 的 cDNA 序列及其预测的编码蛋白质的氨基酸序列
Fig. 2 cDNA sequence of GrGPPS and predicted amino acid sequence coding protein
表 1 GrGPPS 氨基酸序列与 NCBI 中已知植物 GPPS 序列比对结果
Table 1 BLASTn result of GrGPPS amino acids with other GPPS sequences in plant of NCBI
物种 相似性 / % 基因 登录号
长春花 Catharanthus roseus 77 CrGPPS AGL91645.1
金鱼草 Antirrhinum majus 80 AmGPPS AAS82860.1
胡黄连 Picrorhiza kurrooa 70 PkGPPS AAW66658.1
辣薄荷 Mentha piperita 68 MpGPPS AAF08793.1
啤酒花 Humulus lupulus 69 HlGPPS ACQ90682.1
加拿大薄荷 Mentha canadensis 68 McGPPS ABR15420.1
丹参 Salvia miltiorrhiza 77 SmGPPS AEZ55681.1
芒果 Mangifera indica 75 MiGPPS AFJ52722.1

图 3 GrGPPS 与其他 GPPS 蛋白的系统发育分析
Fig. 3 Phylogentic relationship of GrGPPS
and some other GPPS proteins
利用 DNAMAN 将 GrGPPS 氨基酸序列与从
NCBI 中挑选的同源性较高的部分已知序列进行多
序列比对分析，结果表明 GrGPPS 蛋白与已知蛋白
序列在 N 端高度保守，且含有异戊烯基结构域（图
4），进一步表明其为类异戊烯基超家族成员。
3.2.2 理 化 性 质 分 析 通 过 使 用 ExPASy
ProtParam tool 进行分析，GrGPPS 蛋白的相对分子
质量为 40 050，理论等电点为 6.14，分子式为
C1775H2848N480O533S19 。 半 衰 期 （ mammalian
reticulocytes， in vitro）为 30 h。不稳定指数
（instabilityindex）为 34.85，脂肪族指数（aliphatic
index）为 95.22，总平均疏水性（grand average of
hydropathicity，GRAVY）为−0.035。蛋白质的疏水
性通常依据蛋白的 GRAVY 值来预测，GRAVY 值
在 2～−2，若为正值，则此蛋白为疏水性蛋白，反

GrGPPS
CrGPPS
AmGPPS
SmGPPS
MpGPPS
McGPPS
PkGPPS
HlGPPS
MiGPPS
1
1
79
27
157
53
235
79
313
105
391
131
469
157
547
183
625
209
703
235
781
261
859
287
937
313
1 015
339
1 093
365
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图 4 GrGPPS 与其他植物中 GPPS 氨基酸序列的多序列比对结果
Fig. 4 Multiple sequence alignment of GrGPPS amino acid sequence with GPPS in other plants
之则为亲水性蛋白。从 ProtParam 软件分析结果来
看，GRAVY 值为−0.708，说明 GrGPPS 为亲水性蛋
白。GrGPPS 蛋白含有 20 种氨基酸，其中丙氨酸
（Ala）的量最高，为 10.6%；其次是亮氨酸（Leu），
为 10.1%；色氨酸（Trp）量最低，为 0.3%。
对 GrGPPS 进 行 稀 有 密 码 子 分 析
（http://molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_11.html），结果
表明 GrGPPS 基因中稀有密码子占 0.8%，无二联或
三联稀有密码子连续出现的情况，因此可以选用
BL21 或 Rosetta（DE3）进行原核表达。
3.2.3 蛋白质二级结构和三维建模 利用 SSpro 方
法（http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/）对 GrGPPS
进行二级结构分析。结果表明该蛋白二级结构中 α-
螺旋（H）占 64.4%，β-折叠（E）占 2.45%，无规
则卷曲（C）占 33.15%。
利用CPHmodels 3.2 Server 在线软件（http://www.-
cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/）预测GrGPPS 蛋白的三
维结构（图 5），从图中可以看到 GrGPPS 的三维结
构主要由螺旋结构和无规则卷曲组成，与二级结构
预测结果一致；另外，其三维结构形成“穴型”功
能区域，暗示其在催化反应中起关键作用。

图 5 GrGPPS 的三维结构预测
Fig. 5 Predicted three dimensional structure
of GrGPPS protein
3.2.4 结构域预测 采用 InterProScan 在线工具预
测 GrGPPS 蛋白的保守结构域，GrGPPS 具有 7 个
保守结构域（图 6），主要是聚丙烯合成酶（polyprenyl
synthetase）（IPR000092），分别位于 105～354 位
（PF00348）、286～298 位（PS00444）和 153～169 位
（ PS00723 ）；萜类合成酶（ terpenoid synthase ）
（IPR008949），分别位于 75～366 位（1.10.600.10）和
77～ 363 位（ SSF48576）；聚丙烯相关合成酶
（polyprenyl synthetase-related）（IPR017446），位于
61～365 位（PTHR12001）。另外，还有牻牛儿基焦
磷酸合成酶结构域，在 IPR 中没有明确分类，位于
AmGPPS
CrGPPS
GrGPPS
HIGPPS
McGPPS
MiGPPS
MpGPPS
PkGPPS
SmGPPS
相同部分


AmGPPS
CrGPPS
GrGPPS
HIGPPS
McGPPS
MiGPPS
MpGPPS
PkGPPS
SmGPPS
相同部分

AmGPPS
CrGPPS
GrGPPS
HIGPPS
McGPPS
MiGPPS
MpGPPS
PkGPPS
SmGPPS
相同部分

AmGPPS
CrGPPS
GrGPPS
HIGPPS
McGPPS
MiGPPS
MpGPPS
PkGPPS
SmGPPS
相同部分

86
97
82
83
91
42
91
85
58


186
197
182
183
191
142
191
185
158


286
297
282
283
291
242
291
285
258


371
382
367
368
376
327
376
370
343
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61～365 位（PTHR12001:SF8）。
利用推测的蛋白序列检索 NCBI 的 CDD
（Conserved Domain Database）数据库，发现 GrGPPS
蛋白属于类异戊二烯超家族成员（图 7），其功能可
能与单萜类物质的合成有关。
3.2.5 信号肽、跨膜区、亚细胞定位及功能预测分析

图 6 InterProScan 预测的 GrGPPS 蛋白保守结构域
Fig. 6 Conserved domains of GrGPPS protein predicted by InterProScan

图 7 GrGPPS 蛋白保守域分析
Fig. 7 Conserved domain prediction of GrGPPS protein
利用ExPASy SignalP 4.0 Server（http://www.cbs. dtu. dk/
services/SignalP/）分析GrGPPS 蛋白，并没有发现信号
肽，表明该蛋白为非分泌型蛋白。
利用 Expasy 中的 TMHMM 工具（http:// www.
cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）预测 GrGPPS 蛋
白的跨膜螺旋区，结果表明 GrGPPS 蛋白非膜蛋白，
无跨膜螺旋区。
利用在线工具 WOLF PSORT（http://www. wolf-
psort.org/）预测 GrGPPS 的亚细胞定位情况，结果
显示该蛋白可能定位于叶绿体，定位系数为 14.0
（chlo: 14.0）。
使用 ProtFun 软件基于已知的具有相似功能蛋
白的搜索和比对，对 GrGPPS 蛋白进行功能预测，
结果显示 GrGPPS 蛋白嘌呤碱和嘧啶碱、翻译、能
量代谢的功能的可能性为 0.521、0.243、0.293，其
可能性的数值远高于其他功能，这些数据都为后续
的研究提供了一定的依据。
3.2.6 GrGPPS 原核表达载体构建 使用 SalI 和
XhoI 双酶切重组质粒 pGEX-4T-1-GrGPPS，可切出
约 1 107 bp 的片段（图 8），表明扩增的 GrGPPS 片
段已插入载体 pGEX-4T-1 中。在此基础上，对重组
表达质粒 pGEX-4T-1-GrGPPS 进行测序。结果表明，
连入表达载体中的基因片段与目的序列一致，并且
酶切位点连接处序列也都正确，未出现碱基突变及
移码现象。表明已获得了正确的 GrGPPS 的原核表
达重组质粒。
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M-Marker 1-pGEX-4T-1-GrGPPS 双酶切结果
M-Marker 1-digestion result of recombinant plasmid
pGEX-4T-1-GrGPPS by SalI and XhoI
图 8 pGEX-4T-1-GrGPPS 酶切检测
Fig. 8 Digestive detection of pGEX-4T-1-GrGPPS plasmid
3.2.7 GrGPPS 蛋白的表达 将重组质粒 pGEX-4T-1-
GrGPPS 转化大肠杆菌Rosetta 后进行诱导表达。在终浓
度为1 mmol/L IPTG、37 ℃下分别诱导表达0、1、2、
4、6 和8 h 后，提取大肠杆菌总蛋白进行SDS-PAGE 分
析。结果表明，插入有外源片段的重组质粒
pGEX-4T-1-GrGPPS 经 IPTG 诱导后，在预期的蛋白相
对分子质量 66 050（包括载体上 GST 蛋白）左右有 1
条蛋白条带，而未诱导时的转化重组质粒和pGEX-4T-1
对照质粒均未出现这条蛋白带，表明重组质粒
pGEX-4T-1-GrGPPS 在大肠杆菌Rosetta（DE3）中诱导
表达了GrGPPS 蛋白。当温度为37 ℃、诱导时间为4 h
时，蛋白表达量已接近最大，8 h 时最大（图9）。

M-Marker 1～2-对照：37 ℃，IPTG 终浓度为 1 mmol/L 时
pGEX-4T-1 空载体转化子诱导 0 和 8 h 的总蛋白；3～8-相同条件
下，融合表达工程菌诱导 0、1、2、4、6、8 h 的总蛋白
M-Marker; 1—2-CK is the expressed product of pGEX-4T-1 with 1
mmol/L of IPTG induction for 0 and 8 h at 37 ;℃ 3—8-The
expressed product of pGEX-4T-1-GrGPPS with 1 mmol/L of IPTG
induction for 0, 1, 2, 4, 6 and 8 h separately at 37℃.
图 9 37 ℃不同时间诱导对重组蛋白表达量的影响
Fig. 9 Effect of different time on expression
of recombinant protein at 37 ℃
4 讨论
到目前为止，GPPS 的活性仅在少数植物中被
研究，且 GPPS 蛋白主要存在于产生大量单萜的组
织中，纯化非常困难[28]，对 GPPS 的研究主要集中
在其对单萜和倍半萜的影响，如 Martin 等[29]对葡萄
Vitis vinifera 中 VvGPPS 的转录进行分析，表明
VvGPPS 基因在单萜生物合成中起重要作用；Chang
等[30]研究发现辣薄荷中的MpGPPS包含 2个具有催
化功能的大亚基和 2 个非催化的具有调控功能的小
亚基，并且证实与薄荷醇的生物合成有关；Rai 等[15]
从长春花中克隆到 CrGPPS 基因，发现 CrGPPS 在
长春花中以杂聚肽和同聚肽 2 种形式存在，且发现
只有含有 GrGPPS.SSU 的杂聚肽 GPPS 能调控 MIA
生物合成中的 GPP 流。然而 Van Schie 等[20]研究发
现由于病毒诱导基因沉默引起的番茄中 LeGPPS 表
达量降低导致植株的严重矮小，进一步研究发现这
些矮小植株中赤霉素的量降低，而类胡萝卜素和叶
绿素的含量未发生变化，表明 GPPS 不仅在萜类的
生物合成中起作用，而且与赤霉素的生物合成有关。
尽管 GPPS 在单萜生物合成中起着重要作用，
但 GPPS 在植物中的功能以及在 GPP 代谢流中的调
控机制研究的还很少。克隆基因的方法有 cDNA 差
异显示法[31]、设计简并引物同源克隆法[32-33]以及分
析 EST 数据库，根据基因预测设计特异引物，直接
从 cDNA 文库或基因组文库中扩增基因为策略的一
些方法，例如 RACE、Tail-PCR 等。本研究根据滇
龙胆转录组 GrGPPS 基因序列，设计一对特异性引
物，应用 RT-PCR 技术进行扩增，得到完整的 cDNA
序列，并命名为 GrGPPS。经序列分析，发现 GrGPPS
全长 1 107 bp，编码 369 个氨基酸。BLASTp 分析
结果显示，GrGPPS 的同源蛋白较少，但与其他物
种 GPPS 蛋白的相似性较高。以上这些结果表明
GrGPPS 基因属于类异戊二烯家族成员。原核表达
载体 pGEX-4T-1 带有谷胱甘肽转移酶 GST 标签，
由于 GST 标签蛋白较大，相对分子质量约 2 600，
在实验中常需要用凝血酶等将标签蛋白酶切后再进
行目的蛋白的后续研究。
本研究成功构建了滇龙胆 GrGPPS 基因原核表
达载体 pGEX-4T-1-GrGPPS，转入 E. coli Rosetta
（DE3），并成功诱导表达出 GrGPPS 蛋白。SDS-
PAGE 结果表明龙胆叶片中的 GrGPPS 基因编码蛋
白为单条带（图 9），因此 GrGPPS 蛋白可能为单亚
基酶或二亚基同聚体，这需要进一步的实验验证。
M 1
4 500 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 200 bp
800 bp
500 bp
200 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8
116 000
66 200
45 000
35 000
25 000
18 400
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 14 期 2014 年 7 月

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原核生物具有繁殖快、周期长等特点，为下一步纯
化 GrGPPS 蛋白以及进行生物功能分析奠定基础。
以体外实验模拟体内环境来生产生物体内化学成分
是目前的科研热点，采用生物技术来缓解资源短缺
等问题也是中医药现代化的目的之一。该研究有助
于深入了解龙胆苦苷生物合成途径的分子基础，也
为单萜类化合物的生物工程提供候选基因。
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