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In vitro percutaneous penetration studies of Jinhuang Gel based on principal component analysis

基于主成分分析的金黄凝胶体外透皮吸收研究



全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 15期 2016年 8月

·2635·
基于主成分分析的金黄凝胶体外透皮吸收研究
陆兆光 1, 2, 3,闫 明 1, 2, 3,杨 晶 1, 2, 3,张 红 1, 2, 3,吴 云 1, 2, 3,丁 岗 1, 2, 3,王振中 1, 2, 3,
萧 伟 1, 2, 3*
1. 江苏康缘药业股份有限公司,江苏 连云港 222001
2. 中药制药过程新技术国家重点实验室,江苏 连云港 222001
3. 中药提取精制新技术重点研究室,江苏 连云港 222001
摘 要:目的 综合评价剂型改进后的金黄凝胶的体外透皮吸收效果,为金黄凝胶新药开发提供体外渗透动力学方面的实验
依据。方法 以离体大鼠背部皮肤为体外模型,采用改良的 Franz扩散池进行透皮吸收试验,首先建立金黄凝胶和金黄油膏
接收液及皮肤滞留样品的 HPLC指纹图谱,并对指纹图谱原始数据进行主成分分析(PCA);其次确定金黄凝胶与金黄油膏
共有的药物组分峰,求出各共有峰的面积,应用 PCA法求得 PCA载荷图;最后以复方中透皮吸收效果较好的芍药苷为代表,
对体外渗透动力学进行考察。结果 金黄凝胶药物组分的整体体外透皮吸收效果优于金黄油膏,芍药苷的体外透皮吸收符合
零级动力学过程,且金黄凝胶中芍药苷的累积透过量、透皮速率及皮肤滞留量均高于金黄油膏。结论 改进剂型后的金黄凝
胶整体体外透皮吸收效果更好。PCA法是研究中药经皮给药制剂体外透皮吸收实验的有效手段。
关键词:金黄凝胶;金黄油膏;主成分分析;体外透皮吸收;HPLC;指纹图谱;渗透动力学;芍药苷
中图分类号:R283.6 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2016)15 - 2635 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.15.009
In vitro percutaneous penetration studies of Jinhuang Gel based on principal
component analysis
LU Zhao-guang1, 2, 3, YAN Ming1, 2, 3, YANG Jing1, 2, 3, ZHANG Hong1, 2, 3, WU Yun1, 2, 3, DING Gang1, 2, 3,
WANG Zhen-zhong1, 2, 3, XIAO Wei1, 2, 3
1. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China
2. State Key Laboratory of Pharmaceutical Process New-teach for Chinese Medicine, Lianyungang 222001, China
3. The Key Laboratory for the New Technique Research of TCM Extraction and Purification, Lianyungang 222001, China
Abstract: Objective To comprehensively evaluate the in vitro percutaneous penetration and provide the experimental basis of in
vitro kinetics for new drug development of Jinhuang Gel. Methods The skin penetration of Jinhuang Gel was investigated through
in vitro excised rat skin using the improved Franz diffusion cell. HPLC fingerprint of receptive solution and skin retention was
established and analyzed using principal component analysis (PCA). The common peaks of HPLC fingerprint between Jinhuang Gel
and Jinhuang Ointment were selected and each area was calculated to obtain the PCA biplot. Paeoniflorin as a representative of
common peaks was used to investigate the in vitro permeation kinetics. Results The results showed that the PCA biplot based on
common peaks areas displayed that the global in vitro transdermal absorption effects of Jinhuang Gel were significantly better than
those of Jinhuang Ointment. The in vitro transdermal absorption of paeoniflorin followed zero kinetics, and the cumulative
permeation amount, permeation rate, and skin retention of paeoniflorin from Jinhuang Gel were superior to those from Jinhuang
Ointment. Conclusion Jinhuang Gel could improve the overall effects of in vitro percutaneous absorption. PCA is an effective
means for investigating in vitro percutaneous absorption experiments of Chinese materia medica for transdermal administration.
Key words: Jinhuang Gel; Jinhuang Ointment; principal component analysis; in vitro percutaneous penetration; HPLC; fingerprint;
penetration kinetics; paeoniflorin

收稿日期:2016-01-26
基金项目:科学技术项目国家重大新药创制项目(2013ZX09402203)
作者简介:陆兆光,男,硕士,助理研究员,研究方向为中药新药研发。E-mail: luzg83@126.com
*通信作者 萧 伟,男,研究员级高级工程师,博士,研究方向为中药新药的研究与开发。
Tel: (0518)81152337/13905136437 E-mail: kanionlunwen@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 15期 2016年 8月

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金黄油膏(Jinhuang Ointment)是苏州市中医
院骨伤科的协定处方,由赤芍、天花粉等 5味中药
组成,临床用于软组织损伤、骨折早期及骨性关节
炎等病症,尤其对热性肿痛效果良好[1]。但原制剂
为油膏,处方药味均以细粉入药,存在药物释放不
完全、质量可控性差、使用不便等缺点。与之相比,
凝胶剂作为一种新型的外用制剂,具有载药量大、
生物相容性好、使用方便、舒适等多种优点。因此,
为了有效解决金黄油膏临床应用的顺应性,克服其
剂型上的不足,拟将其开发为金黄凝胶(Jinhuang
Gel)6类新药[1-2]。
但剂型改变后的金黄凝胶能否增加药物成分的
透皮吸收效果尚不清楚,而常用的中药经皮给药制
剂体外透皮吸收研究方法,常常只能选择单个或几
个药物成分作为指标,并不能代表中药经皮给药制
剂整体药物成分的透皮规律[3-6]。本研究采用主成分
分析(PCA)法对金黄凝胶经皮给药的整体药物组
分的 HPLC指纹图谱进行综合评价,克服了由单个
或几个药物成分作为评价指标研究透皮规律的缺
陷,并在 PCA揭示出各共有药物组分峰面积表现出
相似的体外透皮吸收规律的基础上,以金黄凝胶中
透皮吸收效果较好的芍药苷色谱峰为代表,对累积
透过量、透皮速率及皮肤滞留量等指标进行考察。
1 仪器与材料
Agilent 1200高效液相色谱仪,美国安捷伦科技
有限公司;TPY-2 智能透皮扩散试验仪,上海黄海
药检仪器有限公司;BS124S Sartorius电子天平,北
京赛多利斯科学仪器有限公司;GL-16 型离心机,
上海安亭科学仪器厂。金黄凝胶,批号 20150101,
每克金黄凝胶含芍药苷 0.89 mg,相当于生药 0.23
g,江苏康缘药业股份有限公司研制;金黄油膏(对
照药物),批号 20130510,相当于生药 0.23 g,苏州
市中医院院内制剂;空白凝胶(空白组),批号
20150101,江苏康缘药业股份有限公司;芍药苷对
照品,质量分数 94.9%,批号 110736-201337,中国
食品药品检定研究院;实验所用试剂甲醇与乙腈为
色谱纯,磷酸为分析纯,纯化水(自制)。
SD大鼠 10只,购于浙江省实验动物中心,雄
性,体质量 150~200 g,生产许可证号 SCXK(浙)
2014-0001,质量合格证号 0016661。
2 方法与结果
2.1 大鼠离体皮肤制备
健康大鼠 10只,雄性,体质量 150~200 g,实
验室饲养 1周以适应环境。实验前小心剪去背部体
毛(注意不要损伤皮肤),然后将大鼠脱颈处死,剥
离背部皮肤,将取下的皮肤平铺于玻璃片上,角质
层朝下,仔细去除其皮下脂肪及黏连组织,再用生
理盐水反复冲洗干净,滤纸吸干表面水分,用锡箔
纸包裹后放入冰箱(−20 ℃)冷冻保存,1 周内用
完。每次实验前仔细检查鼠皮的完整性,有任何破
损的皮肤不能用于实验。
2.2 体外透皮吸收实验
实验分为实验组(金黄凝胶,n=9)、对照组(金
黄油膏,n=9)和空白组(空白凝胶,n=3)。实验
前从冰箱中取出备用皮肤,室温下自然解冻,并用
无菌生理盐水漂洗至无浑浊,滤纸吸干表面水分备
用。取约 50 mg金黄凝胶(与金黄油膏生药材用量
一致),均匀涂于皮肤表面,将大鼠皮肤固定在竖式
Franz扩散池(扩散池面积为 1.67 cm2,体积为 6.5
mL)的上下两室之间,使角质层面向上,用弹簧夹
固定,接收池中加满生理盐水作为接收液,恒温
(37.0±0.2)℃,磁力搅拌子转速 300 r/min。分别
于 2、4、6、8、10、12、24 h从接收池中取出 0.5 mL
接收液,并立即补加等量的恒温(37.0±0.2)℃新
鲜生理盐水。按上述方法完成对照组与空白组的体
外透皮吸收实验。
2.3 接收液与皮肤样品的制备
将各时间点吸取的 0.5 mL接收液分别置于 1.5
mL的离心管中,转速 12 000 r/min离心 10 min,取
上清液至高效液相样品瓶中;将实验结束后的有效
扩散面积大鼠皮肤剪切下来,并剪碎置于玻璃匀浆
器中,加入 0.5 mL甲醇充分匀浆,匀浆液离心后,
取上清液 0.2 mL 加入装有内插管的高效液相样品
瓶中,待测。
2.4 供试品溶液制备
称取金黄凝胶 4 g置于 20 mL量瓶中,加甲醇
稀释至刻度,超声处理 10 min,转速 12 000 r/min
离心 10 min,取上清液作为供试品溶液。
2.5 HPLC分析方法的建立[7-8]
2.5.1 HPLC 条件 色谱柱为 Agilent SB-C18 柱
(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈-0.1%磷
酸水溶液(14∶86),检测波长 230 nm,体积流量
1.0 mL/min,柱温 30 ℃,进样量 10 μL。
2.5.2 专属性考察 空白组与实验组24 h时间点的
接收液及实验结束后的皮肤经处理后进样分析,结
果表明空白组接收液与空白组皮肤样品的色谱峰均
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不干扰金黄凝胶有效成分芍药苷的 HPLC测定,且
能够与金黄凝胶其他药物组分的色谱峰很好地分
离,见图 1。
2.5.3 对照品溶液的配制和标准曲线的建立 精密
称取芍药苷对照品 4.600 mg,置 20 mL量瓶中,加
适量甲醇溶解,并稀释至刻度,摇匀,得对照品储






A-对照品 B-金黄凝胶供试品 C~E分别为空白组、对照组、实验组皮肤滞留样品 F~H分别为空白组、对照组、实验组接收液样品
A-reference substance B-Jinhuang Gel sample C—E-skin retention samples in blank group, control group, and experimental group, respectively;
F—H-solution in blank group, control group, and experimental group, respectively
图 1 24 h时间点接收液与皮肤滞留样品的 HPLC图谱
Fig. 1 HPLC of receptive solution and skin retention at 24 h time point

备液。精密量取对照品储备液 1.00 mL,置 25 mL
量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,得芍药苷质量浓度
为 9.2 μg/mL 的对照品溶液。精密量取 9.2 μg/mL 对
照品溶液 0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL,
置 5 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,得芍药苷
质量浓度分别为 0.46、0.92、1.84、3.68、5.52、7.36
μg/mL 的系列对照品溶液。以芍药苷质量浓度为横
坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归,
得回归方程 Y=13.932 X+0.563 6,r=0.998 8,结
果表明芍药苷在 0.46~7.36 μg/mL 线性关系良好。
2.5.4 精密度试验 取 9.2 μg/mL 的芍药苷对照品
溶液进样 10 μL,重复进样 6次,芍药苷峰面积 RSD
值为 1.27%。
2.5.5 稳定性试验 取金黄凝胶皮肤滞留样品与
24 h接收液样品分别进样,每次进样 10 μL,每隔
12 h进样 1次,3 d内测定 6次,结果显示芍药苷及
其他主要色谱峰面积基本保持不变,金黄凝胶皮肤
滞留样品与 24 h 接收液样品中芍药苷峰面积 RSD
值分别为 2.13%和 2.26%。
2.5.6 重复性试验 按“2.4”项下方法制备金黄凝
胶供试品溶液,平行 6份,分别进样 10 μL,结果
表明图 1-B中 15个药物组分色谱峰面积的 RSD均
小于 3.00%,其中芍药苷峰面积 RSD为 1.77%。
2.5.7 加样回收率试验 将各组24 h空白组接收液
混合,作为空白接收液备用。取芍药苷对照品溶液
适量加入空白接收液中,配制成含芍药苷 0.46、
0.92、1.84 μg/mL 的低、中、高 3个质量浓度的对
照品溶液各 3份,进样 10 μL 测定,计算回收率分
别为 105.7%、103.2%、99.7%,RSD分别为 2.17%、
1.78%、1.43%。
2.6 数据处理
2.6.1 PCA 在完成体外透皮实验样品的 HPLC测
定后,对接收液及皮肤滞留样品进行 PCA。首先导
出金黄凝胶和金黄油膏 24 h时间点HPLC色谱图的
CSV格式原始数据,然后将 CSV数据通过 R软件
(https://www.r-project.org/)做 PCA运算,得到 PCA
芍药苷
9 (芍药苷) A
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
t/min
G H
3
5 7
9
13
1 2
3 4 5 6
7 8
10 11 12 13 14
15
B
C D
E
1 2 3
4
5 6
7 8
10 15 12 11 13 14
9 (芍药苷) F
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得分图。PCA得分图直观形象地显示金黄凝胶组和
金黄油膏组的接收液及皮肤滞留样品均能够完全分
开(图 2),表明金黄凝胶和金黄油膏组无论在接收
液还是在皮肤滞留样品中,其 HPLC指纹图谱均整
体表现出显著性差异。






图中的每 1个点代表 1个样本,下同
Each point in the plot represents one sample, same as below

图 2 皮肤滞留样品 (A) 与接收液样品 (B) HPLC 指纹图
谱数据的 PCA
Fig. 2 PCA score plot of HPLC fingerprint data from skin
retention (A) and receptive solution (B)

基于HPLC的特征谱图和色谱峰保留时间是鉴
定化合物的基础,而色谱响应强度(如峰高、峰面
积)是定量不同样品或组别之间差异的基础[9]。本
实验从金黄凝胶与金黄油膏24 h时间点的接收液和
皮肤滞留样品的指纹图谱中共找出了 15 个共有药
物组分峰(图 1-B),该 15 个共有药物组分峰是通
过对比给药组样品、金黄凝胶供试品与空白组样品
的色谱峰保留时间,排除空白样品色谱峰干扰后的
共有峰。首先对这 15个共有药物组分峰的峰面积数
据进行标准化处理[标准化数据=(峰面积-该列平
均峰面积)/该列的标准差],然后经标准化处理的数
据作为输入变量进行 PCA,求出金黄凝胶和金黄油
膏在接收液与皮肤滞留样品中的 PCA 载荷图(图
3)。PCA载荷图直观形象地展示出各共有药物组分
峰的峰面积变量与金黄凝胶组变量在空间上相聚较
近,表明各药物组分峰的峰面积与金黄凝胶组正相
关程度高,即金黄凝胶组药物组分的整体透皮效果
优于金黄油膏组;另外,各峰面积变量距离原点较
远且远近相似,说明各峰面积变量均可以被这 2个
主成分充分解释,且各峰面积变量表现出相似的体
外透皮吸收特征。






空间上相聚越近的变量,正相关程度越高;距离原点越远说明该
变量被这 2个主成分解释得越充分
The variables on the space are closer together with each and the
degree of positive correlation is higher between two variables. The
distance from the origin is farther and the variables are more fully
explained by the two principal components

图 3 皮肤滞留样品 (A) 与接收液样品 (B) 共有药物组分
峰的主成分分析载荷图
Fig. 3 PCA biplot of common peak areas from skin
retention (A) and receptive solution (B)
6

4

2

0

−2

−4

−6
PC
2
(9
.6
7%
)
金黄凝胶
金黄油膏
−6 −4 −2 0 2 4 6
PC1 (81.90%)
累计方差比例=91.57%
A
4


2


0


−2


−4
PC
2
(1
1.
04
%
)
−4 −2 0 2 4
PC1 (82.31%)
累计方差比例=93.35%
B
金黄凝胶
金黄油膏
4



2



0



−2
PC
2





(
9.
7%
)
A
−5.0 −2.5 0 2.5
PC1方差贡献率 (81.9%)
2


1


0


−1


−2
PC
2





(
11
.0
%
)
−2 0 2
PC1方差贡献率 (82.3%)
B
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2.6.2 累积透过量(Q)与皮肤滞留量(QS)计算
方法[4] 通过上述PCA得知各共有药物组分峰的体
外透皮吸收特征相似,为了能够揭示金黄凝胶体外
渗透动力学特征,选择了复方中透皮吸收效果较好
的有效成分芍药苷为代表,对 Q、透皮速率及 QS
等指标进行考察。芍药苷 Q按照下列公式计算。
Qn=(VCn+∑

=
1
1
n
i
CiVi)/A
其中 Qn为第 n 个时间点(金黄凝胶与金黄油膏中芍药苷均
从 6 h检测到)的 Q(μg/cm2),Cn为第 n个时间点测得的
芍药苷质量浓度(μg/mL),Ci为第 i个时间点测得的芍药苷
质量浓度(μg/mL),Vi为每次取样的体积(mL),实验中扩
散池容积(V)为 6.5 mL,有效扩散面积(A)为 1.67 cm2
以 Q对渗透时间 t进行线性回归(图 4),所得
方程即为渗透动力学方程,所得斜率即为透皮速率
常数[Js,μg/(cm2·h)]。芍药苷体外渗透动力学参数
及 QS见表 1。综上表明芍药苷在 2种剂型中的体外
透皮行为满足零级动力学过程,且金黄凝胶组中芍
药苷的 Q24、Js及 QS均显著高于金黄油膏组。由于
PCA 显示各共有药物组分峰的体外透皮吸收特征
相似,因此其他药物组分在金黄凝胶中的体外透皮
行为也应满足零级动力学过程。
3 讨论
中药经皮给药制剂是一种高度复杂的混合体
系,临床上常以多物质多靶点的方式协调发挥疗效,



图 4 金黄凝胶与金黄油膏中芍药苷的透皮吸收曲线
Fig. 4 Q-t curves of paeoniflorin from Jinhuang Gel and
Jinhuang Ointment

表 1 芍药苷体外渗透动力学参数及皮肤滞留量
Table 1 In vitro permeation kinetics parameters and skin retention amount of paeoniflorin
药物 Q24/(μg·cm−2) 渗透动力学方程 r Js/(μg·cm−2·h−1) QS/(μg·cm−2)
金黄凝胶 10.461±0.892 Q=0.456 2 t-0.469 6 0.998 0 0.456 10.891±0.785
金黄油膏 6.921±0.589 Q=0.256 5 t+0.824 7 0.996 2 0.257 1.821±0.259

因此全面综合地评价中药经皮给药制剂的透皮规
律,能够为其药效的发挥提供重要的物质基础。目
前在研究中药经皮给药制剂体外透皮吸收过程中,
由于中药经皮给药制剂复杂的物质基础,通常只能
选择单个或几个药物成分作为评价指标,很难代表
其整体药物成分的透皮规律。因此,寻找一种更加
全面综合的评价透皮规律方法,是中药经皮给药制
剂现代化研究的一个重要方面[10]。
PCA 是一种基于投影技术的多元统计分析方
法,它可以利用投影的方法将原始数据产生的数学
模型进行降维处理以化繁为简,在不损失或尽量少
损失原有信息的情况下把多个变量转化成较少几个
重要变量且包含原有大部分信息的多元统计方法,
该方法排除了原始数据中相互重叠的信息,避免了
评价中主观加权的弊端,从而直观地发现样品或组
别之间的差异[9-12]。
本研究对金黄凝胶经皮给药的整体药物组分的
指纹图谱原始数据及 15 个共有药物组分峰面积分
别进行 PCA,克服了由单个或几个药物成分作为评
价指标研究透皮规律的缺陷。PCA的结果表明金黄
凝胶组药物组分的整体体外透皮吸收效果优于金黄
油膏组。实验中选择透皮吸收效果较好的芍药苷色
谱峰为代表,对 Q、Js及 QS等指标进行考察,结果
表明芍药苷在 2种剂型中的体外透皮行为符合零级
动力学过程,且金黄凝胶组中芍药苷的 Q、Js及 QS
均显著高于金黄油膏组。由于 PCA显示各峰面积变
量具有相似的体外透皮吸收特征,因此可知金黄凝
胶组中其他药物组分的 Q24、Js及 QS也应显著高于
金黄油膏组,且金黄凝胶组中其他药物组分的体外
透皮吸收行为应满足零级动力学过程。以上研究结
果与前期研究发现金黄凝胶对大鼠急性软组织损伤
的治疗作用明显优于金黄油膏[13]是相符的。
志谢:南京理工大学环境与生物工程学院李明
会博士帮助本实验结果进行 PCA数据处理。
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12

10

8

6

4

2

0
Q
/(μ

cm
−2
)
金黄凝胶
金黄油膏
0 4 8 12 16 20 24
t/h
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 15期 2016年 8月

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