全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 12期 2016年 6月

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• 药剂与工艺 •
山楂、泽泻、决明子与红曲霉混合发酵制备调血脂中药工艺研究
杨静云，赖永勤，李宇兴，杨思源，李学如*，黄新河
西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 610031
摘 要：目的 以药食两用调血脂中药山楂 Crataegi Fructus、泽泻 Alismatis Rhizoma和决明子 Cassiae Semen等为培养基组
分，以实验室筛选的产洛伐他汀（Lovastatin）的红曲霉 Monascus purpureus 为菌种，对制备既含有传统中药降脂成分又含
有他汀类降脂药物的天然降脂中药的固态发酵工艺进行探索与研究。方法 通过单因素试验和正交试验优化固态发酵工艺，
用 TLC和 HPLC分析方法对发酵产物有效成分进行定性和定量分析。结果 实验获得的混合发酵制备调血脂中药优化工艺
条件为 500 mL三角瓶装量 100 g固态培养基，接种培养 48 h的液态种子 10 mL，30 ℃恒温培养 2 d后，打散培养基，第 3
天加入培养基干基质 24%的无菌水，5 d后温度降至 25 ℃继续培养至 18 d，洛伐他汀产量可达 5.127 mg/g，较优化前提高
124.8%。TLC 和 HPLC 分析结果显示：与大米红曲比较，获得中药红曲发酵产物含有更多有效成分，洛伐他汀产量提高
42.27%，但 γ-氨基丁酸产量下降 17.89%；与未发酵基质比较，中药发酵产物中中药的有效成分熊果酸、2,3-乙酰泽泻醇-B、
大黄酚和大黄素甲醚分别提高了 232.7%、173.7%、767.6%和 888.4%。结论 山楂、泽泻和决明子经红曲霉菌固态发酵后，
除能显著提高调血脂有效成分的量外，还能提高中药有效成分的量，获得的调血脂中药发酵工艺具有一定的实际应用价值。
关键词：山楂；泽泻；决明子；红曲霉；药食两用中药；降脂中药；混合发酵；固态发酵；洛伐他汀；正交试验；熊果酸；
2,3-乙酰泽泻醇-B；大黄酚；大黄素甲醚
中图分类号：R283.1 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)12 - 2100 - 08
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.12.014
Preparation process of lipid-lowering medicines by solid state fermentation of
Crataegi Fructus, Alismatis Rhizoma, and Cassiae Semen mixed with monascus
YANG Jing-yun, LAI Yong-qin, LI Yu-xing, YANG Si-yuan, LI Xue-ru, HUANG Xin-he
School of Life Science, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China
Abstract: Objective To obtain a new lipid-lowering product that combines the advantages of lipid-lowering Chinese materia medica
(CMM) and statin drugs. Solid-state fermentation was studied using medicinal and edible CMM as media components, Lovastatin
yielding monascus screened in our laboratory was used as strain and Lovastatin yielding was used as index. Methods Solid-state
fermentation was optimized by single factor and orthogonal test, qualitative and quantitative analysis was conducted of the product via
TLC and HPLC. Results The optimal fermentation conditions contained 100 g/solid medium in 500 mL flask bottling capacity,
material thickness of 2.5 cm, 10 mL liquid seed of 48 h, 10% inoculation volume, incubating at 30 ℃, breaking up the medium on day
2, adding 24% sterile water on day 3, cooling to 25 ℃ and culturing for 18 d in total, and Lovastatin yielding was up to 5.127 mg/g.
Fermentation product of CMM contained more components compared with that without medicines, Lovastatin yielding increased by
42.27%, but γ- aminobutyric acid yielding decreased by 17.89%. Contents of main active ingredients ursolic acid, 2,3-acetyl alisol-B,
chrysophanol, and physcion were increased by 232.7%, 173.7%, 767.6%, and 888.4%. Conclusion Active ingredients of hawthorn,
alisma, and cassia are released into the products after fermentation and contents of lipid-lowering active ingredients were improved
significantly, new active ingredients are also noticed. Therefore, the fermentation process of lipid-lowering medicines obtained in this
experimental study has some practical values.

收稿日期：2016-02-28
基金项目：四川省科技支撑项目资助（2012FZ0048）；成都市科学技术局科技惠民技术研发项目（2015-HM01-00047-SF）
作者简介：杨静云（1990—），男，四川省资阳人，硕士研究生，生物化学与分子生物学专业。Tel: 15202827549 E-mail: 1186769004@qq.com
*通信作者 李学如，教授，研究方向为微生物代谢产物。
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Key words: Crataegi Fructus; Alismatis Rhizoma; Cassiae Semen; monascus; medicinal and edible medicine; lipid-lowering medicine;
mixed fermentation; solid state fermentation; Lovastatin; orthogonal test; ursolic acid; 2,3-acetyl alisol-B; chrysophanol; physcion

高脂血症引发心脑血管疾病已成为危害人类健
康的首要因素[1]。研究证实，调血脂药物的应用可
减少 24%的心脏病死亡率和 19%的非致死性心脏病
发作率[2]，目前临床上最为广泛使用的调血脂药物
是他汀类（statin）药物，即 3-羟基-3-甲基戊二酰辅
酶 A 还原酶（HMG-CoA）抑制剂，该类药物能有
效抑制胞内胆固醇合成早期限速酶还原酶，从而减
少胞内游离胆固醇，加速血液中低密度脂蛋白的清
除[3]。近年来，随着调血脂中药研究的不断深入，
中药具有多途径、多靶点的调血脂作用，能有效防
止动脉粥样硬化，且药效温和、不良反应少等优势，
受到越来越多研究和使用者的青睐[4]。已有的研究
证实，山楂中有效调血脂成分金丝桃苷和熊果酸，
可通过可逆的磷酸化和脱磷酸化过程，抑制 HMG-
CoA活性，起到调节体内脂代谢作用，同时，山楂
提取物能有效减轻动物肝脏内各类脂质沉积，显著
保护肝脏组织的生理生化功能，对高血脂和脂肪肝
具有明显的防治作用[5-8]。泽泻所含的三萜类化合物
可减少胆固醇合成原料乙酰辅酶A的生成而抑制胆
固醇合成[9]，程志红等[10]用 2种高脂血症模型大鼠
观察泽泻提取物调血脂作用，结果表明泽泻提取物
可抑制胆固醇在肠道的吸收而发挥作用。决明子所
含蒽醌类化合物能够加快肠蠕动，促进胆固醇的排
泄，减少脂类在肠道停留时间，从而减少外源性胆
固醇的吸收[11]；决明子提取物可使高脂血症模型大
鼠的血脂明显降低，显著升高高密度脂蛋白（HDL）
水平[12]。以产洛伐他汀的红曲霉为菌种发酵制备的
调血脂红曲米，除富含他汀类化合物洛伐他汀，还
含有红曲色素、麦角固醇和 γ-氨基丁酸（GABA）
等有效成分，具有调血脂、降血压、预防佝偻病等
功能[13]。本实验以药食两用调血脂中药山楂、泽泻、
决明子以及大米等为培养基组分，以实验室筛选的
产洛伐他汀的红曲霉为菌种，将传统调血脂中药与
现代发酵技术有机结合，筛选既含有传统中药调血
脂成分，又含有他汀类调血脂药物的天然调血脂中
药的固态发酵工艺。
1 仪器与材料
1260 Infinity高效液相色谱仪，美国安捷伦科技
有限公司；AR124CN 电子天平，上海奥豪斯仪器
有限公司；DHP-9162 恒温培养箱，上海齐欣科学
仪器有限公司；DHP-9030A鼓风干燥箱，上海精宏
实验设备有限公司；D3024R 高速离心机，美国赛
洛捷克有限公司；REPROSTAR 3型薄层色谱扫描
仪，瑞士卡玛公司；V-1100D 可见分光光度计，上
海美谱达仪器有限公司。
产洛伐他汀的红曲科红曲属紫色红曲霉
Monascus purpureus Went. M2，本实验室分离保存。
实验所用山楂（品种为山里红，产地河北）、泽泻（品
种为川泽泻，产地四川）和决明子（品种为小决明，
产地四川）均购买于成都市荷花池药材市场，经西
南交通大学生命科学与工程学院宋良科副教授鉴定
分别为蔷薇科山楂属植物山里红 Crataegus
pinnatifida Bge. var. major N. E. Br. 的干燥成熟果
实、泽泻科泽泻属植物泽泻 Alisma orientale (Sam.)
Juzep. 的干燥块茎和豆科决明属植物小决明 Cassia
tora L. 的干燥成熟种子；大米为市售广汉粳米，广
汉市绿丰大米加工厂。
对照品洛伐他汀（批号 100600-201003，质量
分数 99.4%）、大黄酚（批号 110796-201520，质量
分数 99.2%）、大黄素甲醚（批号 110758-201415，
质量分数 99.1%）和 2,3-乙酰泽泻醇 -B（批号
111846-201504，质量分数 99.0%）均由中国食品药
品检定研究院提供；对照品熊果酸（批号 77-52-1，
质量分数 98.0%）由四川先欣生化技术研究所提供；
对照品 GABA（批号 041023，质量分数 99.0%）由
上海源聚生物科技有限公司提供。甲醇和乙腈（色
谱纯）购自 Sigma公司。无水乙醇、硝酸钠、磷酸
二氢钾、硫酸镁、磷酸、甲醇、石油醚、醋酸乙酯、
甲酸、四硼酸钠、次氯酸钠溶液、苯酚，分析纯，
成都科龙化工试剂厂；甘油、蛋白胨、酵母膏，北
京奥博星生物技术有限责任公司。
2 方法与结果
2.1 培养基制备
2.1.1 麦芽汁斜面培养基 10°Bx麦芽汁、2%琼脂
粉，pH值自然。
2.1.2 液体种子培养基[14] 3%大米粉、3%葡萄糖、
1.5%蛋白胨、0.2% NaNO3、0.15% KH2PO4、0.1%
MgSO4·7H2O，pH值自然。
2.1.3 大米固态发酵培养基[14] 大米 50 g、0.4%
NaNO3、0.3% KH2PO4、0.3% MgSO4·7H2O、3%酵
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母膏、4%蛋白胨、3%甘油，pH值自然。
2.1.4 中药大米固态发酵培养基 在大米固态发酵
培养基中，根据实验要求按一定比例加入中药粉末
（60 ℃烘干后粉碎，过 50目筛）。
2.2 菌种和发酵培养方法
2.2.1 斜面种子培养 红曲菌 M2 接种斜面后，
30 ℃培养至菌丝长满斜面且转变为红色。
2.2.2 液态种子培养 液体种子培养基经 0.1 MPa
121 ℃灭菌 20 min，接种斜面种子，30 ℃ 200 r/min
摇瓶培养 48 h作为中药红曲固态发酵种子液。
2.2.3 中药红曲固态发酵 根据实验设计要求，将
大米、山楂、泽泻和决明子等培养基组分，按不同
比例配制成固态发酵培养基，经 0.1 MPa 121 ℃灭
菌 30 min，冷却至室温，接种液态种子，然后根据
实验要求进行恒温培养。
2.3 中药红曲固态发酵产物中有效成分测定
2.3.1 洛伐他汀测定方法[15]
（1）色谱条件：色谱柱为Welchrom TM C18柱
（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（75∶
25），体积流量为 1 mL/min，柱温为 22 ℃，检测波
长为 246 nm，进样量为 10.0 μL。
（2）线性关系及方法学考察：精密称取洛伐他
汀对照品，用 75%乙醇配制成质量浓度为 484.0
μg/mL的对照品溶液。按上述色谱条件分别以 2.0、
4.0、6.0、8.0、10.0 μL的进样量进样分析，以对照
品的进样量为横坐标（X），峰面积值为纵坐标（Y）
作图，得到洛伐他汀的标准曲线，线性回归方程为
Y＝2 269 X＋15.15，R2＝0.999 9，表明洛伐他汀在
5.01～42.38 μg/mL 时质量浓度与峰面积线性关系
良好。方法学考察表明，在本色谱条件下精密度
RSD为 0.29%（n＝6），重复性 RSD为 0.05%（n＝
6），36 h内稳定性 RSD为 0.78%（n＝6），平均回
收率为 98.4%，RSD为 1.88%（n＝6）。
（3）发酵产物中洛伐他汀定量测定：取 65 ℃
烘干的样品适量，研磨，过 200目筛，精确称取 0.5
g，75%乙醇溶液定容至 25 mL，超声 30 min，8 000
r/min离心 3 min，上清即为样品溶液，然后按上述
方法测定洛伐他汀的量。
2.3.2 GABA的测定
（1）GABA标准曲线制作：精密称取 GABA对
照品配置 1 mg/mL标准液，然后按文献方法[16]进行
操作，获得 GABA标准曲线，回归曲线方程为 Y＝
0.421 1 X＋0.031 5，R2＝0.999 1，结果表明 GABA
在 0.78～6.87 μg/mL线性关系良好。
（2）发酵产物中 GABA定量测定：精确称取按
“2.3.1（3）”项方法制得中药红曲细粉 0.5 g，以去
离子水定容至 25 mL，浸提过夜，取一定量浸提液，
沸水浴 5 min，冷却后 12 000 r/min离心 15 min，取
上清 1 mL于 50 mL量瓶中，定容后混匀，取 1 mL，
按标准曲线测定方法测定发酵液中 GABA的量。
2.3.3 熊果酸的测定[17]
（1）色谱条件：色谱柱为 WelchromTM C18柱
（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷
酸水溶液（85∶15），体积流量为 0.8 mL/min，柱温
为室温，检测波长为 210 nm，进样量 10.0 μL。
（2）线性关系及方法学考察：精确称取熊果酸
对照品用色谱甲醇配制为质量浓度 465.0 μg/mL溶
液。按上述色谱条件分别以 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0
μL的进样量进样分析。以对照品的进样量为横坐标
（X），峰面积值为纵坐标（Y）作图，得到回归方程
为 Y＝478.9 X＋8.883，R2＝0.999 9，表明熊果酸在
3.25～64.92 μg/mL 时质量浓度与峰面积线性关系
良好。方法学考察表明，在本色谱条件下精密度
RSD为 0.34%（n＝6），重复性 RSD为 0.26%（n＝
6），24 h内稳定性 RSD为 1.23%（n＝6），平均回
收率为 98.76%，RSD为 1.38%（n＝6）。
（3）发酵产物中熊果酸定量测定：精确称取按
“2.3.1（3）”项方法制得中药红曲细粉 0.5 g，精确
称取 0.5 g，甲醇溶液定容到 25 mL，超声 30 min，
8 000 r/min离心 5 min，上清即为样品溶液，然后按
上述方法测定熊果酸的量。
2.3.4 2,3-乙酰泽泻醇-B的测定[18]
（1）色谱条件：色谱柱为WelchromTM C18柱（250
mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸水
溶液（85∶10），体积流量为 0.8 mL/min，柱温为室
温，检测波长为 210 nm，进样量 10.0 μL。
（2）线性关系及方法学考察：用乙腈溶解 2,3-
乙酰泽泻醇-B对照品配制质量浓度为 272.0 μg/mL
的对照品溶液，分别以 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μL
的进样量进样分析，按色谱条件测定峰面积。以对
照品的进样量值为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）
作图，得到 2,3-乙酰泽泻醇-B 的标准曲线为 Y＝
476.19 X＋2.714，R2＝0.999 9，2,3-乙酰泽泻醇-B
在 0.33～3.98 μg/mL时质量浓度与峰面积线性关系
良好。方法学考察表明，在本色谱条件下精密度
RSD为 0.80%（n＝6），重复性 RSD为 0.63%（n＝
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6），36 h内稳定性 RSD为 1.57%（n＝6），平均回
收率为 98.76%，RSD为 1.05%（n＝6）。
（3）发酵产物中 2,3-乙酰泽泻醇-B定量测定：
精确称取按“2.3.1（3）”项方法制得中药红曲细粉
0.5 g，置于磨口瓶中，加入乙腈 4 mL，超声 30 min，
室温放冷，8 000 r/min离心 5 min，上清液即为样品
溶液，然后按上述方法测定 2,3-乙酰泽泻醇-B的量。
2.3.5 大黄酚和大黄素甲醚的测定[19]
（1）色谱条件：色谱柱为WelchromTM C18柱（250
mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.1%磷酸水
溶液（82∶18），体积流量为 1.0 mL/min，柱温为
30 ℃，检测波长为 254 nm，进样量 10.0 μL。
（2）线性关系及方法学考察：精密称取大黄酚
和大黄素甲醚对照品，用甲醇溶解配制质量浓度分
别为 72.0 μg/mL的大黄酚对照品溶液和 34.0 μg/mL
的大黄素甲醚对照品溶液。按上述色谱条件分别以
2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μL的进样量进样分析，以
进样量为横坐标（X），峰面积值为纵坐标（Y）作
图，得到大黄酚、大黄素甲醚的标准曲线回归方程
分别为 Y＝715.00 X＋0.123，R2＝0.999 9；Y＝382.0
X＋0.172，R2＝0.999 9，分别在 7.08～71.50 μg/mL
和 7.78～79.20 μg/mL 时质量浓度与峰面积线性关
系良好。方法学考察表明，在本色谱条件下大黄酚、
大黄素甲醚精密度 RSD分别为 0.10%、0.24%（n＝
6），重复性 RSD分别为 0.70%、0.48%（n＝6），24
h内稳定性 RSD分别为 0.89%、1.05%（n＝6），平
均回收率分别为 98.83%、98.86%，RSD 分别为
1.02%、1.13%（n＝6）。
（3）发酵产物中大黄酚和大黄素甲醚定量测
定：精确称取按“2.3.1（3）”项方法制得中药红曲
细粉 1 g，加入 25 mL甲醇，加热回流 0.5 h，滤过，
滤液减压蒸干，残渣加 15 mL体积分数为 8%的盐
酸溶液溶解，再加 20 mL氯仿，回流 1 h，放冷，
置分液漏斗中，取氯仿层，酸液再用氯仿提取 3次，
每次 20 mL，合并氯仿液，减压蒸干，加甲醇溶解，
转移至 25 mL量瓶中，定容，摇匀、滤过，上清即
为样品溶液，然后按上述方法测定大黄酚和大黄素
甲醚。
2.4 培养基中中药配比的确定
按大米与中药的不同比例配制培养基，根据灭
菌前后培养基状态，发酵状况和发酵后洛伐他汀的
量，确定大米与中药的配比，当确定大米与中药配
比后，按不同比例加入山楂、泽泻、决明子制备培
养基，根据培养基状态、发酵情况和发酵后洛伐他
汀的量确定 3种中药在培养基中的比例。
传统中药红曲是以大米为原料通过固态发酵红
曲霉菌制得，虽然调血脂中药山楂、泽泻和决明子
含有丰富糖类物质，可被红曲霉菌作为有效碳源，
但研究结果表明大米与中药（山楂-泽泻-决明子 1∶
1∶1）比例为 9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5时洛
伐他汀产量分别为 2.489、2.447、2.438、2.435、1.772
mg/g），当培养基中大米与中药比例为 5∶5时，中
药粉末不能完全黏附在米饭颗粒上，影响中药发酵，
使得产品中洛伐他汀的量显著降低；大米干质量与
中药干质量比为 6∶4时，米饭粒能够充分黏附中药
粉末，灭菌后，培养基松散，软硬适中，三角瓶底
部没有散落中药粉。大米与中药配比为 9～7∶1～3
发酵产物中洛伐他汀的量相当，为了保证在培养基
中尽可能多添加降脂中药山楂、泽泻和决明子，因
此本实验选择固态发酵培养基中大米与中药配比为
6∶4。
在确定培养基中大米与中药比例为 6∶4之后，
进一步对培养基中山楂-泽泻-决明子比例（2∶1∶
1、1∶2∶1、1∶1∶2 时洛伐他汀分别为 2.437、
2.018、1.356 mg/g）进行了研究，结果表明当山楂、
泽泻、决明子配比为 2∶1∶1时，培养基中菌丝生
长较快，且洛伐他汀产量较高，因此在本实验后续
研究中，中药固态混合发酵培养基中大米、山楂、
泽泻和决明子配比采用 6∶2∶1∶1的比例。
2.5 红曲固态发酵工艺优化
在确定了培养基中大米、山楂、泽泻和决明子
加入量及比例后，以洛伐他汀产量为指标，对中药
红曲固态发酵过程中培养基 pH 值，培养过程中打
散时间，红曲菌种子的种龄、接种量，培养基装量，
发酵过程中的补水量，变温培养和培养时间等工艺
参数进行了研究，以期获得中药红曲固态发酵合适
工艺条件。
2.5.1 发酵培养基合适 pH 值的确定 沈平等[14]与
王龙等[20]研究红曲霉菌大米固态发酵时发现，酸性
环境有利于霉菌菌丝生长和代谢产物洛伐他汀的积
累。本实验用乙酸将中药大米固态培养基调配成不
同 pH 值，接种红曲霉菌发酵后测定产物中洛伐他
汀的量，结果 pH值分别为 3.0、3.5、4.0、4.5、pH
自然（5.25）时洛伐他汀分别为 2.240、2.627、2.820、
2.700、2.560 mg/g，表明 pH 值对中药红曲发酵代
谢产物洛伐他汀形成具有显著的影响，其中培养基
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pH值为 4.0时，发酵产物中洛伐他汀产量最高，达
到 2.820 mg/g，说明中药红曲发酵培养基合适 pH
值为 4.0。
2.5.2 打散时间的影响 丝状真菌固态发酵过程
中，随着菌丝的不断生长，培养基与菌丝之间会结
块，培养基结块后会导致通气不畅，进而影响菌体
的生长和代谢产物的形成。在丝状真菌固态发酵的
早期，合适的时候将结块的培养基打散，不但能起
到使培养基通气畅通，而且更主要的是将菌丝打断
更有利于菌体的生长繁殖与后期代谢产物的形成。
本实验在考察固态发酵不同时间打散培养基时发
现，接种后第 1天菌丝生长较少，打散后菌丝生长
缓慢；第 2天菌丝生长较多，培养基较易打散；随
着时间增加，菌丝生长越多，结块的培养基打散越
困难，培养 5 d以后结块培养基甚至根本不能打散。
结果培养基打散时间为 1、2、3、4 d时，洛伐他汀
的量分别为 2.681、3.203、3.000、2.206 mg/g，表
明第 2天打散结块的发酵培养基，发酵样品中洛伐
他汀产量最高，达到 3.203 mg/g，过早或过晚打散
培养基都将导致洛伐他汀产量下降，与王启军等[21]
研究结果过早或过频地翻曲会影响菌体的初期生
长，损伤菌丝体相一致。在实验过程中还发现，中
药大米固态发酵培养基较大米固态培养基菌丝生长
更快，若在发酵早期不及时打散结块的培养基，后
期将无法打散而影响发酵产物的形成。
2.5.3 正交试验优化种子的种龄、接种量、培养基
装量、补水量 按 4 因素 3 水平的 L9(34)正交表进
行正交试验，以发酵产物中洛伐他汀的产量为指标，
确定种子的种龄、接种量和培养基的装量及加水量
等中药固态发酵的合适条件。种龄、接种量、装量、
补水量正交试验设计与结果如表 1所示。极差（R）
分析显示，4 个因素对洛伐他汀产量的影响大小依
次为种龄＞补水量＞接种量＞装量，其中种龄影响
最大，其次为补水量，而培养基装量影响最小。正
交试验第 6号实验条件（48 h的种龄，15%的接种
量，80 g的装量和 24%的补水量）发酵的红曲发酵
产物中洛伐他汀产量为最高，达到 3.751 mg/g。由
于 15%和 10%的接种量对洛伐他汀产量影响较小，
接种量越大会增加种子生产成本，所以选择 10%接
种量；正交试验结果培养基装量对洛伐他汀产量影
响 K2＞K3＞K1，所以培养基装量选择 100 g。综上
分析结果获得中药红曲固态发酵合适的菌种种子种
龄为 48 h，接种量 10%，装量 100 g，补水量 24%。
表 1 正交试验设计与结果
Table 1 Design and results of orthogonal test
试验号 种龄/h 接种量/% 装量/g 补水量/%
洛伐他汀产
量/(mg·g−1)
1 24 5 80 16 2.766
2 24 10 100 24 3.341
3 24 15 120 32 2.981
4 48 5 100 32 3.303
5 48 10 120 16 3.400
6 48 15 80 24 3.751
7 72 5 120 16 3.011
8 72 10 80 32 2.827
9 72 15 100 24 2.985
K1 3.029 3.026 7 3.115 3.059
K2 3.485 3.189 3.21 3.359
K3 2.941 3.239 3.131 3.037
R 0.544 0.212 3 0.095 0.322

2.5.4 变温时间对中药红曲发酵的影响 微生物生
长繁殖与次生代谢产物的形成过程中所参与的生物
酶种类及其所需酶活性往往是不一致的，在发酵工
业中通常采用调节培养温度的方法来达到既满足微
生物生长繁殖又能提高微生物次生代谢产物产量的
目的。中药红曲发酵培养过程中变温时间对洛伐他
汀产量的影响结果表明，变温培养时间 3、4、5、6、
7、8 d时洛伐他汀产量分别为 2.367、3.240、4.314、
4.054、3.433、3.160 mg/g，中药红曲固态培养基接
种后，30 ℃恒温培养不同时间，转到 25 ℃继续恒
温培养到 12 d，发酵产物中洛伐他汀产量存在差异。
以接种后30 ℃恒温培养到第5天转到25 ℃继续恒
温培养到 12 d 洛伐他汀产量最高，达到了 4.314
mg/g，分别比接种后 30 ℃培养到第 3天和第 8天
转到 25 ℃继续恒温培养到 12 d 增加 82.26%和
36.52%。与文献所报道大米红曲的分阶段变温培养
结果一致[22]。
2.5.5 固态发酵培养时间的确定 在最优条件下进
行固态发酵，自第 6天起隔天取样测定发酵产物中
洛伐他汀的量，实验结果显示，培养 6、8、10、12、
14、16、18、20、22 d时洛伐他汀产量分别为 1.853、
2.867、3.727、4.334、4.674、4.932、5.127、5.118、
5.123 mg/g），随着培养时间的增加，发酵产物中有
效成分洛伐他汀产量逐渐增加，当培养到 18 d时，
洛伐他汀产量达到 5.127 mg/g，较优化前的 2.280
mg/g 提高 124.8%，继续培养发酵产物中洛伐他汀
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 12期 2016年 6月

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产量几乎不再增长，因此中药红曲发酵合适培养时
间为 18 d。
2.6 中药红曲固态发酵产物有效成分分析
2.6.1 中药红曲固态发酵产物成分 TLC 分析 按
文献方法[23]稍作修改，分别取大米红曲 1.0 g，中药
红曲固态发酵产物 1.0 g，山楂、泽泻和决明子 2∶
1∶1混合物 1.0 g，加入甲醇 50 mL，超声处理 30
min，滤液蒸干，加甲醇 1 mL溶解，作为样品溶液，
以石油醚-醋酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）为展开剂展
开，分别于日光、365 nm波长紫外光和氨气熏蒸后
检视薄层板。从图 1所示实验结果可以看到，在紫
外光（图 1-A）和日光（图 1-B）下，清晰可见中
药红曲（图 1-A-2和图 1-B-2）和大米红曲（图 1-A-3
和图 1-B-3）有多个对应点，中药红曲固态发酵产
物样品斑点数明显多于大米红曲，说明其中含有更
多成分。特别是在薄层板溶剂前沿附近，中药红曲
固态发酵产物样品有 1 个明亮黄色荧光点（图
1-A-2），而在大米红曲（图 1-A-3）和中药混合药
材（图 1-A-4）样品中都没有出现，该物质据推测
可能是在中药红曲固态发酵过程中，经过红曲菌生
物转化产生新的物质，或者是中药中被释放出来的
某一成分。为了进一步鉴定中药红曲固态发酵产物
中多出的发黄色荧光物质，将大黄酚对照品、大米
红曲、中药红曲固态发酵产物、中药混合样品点样
在同一硅胶 G板上，紫外光 365 nm下发现中药红
曲固态发酵产物中多出的点与大黄酚对照品的黄色
荧光点对应（图 1-A）；日光下，观察结果与紫外光
365 nm 下一致（图 1-B）；经氨蒸汽熏蒸，中药红
曲固态发酵产物中多出的点同变为粉红色，与大黄
酚一致（图 1-C），因此推测在中药红曲固态发酵样
品中增加的产物可能是大黄酚，而未发酵中药混合
样没有出现对应斑点，可能是因为在该提取条件下
该成分没有被提取出来或其量太低，进一步说明中
药经红曲霉发酵后中药有效成分的量得到提高。
2.6.2 中药红曲固态发酵产物与大米红曲中洛伐他
汀和 GABA 比较 按照“2.3”项中药红曲固态发
酵产物中有效成分测定的方法，对中药红曲固态发
酵产物和大米红曲样品中洛伐他汀和 GABA 的量
进行了分析，结果表明分别为洛伐他汀 5.127、3.677
mg/g，GABA 34.114、41.548 mg/g，中药红曲固态
发酵产物中洛伐他汀产量较大米红曲高 42.27%，而
大米红曲中 GABA 产量高于中药红曲固态发酵产
物 21.79%，说明红曲固态发酵培养基中加入中药有


A-365 nm 紫外光 B-日光 C-氨气熏蒸后 1-大黄酚对照品
2-中药红曲固态发酵产物 3-大米红曲 4-中药混合样品
A-UV 365 nm B-in sunlight C-after ammonia fumigation
1-chrysophanol reference 2-fermentation product of CMMs
3-red yeast rice 4-mixture of CMMs

图 1 中药红曲 TLC图
Fig. 1 TLC of monascus

助于红曲霉菌洛伐他汀次生代谢产物的生成，中药
红曲固态发酵产物 GABA产量较大米红曲低，推测
可能是中药中某些成分对红曲霉菌 GABA 代谢物
合成有抑制效果。
2.6.3 中药红曲发酵前后各中药中调血脂成分的量
比较 已有的研究证实[6,9,12]，调血脂中药山楂、泽
泻和决明子的主要降脂成分分别为熊果酸、2,3-乙
酰泽泻醇-B、大黄酚和大黄素甲醚，为了弄清中药
红曲发酵是否会影响这些有效成分的量，本实验采
用“2.3”项中药红曲固态发酵产物中有效成分测定
的方法，对中药红曲发酵前后样品中各有效成分的
量进行分析，结果如表 2所示，中药红曲固态发酵
产物中各中药的主要成分的量均有较大的升高，熊
果酸的量较未发酵培养基升高 232.7%，2,3-乙酰泽
泻醇-B 的量升高 173.7%，升高最为明显的是大黄
酚和大黄素甲醚，与发酵前相比分别升高 767.6%和
888.4%。目前利用微生物发酵转化中药活性成分已
成为中药现代化研究的热门课题，已有文献报道所
涉及的中药主要有效成分包括黄酮类、生物碱、萜
类、皂苷类以及多酚类等[24-26]。戴万生等[27]将大黄
经酒精酵母、面包酵母发酵后，结合型蒽醌的量降
低，游离型蒽醌的量增加 6倍，与本实验中大黄酚
和大黄素甲醚的量提高 7.67倍和 8.88倍结果相近。
2.7 中药红曲固态发酵工艺中试规模验证试验
在确定按大米-山楂-泽泻-决明子以 6∶2∶1∶
1比例，培养基 pH值为 4，500 mL三角瓶装 100 g
培养基，灭菌后接种 48 h种子液 10 mL，30 ℃培
养 2 d后打散培养基，第 3天加入 24%无菌水，5 d
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
A B C
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 12期 2016年 6月

·2106·
后降温至 25 ℃继续培养至 18 d的中药红曲固态发
酵优化工艺后，在 1 000 mL三角瓶规模，对所优化
的中药红曲固态发酵工艺进行了 4 批次的验证试
验。4 批固态发酵实验获得的发酵产物中各成分的
量分析结果如表 3所示，结果显示，中试规模验证
试验各批次中洛伐他汀、GABA、熊果酸、2,3-乙酰
泽泻醇-B、大黄酚、大黄素甲醚的量均不低于优化
试验，说明该工艺重复性较好。

表 2 未发酵基质与发酵产物各有效成分的量对比
Table 2 Comparison on contents of active ingredients in unleavened products
名称
质量分数/(mg·g−1)
熊果酸 2,3-乙酰泽泻醇-B 大黄酚 大黄素甲醚
未发酵基质 1.459 0.057 0.290 0.164
中药红曲固态发酵产物 4.854 0.156 2.516 1.621
较未发酵基质提高比例/% 232.7 173.7 767.6 888.4

表 3 1 000 mL三角瓶固态发酵产物中各成分测定结果
Table 3 Contents of each ingredient in fermentation products cultured in 1 000 mL triangular flask
试验
质量分数/(mg·g−1)
洛伐他汀 GABA 熊果酸 2,3-乙酰泽泻醇-B 大黄酚 大黄素甲醚
优化试验 5.127 34.114 4.854 0.156 2.516 1.621
中试规模验证试验 1 5.273 35.012 4.874 0.161 2.534 1.632
2 5.078 34.358 4.893 0.172 2.732 1.627
3 5.236 34.732 4.937 0.157 2.521 1.703
4 5.315 34.826 4.856 0.160 2.538 1.715
均值 5.226 34.732 4.890 0.163 2.581 1.669

本实验研究获得的山楂、泽泻、决明子与红曲
霉混合发酵制备调血脂中药最优工艺为大米-山楂-
泽泻-决明子以 6∶2∶1∶1比例，培养基 pH值为 4，
灭菌后按 10%的接种量接种 48 h种子液，30 ℃培
养 2 d后打散培养基，第 3天加入 24%无菌水，5 d
后降温至 25 ℃继续培养至 18 d。该工艺无论是在
500 mL三角瓶还是 1 000 mL三角瓶规模所获得的
发酵产物有效成分的量稳定，因此本实验研究获得
的调血脂中药发酵工艺具有一定的实际应用价值。
3 讨论
本实验将他汀类降脂药物和传统降脂中药融为
一体，结合传统中药和现代发酵技术得以实现。以
传统药食两用降血脂中药为固态发酵培养基组分，
以实验室分离纯化的紫色红曲霉 M2菌株为菌种进
行固态发酵，得到 1种天然降脂产物。在发酵过程
中，红曲霉菌在利用中药中的糖类、蛋白等营养物
质进行生长繁殖和产生代谢产物的同时，还可以对
中药中的一些成分进行生物转化，并分解中药中某
些有毒成分，提高中药活性成分效价，降低中药的
某些毒性；另外，中药中的某些成分亦能促进红曲
霉菌的生长和活性代谢产物的产生。
在发酵产物中，中药材中各降脂有效成分得以
保留，同时也含有红曲代谢产生的具有调血脂、降
压功效的洛伐他汀、GABA等次级代谢产物，发酵
产物无需经过繁琐的提取过程，可直接使用。本实
验使用常见天然原材料，原料易得且价格较低；固
态发酵对设备要求低、能耗低、水消耗量少、无污
染、无废物产生；发酵产物无需复杂的提取分离过
程，可全部利用，进一步降低生产成本，具有实际
应用价值。以食用菌对天然中药进行转化，产生安
全的降脂产品，可以对未来降脂产品开发和应用具
有指导意义。发酵产物中成分复杂，后续研究应对
其进行有效成分种类和定量分析，并对其降脂效果
进行药效学评价。
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