全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 3 期 2015 年 2 月

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• 药材与资源 •
铁皮石斛 1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶基因的克隆与表达分析
吴秋菊，武梅娟#，王 翔，林 毅，蔡永萍，樊洪泓*
安徽农业大学生命科学学院，安徽 合肥 230036
摘 要：目的 从铁皮石斛 Dendrobium officinale 中克隆 1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶 [1-hydroxy-2-methyl-2-
(E)-butenyl-4-diphosphatereductase，HDR] 基因，并分析其在铁皮石斛不同组织中的表达差异以及不同信号分子诱导下的表
达模式。方法 采用 RT-PCR 和 RACE 等方法获得铁皮石斛 HDR 基因（DoHDR）全长，利用 DNAMAN 和 MEGA6.0 对其
他物种的 HDR 基因编码的氨基酸序列进行同源性分析和进化关系分析，使用实时荧光定量分析 HDR 基因的表达模式。
结果 成功获得 DoHDR 基因，GenBank 登录号为 KC344827，全长 1 658 bp，编码 460 个氨基酸，与其他科属植物的同源
性达到 80%以上。DoHDR 基因在铁皮石斛叶片中表达量最高，从高到低依次是根、茎、原球茎；且受到脱落酸（abscisic acid，
ABA）、水杨酸（salicylic acid，SA）信号分子的诱导。结论 从铁皮石斛中获得 DoHDR 基因，为进一步阐明铁皮石斛萜类
化合物合成途径中该基因的重要作用奠定了理论基础。
关键词：铁皮石斛；1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶；基因克隆；表达分析；萜类
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)03 - 0405 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.03.019
Cloning and expression analysis of 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diph-
osphatereductase gene in Dendrobium officinale
WU Qiu-ju, WU Mei-juan, WANG Xiang, LIN Yi, CAI Yong-ping, FAN Hong-hong
School of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China
Abstract: Objective To clone the full-length cDNA encoding 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphatereductase (HDR)
gene from Dendrobium officinale (DoHDR), then to analyze the expression difference in different tissues and expression patterns of
DoHDR induced by signal molecule. Methods RT-PCR and RACE technologies were used to clone the full length cDNA of DoHDR.
The analyses of homologous comparison and phylogenetic tree were performed using DNAMAN and MEGA6.0 softwares, then the
expression patterns of DoHDR were studied by real-time PCR. Results The DoHDR gene was successfully obtained (GenBank
accession number KC344827), and the full-length cDNA was 1 658 bp, coding the protein containing 460 amino acids. DoHDR had
high homology (≥ 80%) with HDR proteins from other plants. Tissue expression analysis showed that DoHDR had the highest
expression in the leaves, followed by roots, stems, and protocorm. Quantitative PCR results showed that DoHDR could be induced by
signal molecule such as abscisic acid (ABA) and salicylic acid (SA). Conclusion The cDNA encoding DoHDR is cloned. It is helpful
for the future research on the mechanism of terpenoid biosynthesis in D. officinale.
Key words: Dendrobium officinale Kimura et Migo; 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphatereductase; gene cloning;
expression analysis; terpenoid

石斛是我国传统的名贵珍稀中药材[1]，素有“千
金草”之称，铁皮石斛 Dendrobium officinale Kimura
et Migo 是石斛属药用植物的一种，具有益胃生津、
滋阴清热等功效[2]，与其他石斛区分而单列出来录
入《中国药典》2010 年版，由此可见铁皮石斛的名
贵珍稀。
铁皮石斛具有悠久的药用历史，能治疗多种疾
患。多年的研究发现该植物含有多种化学成分，药
用成分既丰富又均衡，其中，生物碱和多糖是其最
主要的成分[3]。研究表明，铁皮石斛多糖具有提高

收稿日期：2014-09-29
基金项目：安徽省科技攻关项目（1301032139）；国家级大学生创新创业训练计划项目（201310364006）
作者简介：吴秋菊（1990—），女，安徽灵璧人，硕士在读，研究方向为药用植物分子生物学。E-mail: youyanqj@163.com
*通信作者 樊洪泓（1980—），女，博士，副教授，硕士研究生导师，研究方向为药用植物生物技术。Tel: (0551)65786216 E-mail: hhfan0551@126.com
#为共同第一作者
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免疫力、抗氧化等功效[4]；生物碱具有抗肿瘤[5]、
止痛退热、改善心血管功能和治疗胃肠道疾病等作
用。目前，已有研究表明，石斛属植物中的生物碱
大多属于倍半萜类生物碱或萜类吲哚生物碱[6]，两
类生物碱生物合成均起源于萜类途径（MEP 途径、
MVA）。在高等植物中萜类物质通过 2 个途径合成，
即位于细胞质中的甲羟戊酸（mevalonate-pathway，
MVA）途径和位于质体中的甲基赤藓-4-磷酸途径
（methylerythritol-4-phosphate pathway，MEP）。异戊烯
焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）和二甲基烯丙
基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）是这
2 条萜类化合物合成途径的共同前体，所有的萜类化
合物都是由这 2 个化合物衍生得到的；4-羟基-3-甲
基-2-丁烯基焦磷酸还原酶（HDR）是 MEP 途径中的
末端活性酶，以 5∶1 的比例催化 HMBPP 同时生成
IPP 和 DMAPP 的混合物[7]；因此，在 MEP 途径中，
HDR 具有提供前体萜类物质和主要限速作用[8]。
目前，HDR 基因已经从拟南芥 Arabidopsis
thaliana (L.) Heynh. [9]、银杏 Ginkgo biloba L. [10]、
橡胶树 Hevea brasiliensis (Willd. ex A. Juss.) Muell.
Arg [11]、喜树 Camptotheca acuminata Decne.[12]、黄
花蒿 Artemisia annua L. [13]、紫杉 Taxus media Cheng
et L. K. Fu [14]、萝芙木 Rauvolfia verticillata (Lour.)
Baill. [15]等植物中克隆得到，但在铁皮石斛中仍未见
报道。本实验以铁皮石斛为材料，采用 RT-PCR 和
RACE 等方法克隆铁皮石斛 HDR（DoHDR）基因全
长，并对其序列进行生物信息学分析，研究其在不
同组织器官中的表达差异，以及不同信号分子对其
诱导表达的模式，为进一步研究 HDR 基因在铁皮石
斛萜类物质生物合成途径中的作用提供理论依据。
1 材料与试剂
1.1 材料
铁皮石斛组培苗取自本实验室，经安徽农业大
学生命科学学院蔡永萍教授鉴定为铁皮石斛
Dendrobium officinale Kimura et Migo。
1.2 主要试剂
总 RNA 提取试剂盒 RNAprep Pure Plant Kit、
PrimScriptTm First Strand cDNA Synthesis Kit 购自北
京 Tiangen 公司；pMD18-T 载体试剂盒、RACE 试剂
盒、SYBR® Premix Ex TaqTM II 均购自 TaKaRa 公司。
2 方法
2.1 总 RNA 的提取与 cDNA 合成
取新鲜的铁皮石斛组培苗 0.1 g，用灭菌水清洗
去除残留培养基，并用滤纸吸干，液氮中迅速研磨
成粉末，然后按照 RNAprep Pure Plant Kit（Tiangen）
说明书进行 RNA 提取。利用超微量分光光度计检
测 RNA 浓度和质量。并以此为模板按照 FastQuant
RT Kit（Tiangen）说明书进行 cDNA 第一条链合成。
2.2 引物设计
根据 GenBank 上已登录的植物 HDR 氨基酸序
列，如拟南芥、罗汉果、银杏、长春花、橡胶树等，
利用 DNAMAN 软件多重比对，比较氨基酸同源性，
并挑选 2 段高度保守区段序列，据此设计一对简并
引物 HDR-S、HDR-R（表 1）。
2.3 DoHDR 基因保守区片段的扩增
首先以反转录合成的 cDNA 为模板，利用引物
表 1 引物名称及序列
Table 1 Names and seqences of primers
引物用途 引物名称 引物序列（5’-3’）
HDR-S GCNGTNCARATHGCNTAYGARGC 核心片段
HDR-R GCDATYTTRTTNCCNGGNCCDAT
HDR-3-OUT TGGGTATCAAAGGTCTGGAACA 3’RACE
HDR-3-IN GTGATTACATTCTTGGAGGGC
HDR-5-OUT ATAGCATCTTGCCGCTCCTGAGTC 5’RACE
HDR-5-IN CTACTCCATGTTTTCGCATC
HDR-CDS-S ATACCCGGGCCCGGGATGGCGCTTTCACTCGCCGGTTT 全长
HDR-CDS-R GCCTGCAGCTATGCTGTTTGCAGGACTTCCTCAT
HDR-RTS ACGATGCTCAAGACTGAGACAG
HDR-RTR ATTCCACCCACCAACAACGA
β-actin-RTS GGTATTGTGTTGGATTCCG
QRT-PCR
β-actin-RTR TGAGTAGCCCCTCTCTGTGAG

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HDR-S 和 HDR-R 进行 PCR 扩增。PCR 反应体系为
25 μL，其中正反向引物各 1.5 μL，模板 cDNA 2 μL，
Taq 酶（5 U/μL）0.25 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，
10×PCR 缓冲液 2.5 μL，用 ddH2O 补充至总体积
25 μL；反应程序为 94 ℃、5 min，94 ℃、45 s，60
℃、45 s，72 ℃、1 min，35 个循环；72 ℃、10 min。
PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，根据 DNA
胶回收试剂盒说明书对目的片段进行回收，然后连
接克隆载体 pMD18-T，转化大肠杆菌 DH5α 感受态
细胞，经 LB 固体培养基过夜培养后，挑取单菌落
经菌液 PCR 鉴定后委托上海生工进行测序。
2.4 DoHDR基因的RACE扩增及全长 cDNA序列
的获得
参照 TaKaRa 3’-Full RACE Kit和 5’-Full RACE
Kit说明书将铁皮石斛总RNA分别反转录成cDNA；
按照 TaKaRa 3’RACE 和 5’RACE 试剂盒说明书，
以及已得到的核心片段序列，使用 Primer Premier
5.0 设计 3’RACE 和 5’RACE 反应所需的巢式引物
HDR-3-OUT、HDR-3-IN、HDR-5-OUT、HDR-5-IN
（表 1）；分别对 HDR 基因的 3’和 5’端进行 PCR 扩
增，PCR 产物的回收，TA 克隆与测序方法均同“2.3”
项。测序完成后利用 DNAMAN 软件将 HDR 基因
的核心片段、3’和 5’端序列进行拼接，获得该基因
的全长 cDNA 序列。
根据拼接得到的全长序列，分别在 5’和 3’端设计
带 有 酶 切 位 点 的 特 异 性 引 物 HDR-CDS-S 、
HDR-CDS-R（表 1），进行 PCR 扩增获得到目的基因，
PCR 产物的回收，TA 克隆与测序方法均同“2.3”项。
2.5 DoHDR 基因的序列分析
将所获得的 DoHDR 基因编码的氨基酸序列在
GenBank 数据库中进行 Blast P 比对分析，利用
DNAMAN对其他物种的HDR基因编码的氨基酸序
列进行同源性分析。通过 MEGA6.0 软件中的
Neighbor-Joining 法构建 DoHDR 与其他物种 HDR
蛋白的系统进化树。
2.6 DoHDR 基因的表达分析
将脱落酸（abscisic acid，ABA）和水杨酸
（salicylic acid，SA）母液滤过除菌溶于已高温灭菌
的 MS 培养液中分别得到终浓度为 100 μmol/L 的
ABA 和 SA 培养液。取相同时期的铁皮石斛原球茎
分别转入 ABA 和 SA 培养液中，经悬浮培养后，分
别在 0、4、8、12、24、48、72 h 取样，立即放入
液氮中速冻，并移至−80 ℃冰箱保存备用。
采用 RNAprep Pure Plant Kit（Tiangen）说明书
分别提取保存样品的总 RNA，同种方法分别提取铁
皮石斛原球茎、根、茎、叶总 RNA；利用超微量分
光光度计检测 RNA 浓度和质量。将上述的总 RNA
用 PrimeScriptTM RT Reagent Kit（TaKaRa）反转录
成 cDNA。以持家基因 β-actin[16]（β-actin-RTS 和
β-actin-RTR，表 1）为内参，检测 DoHDR 基因的
相对表达量。根据 HDR 基因的全长 cDNA 序列采
用 Primer Premier 5.0 设计实时荧光定量 PCR 引物
HDR-RTS、HDR-RTR（表 1）。实时荧光定量 PCR
采用 20 μL 反应体系：10 μL SYBR® Premix Ex
TaqTM II（2×），2 μL cDNA，0.8 μL HDR-RTS 和
HDR-RTR；反应程序为：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，
60 ℃、34 s，40 个循环。试验进行 3 次重复；结果
采用 2−ΔΔCt 法来计算基因相对表达量。
3 结果与分析
3.1 DoHDR 基因全长的克隆
以铁皮石斛总 RNA 反转录的 cDNA 为模板，
用简并引物 HDR-S、HDR-R 扩增得到 1 条约 850 bp
的 PCR 产物，扩增产物符合引物设计的大小（图
1-A）。胶回收产物经 TA 克隆和测序分析得到该基
因核心片段，长度为 851 bp，将该片段在 NCBI 的
数据库中进行 Blast 分析，发现该序列与其他植物
的 HDR 的核酸序列相似度较高，可见获得的片段
为石斛 HDR 基因的核心片段。
根据已经获得的铁皮石斛 HDR 基因核心区
段的 DNA 序列设计 3’RACE 和 5’RACE 引物，
进行 PCR 扩增，获得 HDR 基因的 3’端 923 bp（图
1-B）和 5’端 893 bp（图 1-C）。在此基础之上，
以铁皮石斛的 cDNA为模板进行HDR基因的全长
扩增，得到 cDNA 全长，为 1 658 bp（图 1-D）。
通过开放阅读框（ORF）软件分析，结果显示拼
接序列具备完整基因的序列，ORF 长度为 1 383
bp，编码 460 个氨基酸，命名为 DoHDR，并提交
GenBank 数据库（登录号 KC344827）。
3.2 DoHDR 氨基酸序列的同源性分析和系统进化
关系分析
对铁皮石斛 DoHDR 基因编码的氨基酸序列在
NCBI 上进行 Blast P 比对，通过 DNAMAN 软件与
多种植物进行比对分析（图 2），比对结果表明
DoHDR 氨基酸序列与土沉香（AHE93332）、橡胶
树（ACG55683）、长春花（ABI30631）、银杏
（ABC84344）等植物的同源性分别 74.26%、73.84%、
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M-Marker 1-核心片段产物 2-3’RACE 产物 3-5’RACE 产物 4-全长 cDNA 扩增
M-Marker 1-core fragment product 2-3’RACE product 3-5’RACE product 4-full-length cDNA
图 1 DoHDR 基因全长 cDNA 克隆
Fig. 1 Clone of full-length cDNA of DoHDR gene

▲-半胱氨酸残基保守位点
▲-conserved cysteine residues
图 2 铁皮石斛与其他植物 HDR 氨基酸序列同源性比对
Fig. 2 Homologous comparison of amino acid sequence of HDR in D. officinale and other plants

1 000 bp
1 000 bp
1 000 bp
2 000 bp
1 000 bp
M 1 M 2 M 3 M 4
A B C D
土沉香
长春花
银杏
橡胶树
萝芙木
蓖麻
铁皮石斛
相同片段
土沉香
长春花
银杏
橡胶树
萝芙木
蓖麻
铁皮石斛
相同片段 土沉香
长春花
银杏
橡胶树
萝芙木
蓖麻
铁皮石斛
相同片段 土沉香
长春花
银杏
橡胶树
萝芙木
蓖麻
铁皮石斛
相同片段

土沉香
长春花
银杏
橡胶树
萝芙木
蓖麻
铁皮石斛
相同片段

土沉香
长春花
银杏
橡胶树
萝芙木
蓖麻
铁皮石斛
相同片段

土沉香
长春花
银杏
橡胶树
萝芙木
蓖麻
铁皮石斛
相同片段

土沉香
长春花
银杏
橡胶树
萝芙木
蓖麻
铁皮石斛
相同片段

51
48
60
48
48
48
46


111
108
120
108
108
108
106


171
168
180
168
168
168
166


231
228
240
228
228
228
226


291
288
300
288
288
288
286


351
348
360
348
348
348
346


411
408
420
408
408
408
406


464
461
473
461
461
461
459
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71.73%、70.68%，说明 HDR 基因在进化过程中
较为保守。与其他植物多序列比对后发现（图 2），
DoHDR 与其他参与比对的植物一致，都含有 4
个保守的半胱氨酸残基活性位点，这些活性位点
被认为可能参与催化底物还原过程中铁硫键的
形成[16]。
利用 MEGA6.0 软件中的 Neighbor-Joining 方
法，对推测蛋白 DoHDR 与 GenBank 记载登录的
16 个植物的 HDR 蛋白之间构建系统进化树，进
行聚类分析。结果表明，不同来源的 HDR 蛋白属
不同的进化分支，裸子植物、单子叶植物及双子
叶植物 HDR 之间有较为清晰的界限。铁皮石斛与
文心兰 Oncidium Gower Ramsey 同为兰科植物，
亲缘关系最为接近，其次和同是单子叶植物的水
稻 Oryza sativa indica Group、玉米 Zea mays L.、
高粱 Sorghum bicolor (Forssk.) Stapf 聚为一类，由
此可见植物 HDR 蛋白的分子进化关系与传统植
物分类中的进化关系较为一致（图 3）。

图 3 铁皮石斛与其他植物 HDR 氨基酸的系统进化树
Fig. 3 Phylogenetic tree analysis of HDR in D. officinale and
other plants
3.3 DoHDR 基因在铁皮石斛中的组织特异性表达
分析
以铁皮石斛的原球茎、根、茎、叶为材料，选
择持家基因β-actin[16]为内参，对不同组织中DoHDR
基因表达水平进行实时荧光定量 PCR 检测。结果显
示 DoHDR 在铁皮石斛各组织中都有表达，且表达
量依次为叶＞根＞茎≈原球茎（图 4）；其中在叶中
DoHDR 表达量高达原球茎中的 2.7 倍。
3.4 ABA 和 SA 处理对 DoHDR 表达量的影响
ABA 和 SA 是非常重要的植物激素，同时也
是植物体内重要的信号分子，不仅可提高植物抗逆
性，调节植物生长，而且可有效诱导萜类和酚酸类
等次生代谢物质的合成积累。实验结果表明（图 5、
6），DoHDR 表达量在 2 种处理后的趋势都是先上升
后下降；在 8 h 后 DoHDR 基因表达量均显著升高；
且 48 h 均达到峰值，ABA 和 SA 处理 48 h 的DoHDR
表达量与对照比较分别升高了 6.3、3.3 倍；但在 72 h
DoHDR 基因表达量均出现了下降的趋势。
4 讨论
铁皮石斛是我国兰科石斛属中珍稀濒危特有种，
具有重要的药用成分和药理活性，其中萜类物质是
铁皮石斛的主要药效成分之一。本研究从铁皮石斛

图 4 DoHDR 基因在铁皮石斛中的组织特异性表达分析
Fig. 4 Tissue-specific expression of DoHDR in D. officinale

图 5 ABA 处理对 DoHDR 表达量的影响
Fig. 5 Effect of ABA on expression of DoHDR

图 6 SA 处理对 DoHDR 表达量的影响
Fig. 6 Effect of SA on expression of DoHDR
3

2

1

0
原球茎 根 茎 叶
相
对
表
达
量

8
6
4
2
0
相
对
表
达
量

0 4 8 12 24 48 72
t/h
0 4 8 12 24 48 72
t/h
4
3
2
1
0
相
对
表
达
量

番茄
马铃薯
本氏烟
甘薯
萝芙木
长春花
拟南芥
铁皮石斛
文心兰
水稻
玉米
高粱
银杏
红豆杉
云杉
火炬松
赤松
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中克隆出萜类化合物生物合成 MEP 途径上最后一
个关键酶基因——DoHDR。HDR 被认为是 MEP
途径的最后一个限速酶，在 MEP 途径中起着关键
的调节代谢流的作用[17]；而且其表达量的变化直
接影响到萜类代谢物的产量。研究表明，DoHDR
全长 1 658 bp，编码了 460 个氨基酸；序列比对
分析结果表明 DoHDR 与其他植物的 HDR 具有很
高的同源性，保守结构域分析显示 DoHDR 为一
多结构域蛋白，属 LYTB 蛋白家族，结构域中包
括保守的半胱氨酸残基活性位点、底物结合位点
和催化位点。
本研究表明，DoHDR 在铁皮石斛的不同组织
中均有表达，但存在一定的表达差异。DoHDR 在
叶、根与茎的表达量分别为对照（原球茎）的 2.7、
1.9、1.1 倍，在叶中表达量最高，这与其在甘薯中
HDR 基因的表达特征较为一致[18]，而在银杏[19]和
橡胶[11]中，HDR 在根部表达量显著高于茎与叶片
中，这说明相同基因在不同植物的不同组织部位中
的表达量存在很大的差异，而同一植物不同组织部
位的萜类代谢物的类型和量也存在很大的区别。已
有研究表明，信号分子可诱导 HDR 基因的表达，
实验中，经 ABA 和 SA 处理后 DoHDR 的表达呈现
短时间内显著升高然后下降的趋势，这与在茶树中
经 ABA 和 SA 处理后 HDR 表达量总体变化趋势相
似[20]；经两种信号物质处理后 DoHDR 表达量 8 h
后开始显著上调，48 h 达到峰值，72 h 又显著下调，
这与在喜树中施用水杨酸后 HDR 的表达量也在 72
h 显著下调一致[12]。综上所述，表明 DoHDR 的表
达受 ABA 和 SA 调控。研究 DoHDR 在铁皮石斛植
物不同器官中的表达特征及其在不同处理条件下的
基因表达变化对探究其参与合成的萜类物质代谢具
有指导作用。
参考文献
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