全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 3 期 2015 年 2 月 ·348·
• 药剂与工艺 •
小菜蛾抗菌肽聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒的制备及体外评价
刘朝勇 1, 2，肖云芝 1, 2，李瑞生 2，李晓荣 1, 2，韩 晋 2*，袁海龙 2*
1. 成都中医药大学药学院，四川 成都 611137
2. 中国人民解放军第三○二医院，北京 100039
摘 要：目的 制备小菜蛾抗菌肽（CA）聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒（CA-PLGA-NPs），并对其理化性质及
体外释放度进行研究。方法 采用 S/W/O/W 复乳法结合高压均质法制备 CA-PLGA-NPs，对其纳米粒的形态、粒径、多分
散指数（PDI）、载药量、包封率和体外释放度进行研究。结果 CA-PLGA-NPs 呈球形或类球形，粒径、PDI、载药量、包
封率分别为（358.76±22.51）nm、0.168 1±0.012 2、（10.50±0.28）%、（60.92±1.58）%，突释现象不明显，2～10 d 内达
到释药稳定期。结论 S/W/O/W 复乳法结合高压均质法制备 CA-PLGA-NPs 工艺可行，为小菜蛾抗菌肽给药提供了制剂学
基础。
关键词：小菜蛾抗菌肽；S/W/O/W 复乳；高压均质；聚乳酸-羟基乙酸共聚物；载药量；包封率
中图分类号：R283.6 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)03 - 0348 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.03.008
Preparation and in vitro evaluation of antibacterial peptides from Plutella
xylostella poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles
LIU Chao-yong1, 2, XIAO Yun-zhi1, 2, LI Rui-sheng2, LI Xiao-rong1, 2, HAN Jin2, YUAN Hai-long2
1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China
2. 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China
Abstract: Objective To prepare the antibacterial peptides from Plutella xylostella-loaded nanoparticles based on poly(lactic-co-
glycolic acid) (CA-PLGA-NPs) and evaluate its physicochemical property and in vitro release. Methods CA-PLGA-NPs were
prepared by S/W/O/W double emulsion method combined with high-pressure homogenization. The morphology, particle size,
polydispersion index (PDI), drug loading, encapsulation efficiency (EE), and in vitro release of the nanoparticles were studied. Results
CA-PLGA-NPs were spherical or similarly spherical, and the average particle size, PDI, drug loading, and EE were (358.76 ± 22.51)
nm, 0.168 1 ± 0.012 2, (10.50 ± 0.28)%, and (60.92 ± 1.58)%, respectively. And burst phenomenon was not significant. The drug
delivery stable phase was 2—10 d. Conclusion S/W/O/W double emulsion method combined with high pressure homogenization
method is suitable for the preparation of CA-PLGA-NPs, and provides a pharmaceutical basis for CA administration.
Key words: antibacterial peptides from Plutella xylostella; S/W/O/W double emulsion; high pressure homogenization; poly(lactic-co-
glycolic acid); drug loading; encapsulation efficiency

小菜蛾抗菌肽［ antibacterial peptides from
Plutella xylostella（pxCECA1），CA］属于天蚕素抗
菌肽大家族中的一种，是从昆虫小菜蛾幼虫体内提
取分离而得，具有抗菌活性高，抗菌谱广的特点[1]。
它是一种相对分子质量为 4 500 的 α 螺旋形的阳离
子抗菌肽，能选择性与带负电荷多的细胞膜结合，

收稿日期：2014-09-19
基金项目：国家新药创制重大专项（2011ZX092J12108-04C）
作者简介：刘朝勇，硕士研究生，研究方向为中药新制剂、新剂型、新技术研究。Tel: 18075623736 E-mail: 506055047@qq.com
*通信作者 袁海龙 Tel: (010)66933367 E-mail: yhlpharm@126.com
韩 晋 Tel: (010)66933225 E-mail: hanjin302emba@163.com
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如肿瘤细胞细胞膜，破坏肿瘤细胞膜结构的完整性
并产生穿孔现象，使肿瘤细胞内液外流而凋亡[2-3]。
但 CA 易受温度、pH 值等外界因素的影响而变性失
活，也能发生自身聚集，或者与其他粒子无法逆转
的结合而失去生物活性[4]，所以其半衰期特别短，
限制了这类多肽药物的临床应用。
纳米给药系统（nano drug delivery system）具
有降低药物毒性和刺激性、延缓药物降解、延长药
物释放时间、靶向释放等优点[5-8]，将药物包封于其
中，可实现调节药物释放速率，改变药物在体内的
分布、提高药物生物利用度等目的，具有巨大的应
用前景。目前，可生物降解的合成聚合物材料聚乳
酸-羟基乙酸共聚物［poly(lactic-co-glycolic acid)，
PLGA［由于其无毒、成球性好、化学稳定性高、具
有控制释放能力等特点被广泛用作纳米给药系统的
载体[9-11]。
本研究选用 PLGA 为载体材料，CA 为模型药
物，以 S/W/O/W 结合高压均质法制备小菜蛾抗菌肽
PLGA 纳米粒（CA-PLGA-NPs），通过正交试验，
以 2、6、14 d 累积释放率为评价指标对处方工艺进
行优化筛选，对其粒径、多分散指数（PDI）、电位
等理化性质进行表征，以透射电镜（TEM）观察其
基本形态，并对其进行体外释药行为考察。
1 仪器与材料
Agilent 1100 高效液相色谱仪，含在线脱气机、
四元梯度泵、自动进样器、DAD 检测器、HP
Chemstation 化学工作站，Agilent 公司；S-4800 扫
描电镜，日本日立；NanoZS90 粒径分析仪，Malvern
公司；JS94W 温控型 Zeta 电位测量仪，北京中仪科
信科技有限公司；GYB40-10S 高压均质机，Nano
Bee 公司；JHBE-20A 高速探头超声仪，河南金鼐科
技发展有限公司；旋转蒸发仪，上海医械专机厂；
冷冻干燥机，美国 Labconco 公司。
CA 原料药，98.6%，批号 20140421，由解放军
第三○二医院药学部制剂研究室自制；CA 对照品，
99.8%，批号 20140405，由武汉大学提供；PLGA，
2 单体比例 1∶1，相对分子质量 15 000，山东省医
疗器械研究所；羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD），上
海谱振生物科技有限公司；聚乙烯醇（PVA），广州
伟伯化工有限公司；聚乙二醇 2000（PEG 2000），
上海酶联生物科技有限公司；甘露醇，天津市科密
欧化学试剂有限公司；色谱甲醇，瑞典 Oceanpak；
重蒸水；其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 CA-PLGA-NPs 的制备
取 0.5 g CA，PEG 2000 与 HP-β-CD 的等比例
混合物加入到去离子水溶液中，冷冻干燥得到 CA
的多肽微粉[8]。将含有 50 mg CA 的多肽微粉加入到
20 mL PLGA 的二氯甲烷中，高压乳均，充分乳化
后加入含氯化钠的 PVA 溶液 200 mL[9-10]，高速探头
超声 5 min，将其加入到高压均质机中高压均质
（100.0 MPa）循环 5 次，得复乳，减压旋转除去有
机溶剂，高速离心取沉淀后蒸馏水洗涤 3 次，收集
纳米粒，加入 3%甘露醇，冷冻干燥（−50 ℃、10 Pa），
即得。
2.2 HPLC 法测定 CA 方法建立[11]
2.2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent Alltima C18（250
mm×4.6 mm，5 μm），流动相为 0.05%三氟乙酸
（TFA）水溶液-甲醇-乙腈（95∶2.5∶2.5），体积流
量 1.0 mL/min，进样量 10 μL，检测波长 275 nm，
柱温 25 ℃。
2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取 CA 对照品 10
mg，置 50 mL 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，即
得 200 μg/mL CA 对照品储备液。
2.2.3 供试品溶液的制备 精密称定 CA-PLGA-
NPs 冻干粉 10 mg，分别置于 25 mL 量瓶中，加 90%
乙腈稀释并定容至 25 mL，即得供试品溶液。
2.2.4 线性关系考察 精密吸取 200 μg/mL CA 对
照品储备液适量，用流动相稀释配制成 8、16、32、
48、80 μg/mL 的 CA 对照品溶液，分别吸取上述溶
液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，以峰面积为纵
坐标（Y），进样量为横坐标（X），得线性回归方程
为 Y＝3.959×104 X＋1.017×103，r＝0.999 1。结
果表明 CA 在 8～80 μg/mL 线性关系良好。
2.2.5 精密度试验 分别取低、中、高 3 个质量浓
度（16、48、80 μg/mL）的 CA 对照品溶液，于同
日内重复测定 5 次，计算日内精密度；连续测定 5 d，
计算日间精密度，结果其日内精密度RSD为 1.21%、
1.34%、1.22%；其日间精密度 RSD 分别为 1.64%、
2.11%、1.23%。
2.2.6 重复性试验 取CA-PLGA-NPs冻干粉 6份，
用 90%乙腈溶解后，按“2.2.3”项下方法制备供试
品溶液，分别进样 10 μL，记录抗菌肽色谱峰的峰
面积值，代入“2.2.4”项下回归方程，计算其量。
结果冻干粉中抗菌肽的量平均值为 10.48%，RSD
为 1.30%，表明该方法重复性良好。
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 3 期 2015 年 2 月 ·350·
2.2.7 稳定性试验 精密吸取供试品溶液，按
“2.2.1”项下色谱条件分别于 0、1、2、4、6、8 h
测定，记录抗菌肽峰面积值，计算其 RSD 为 1.54%。
结果表明，供试品溶液在 8 h 内稳定。
2.2.8 加样回收率试验 精密称取已测定的 CA 原
料药 6 份，分别精密加入一定量的抗菌肽 CA 对照
品（约相当于样品中各量的 50%、100%、150%），
按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，进样 10 μL，
测定抗菌肽 CA 的量，计算得加样回收率 100.7%，
RSD 为 1.49%。
2.3 体外释放度测定
采用摇瓶培养法。精密称取 CA-PLGA-NPs 冻
干粉 10 mg，置于 25 mL 量瓶中，加入 pH 7.4 的磷
酸盐缓冲液［含 0.5%十二烷基硫酸钠（SDS）］25
mL，置于温度为（37.0±1.0）℃，速率为 75 r/min
的恒温振荡仪中，于 0、1、2、3、4、6、8、10、
12、14 d 取样 0.4 mL，同时补充介质 0.4 mL，立即
滤过，取续滤液，按“2.2.1”项下色谱条件测定介
质中药物的量，计算累积释放率。
累积释放率＝∑Ct/C0
其中 Ct 为 t 时已释放的 CA 质量浓度，C0为完全释放时 CA
的质量浓度
2.4 制备工艺的优选
Lee 等[8]研究发现用 PEG 2000 混合物制备的多
肽微粉能有效地增强复乳法制备微球时蛋白药物的
稳定性，PLGA 的质量浓度因为影响初乳的黏度所
以对微球的大小和形态有着重要影响，而由于氯化
钠质量分数影响复乳的渗透压和 PVA 影响复乳的
稳定性，故二者对包封率和载药量有决定性的意义。
所以本实验选取 CA 与 PEG 2000 混合物的比例
（A）、PLGA 质量浓度（B）、氯化钠质量分数（C）
及 PVA 质量分数（D）为考察因素，按 L9(34) 正交
表进行试验，因素水平见表 1。采用综合评分法对
正交试验数据进行分析，以 CA 在 2、6、14 d 的累
积释放率为综合评价指标，综合评分（Y）＝(Y2－
20)(40－Y2)＋(Y6－50)(70－Y6)＋(Y14－80)(100－
Y14)，Y2、Y6、Y14 分别为 2、6、14 d 3 个时间点的
累积释放率，同时 2、6、14 d 的累积释放率应分别
满足Y2在20%～40%、Y6在50%～70%、Y14在80%～
100%，当释放率偏离区间外，表示对 Y 的贡献为负，
Y 值越大，因素水平越好。试验安排及结果见表 1，
方差分析见表 2。
由直观分析可知，影响 CA-PLGA-NPs 释药性
质的因素顺序为 A＞C＞B＞D。以极值最小的 D 因
素为误差项进行方差分析，结果显示因素 A、C 具
有极显著意义，C 因素无明显影响，结合实际工艺
要求，确定最佳处方工艺为 A2B1C2D2，即 CA 与
PEG 2000 混合物的比例为 1∶1，PLGA 质量浓度
为 10 mg/mL，氯化钠质量分数和 PVA 质量分数分
别为 4.0%、0.2%。
2.5 验证试验
按上述最佳工艺进行 3 批验证试验，取 50 mg

表 1 CA-PLGA-NPs 处方工艺正交试验设计及结果
Table 1 Orthogonal design and results for optimization of CA-PLGA-NPs prescription process
试验号 A B/(mg·mL−1) C/% D/% Y2/% Y6/% Y14/% Y
1 1∶0 (1) 10 (1) 0 (1) 0 (1) 37.23 47.87 61.83 −692.96
2 1∶0 (1) 20 (2) 4 (2) 0.2 (2) 27.12 46.24 65.76 −485.21
3 1∶0 (1) 30 (3) 8 (3) 0.5 (3) 32.34 44.46 65.27 −558.54
4 1∶1 (2) 10 (1) 4 (2) 0.5 (3) 25.21 64.13 90.89 259.21
5 1∶1 (2) 20 (2) 8 (3) 0 (1) 32.56 60.01 86.21 279.08
6 1∶1 (2) 30 (3) 0 (1) 0.2 (2) 36.75 65.41 82.12 163.08
7 1∶2 (3) 10 (1) 8 (3) 0.2 (2) 23.54 62.35 83.34 208.39
8 1∶2 (3) 20 (2) 0 (1) 0.5 (3) 36.98 66.73 79.56 96.99
9 1∶2 (3) 30 (3) 4 (2) 0 (1) 34.62 63.22 89.71 268.20
K1 −1 736.71 −225.36 −432.89 −145.68
K2 701.37 −109.14 42.20 −113.74
K3 573.58 −127.26 −71.07 −202.34
R 2 438.08 116.22 475.09 88.60

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表 2 综合评分方差分析
Table 2 Analysis of variance for comprehensive score
方差来源 偏差平方和 自由度 F 值 显著性
A 1 255 333.806 2 935.228 P＜0.01
B 2 606.559 2 1.942
C 41 050.479 2 30.583 P＜0.05
D（误差） 1 342.275 2
F0.05(2, 2) = 19.00 F0.01(2, 2) = 99.00
CA，50 mg PEG 2000 与 HP-β-CD 的等比例混合物
加入到去离子水溶液中，冷冻干燥得到 CA 的多肽
微粉，然后加入到 20 mL 10 mg/mL 的 PLGA 的二
氯甲烷溶液中，高压乳均，充分乳化后加入到 200
mL 的含 4.0%氯化钠的 0.2% PVA 溶液中，高速探
头超声和高压均质，得 CA-PLGA-NPs 冻干粉，累
积释放曲线见图 1。结果表明，3 批样品的累积释放
率符合要求，此制备工艺稳定可行。CA-PLGA-NPs
释放缓慢且均均，在 2、6、14 d 内的累积释放率分
别为（26.41±0.35）%、（65.67±0.70）%、（90.52±
0.74）%，具有良好的缓释效果。



图 1 3 批 CA-PLGA-NPs 的体外释放曲线
Fig. 1 In vitro drug release profiles of three batches of CA-
PLGA-NPs

2.6 CA-PLGA-NPs 理化性质表征
2.6.1 CA-PLGA-NPs 的粒径和 Zeta 电位 将 CA-
PLGA-NPs 冻干粉复溶后，稀释，摇均，经激光散
射粒度分析仪和表面电位分析仪测定粒径、PDI 和
Zeta 电位。由测定结果可知，CA-PLGA-NPs 粒径
分布均一，粒径为（358.76±22.51）nm，PDI 值为
0.168 1±0.012 2，见图 2。Zeta 电位为−21.7 mV。



图 2 CA-PLGA-NPs 粒径图
Fig. 2 Profiles of particle size of CA-PLGA-NPs
2.6.2 CA-PLGA-NPs 载药量和包封率测定 精密
称定 CA-PLGA-NPs 冻干粉 10 mg，分别置于 25 mL
容量瓶中，加 90%乙腈稀释并定容至 25 mL，不断
振摇至完全溶解，按“2.2.1”项下测定 CA 的量，
计算包封率、载药量。
载药量＝CCAVCA/M0
包封率＝CCAVCA/M1
其中 CCA为 HPLC 测定的 CA 质量浓度，VCA为 CA-PLGA-
NPs 溶液体积，M0为 CA-PLGA-NPs 冻干粉取样量，M1为
CA-PLGA-NPs 冻干粉理论 CA 量
测得结果表明，CA-PLGA-NPs 中 CA 的载药量
为（10.50±0.28）%，包封率为（60.92±1.58）%。
2.6.3 CA-PLGA-NPs 体外释药 按“2.3”项下考
察 CA-PLGA-NPs 体外释药度，计算 0、1、2、3、
4、6、8、10、12、14 d 的累积释放率，累积释放曲
线见图 3。由体外释药曲线结果可知，制备的 CA-
PLGA-NPs 突释现象不明显，具有良好的缓控释效
果。CA 为水溶性多肽，原料药能快速分散溶解于
水中，累积释放曲线见图 3。




图 3 CA-PLGA-NPs 的体外释放曲线
Fig. 3 In vitro drug release profiles of CA-PLGA-NPs

2.7 CA-PLGA-NPs 的 TEM 形态观察
制备的 CA-PLGA-NPs 冻干粉适量溶于水，将
溶液滴于 TEM 铜网上，置于蜡板上风干，经 TEM
检测（扫描电压为 200 kV）。由 TEM 图可看出 CA-
PLGA-NPs 为网状球形或类球形，见图 4。由图 4
可知，CA 微粉分散于 CA-PLGA-NPs 的网状结构内
部，形成了许多储药小室，这些小室不仅能防止 CA
的大量聚集，也能避免 CA 长时间与外界环境的接
触，从而提高 CA 的稳定性，增加其体内的半衰期。
3 讨论
在本制剂处方中选用等比例的 PEG 2000 与羟
丙基-β-环糊精的混合物作为保护剂[8]，在制备初乳
时，保护剂迅速进入初乳的水相液滴内部，从而减
少 CA 与二氯甲烷的接触时间。同时，PEG 2000 能
减小乳滴的油相与水相表面张力，减少乳滴破裂从
100
80
60
40
20
0 C
A
累
积
释
放
率
/%

试验 1
试验 2
试验 3
0 2 4 6 8 10 12 14
t/d
100
80
60
40
20
0C
A
累
积
释
放
率
/%

0 2 4 6 8 10 12 14
t/d
1 10 100 1 000
粒径/nm
CA
CA-PLGA-NPs
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图 4 CA-PLGA-NP 在 TEM 下的形态图
Fig. 4 TEM image of CA-PLGA-NPs

而保护水滴中的 CA 分子。PLGA 用量对 CA-PLGA-
NPs 理化性质影响较小。由于高压均质机对流体的
粘度有一定的要求，本实验中 PLGA 的最大质量浓
度设定在 30 mg/mL。溶液黏度过大将降低高压均质
机的工作性能，实验结果表明，10 mg/mL 的 PLGA
能满足本处方的要求。处方中的氯化钠[9]不仅能提
高外水相的渗透压，防止因内水相压力过大而破乳，
也能加速内水相的水分子向外迁移，提高包封率，
还能使 CA-PLGA-NPs 更加致密，延长释药时间。
PVA 常作为表面活性剂用于 CA- PLGA-NPs 的制
备，其质量分数对 CA-PLGA-NPs 的制备影响较小，
提高 PVA 的质量分数能增加初乳的稳定性，从而减
少 CA 的泄漏，达到提高包封率、减少突释的效果。
通过本研究采用 S/W/O/W 结合高压均质法制
备的 CA-PLGA-NPs 粒径较小且均一，工艺稳定可
行，为抗菌肽类药物的新型给药系统研究提供制剂
学基础。
参考文献
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