全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 3 期 2013 年 2 月

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驴皮药材 RAPD 分析方法建立及其与伪品马皮的鉴别
田俊生 1，史碧云 1, 2，张福生 1，李晓伟 1, 2，耿伟华 3，杨 永 3，刘会来 3，秦雪梅 1*
1. 山西大学 中医药现代研究中心，山西 太原 030006
2. 山西大学化学化工学院，山西 太原 030006
3. 保定赛行阿胶有限公司，河北 保定 071404
摘 要：目的 建立驴皮药材 RAPD 分析方法并用于伪品马皮的鉴别。方法 采用化学试剂盒法确定了驴皮药材中 DNA 提
取的最佳条件，采用 L16(45) 正交设计方法，针对 Taq 酶、Mg2+、dNTP、模板 DNA、引物设计了 5 因素 4 水平的正交试验，
优化了 RAPD-PCR 反应条件。结果 驴皮药材 RAPD-PCR 反应体系的最佳条件为 25 μL 反应体系中含有 Taq 酶 1.5 U、Mg2+
0.15 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、模板 DNA 1.5 μL、引物 0.5 μmol/L；PCR 反应条件为 95 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，
37 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共 30 个循环，最后 72 ℃延伸 7 min。RAPD 反应结果中 300～400 bp 处的条带可作为鉴
别驴皮及其伪品的特异性条带。结论 所建立的 RAPD 分析方法具有简便快捷、稳定性好、重现性高的特点，可用于驴皮
药材及其伪品马皮的鉴别。
关键词：驴皮；RAPD-PCR 分析；正交设计；DNA 分子标记；伪品鉴别
中图分类号：R282.32 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)03 - 0354 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.03.024
Establishment of RAPD for analysis on furs of Equus asinus and discrimination
from Equus caballus orientalis
TIAN Jun-sheng1, SHI Bi-yun1, 2, ZHANG Fu-sheng1, LI Xiao-wei1, 2, GENG Wei-hua3, YANG Yong3, LIU
Hui-lai3, QIN Xue-mei1
1. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Shanxi University, Taiyuan 030006, China
2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China
3. Baoding Saixing E-jiao Co.,LTD, Baoding, Baoding 071404,China

Key words: Equus asinus L.; RAPD-PCR analysis; orthogonal design; DNA molecular marker; fake identification

驴皮为马科马属动物驴 Equus asinus L. 的干燥
皮，是制造传统中药阿胶的重要原料[1]。《本草纲目》
将阿胶列为“上品”，自古以来作为一种药食同源之
品受到人们的青睐。近年来，随着生活水平的提高，
阿胶用量逐年增加，市场供不应求。然而，市场调查
结果显示，在我国驴养殖业发展严重滞后，驴的存栏
数呈逐年下滑之势[2]。由于驴 E. asinus L. 和马 E.
caballus orientalis Noack 为同科同属动物，因此驴皮
与马皮在毛色、性状等方面十分相近，肉眼很难区分，
故市场上以马皮作为驴皮伪品制造阿胶最为常见。目
前，驴皮药材尚无药典质量标准，地方标准收载的传
统鉴别方法大多依据性状判断，存在着客观性差、准
确度低的缺点。因此，建立快速简便、客观稳定的驴
皮及其伪品的鉴别方法显得十分重要。
随机扩增多态性 DNA 技术（random amplified
polymorphic DNA，RAPD）是 20 世纪 90 年代发展
起来的一项基于 PCR 技术的 DNA 多态性检测分子
标记技术。它具有操作简便、快速、成本低、所需
DNA 量少、灵敏度高、不易受环境和生物周期的影
响等特点[3]。利用 RAPD 技术鉴别中药材的真伪已
受到越来越广泛的关注。但是，针对动物类药材特
别是驴皮的 DNA 鉴别方法文献报道较少[4]。本研究
初步建立了经济实用、方便快捷、准确可靠的驴皮
RAPD-PCR 分析方法并将其用于伪品马皮的鉴别，

收稿日期：2012-10-06
基金项目：国家自然科学基金项目（81102833）；山西省基础研究项目（2012021031-2）；山西省中药材、中药饮片地方标准研究（2011012A）
作者简介：田俊生（1980—），男，内蒙古人，博士，讲师，研究方向为细胞药理学。Tel: (0351)7011202 E-mail: jstian@sxu.edu.cn
*通信作者 秦雪梅 Tel: (0351)7018379 E-mail: qinxm@sxu.edu.cn
网络出版时间：2013-01-08 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20130108.0928.002.html
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对于保证阿胶质量具有重要意义。
1 材料与仪器
驴皮采集自黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河
北等省区的 12 个产地（1～12 号），另外还收集了
河北的马皮样品 3 份（13～15 号），均为整张皮，
样品信息见表 1，全部样品经山西大学中医药现代
研究中心秦雪梅教授鉴定为马科动物驴 E. asinus L.
或马科动物马 E. caballus L. 的干燥皮。凭证样本保
存于山西大学中医药现代研究中心。
离心柱型血液/细胞/组织基因组 DNA 提取试
剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；Marker 和
Taq 酶，宝生物工程（大连）有限公司；GoldView I
型核酸染色剂，北京索来宝生物科技有限公司；其
他试剂均为分析纯。
表 1 样品信息
Table 1 Information of collected samples
编号 样品 产地 编号 样品 产地
1 驴皮 E. asinus 黑龙江哈尔滨 9 驴皮 E. asinus 河北唐山
2 驴皮 E. asinus 黑龙江哈尔滨 10 驴皮 E. asinus 河北唐山
3 驴皮 E. asinus 吉林 11 驴皮 E. asinus 内蒙古包头
4 驴皮 E. asinus 吉林 12 驴皮 E. asinus 内蒙古包头
5 驴皮 E. asinus 辽宁锦州 13 马皮 E. caballus orientalis 河北保定
6 驴皮 E. asinus 辽宁锦州 14 马皮 E. caballus orientalis 河北邢台
7 驴皮 E. asinus 内蒙古赤峰 15 马皮 E. caballus orientalis 河北保定
8 驴皮 E. asinus 内蒙古赤峰

BSA124S 电子天平，赛多利斯科学仪器有限公
司；HH 数显恒温水浴锅，江苏金坛市金城国胜实
验仪器厂；TGL-16 台式高速离心机，湘仪离心机
仪器有限公司；MJ-Mini 48 孔梯度 PCR 仪，美国伯
乐公司；DYY-6B 型稳压稳流电泳仪，南京安铎贸
易有限责任公司；凝胶成像仪，Syn Gene Ltd.
Cambridge，England。
2 方法
2.1 基因组 DNA 的提取
将驴皮及其伪品马皮分别去毛后粉碎，过 24
目筛，按照试剂盒微量提取法操作说明进行基因组
DNA 的提取。经过反复试验，最终确定样品用量、
水解时间等参数。利用琼脂糖凝胶电泳法检查基因
组 DNA 提取的效果，并将提取的 DNA 置于−20 ℃
冰箱中保存，备用。
2.2 RAPD-PCR 分析
2.2.1 引物 参考文献方法[4-5]，选取 7 条 RAPD
分子标记的引物（上海生工生物工程有限公司合
成），合成引物序列见表 2。
2.2.2 PCR 反应程序 参照文献方法[6]及标准 PCR
反应，设定如下反应程序：95 ℃预变性 5 min，94
℃变性 30 s，36 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共
30 个循环，最后 72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存。将
扩增产物用 1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，上样量
为 6 μL。首先对所选 7 条引物进行筛选，其次设计
了 6 个梯度对退火温度进行优化。
表 2 RAPD 分析随机引物及其序列
Table 2 Analysis on random primers
and their sequences by RAPD
编号 引物 序列
1 S423 5’-GGTACTCCCC-3’
2 S22 5’-GGTGACGCAG-3’
3 S7 5’-AGGGAACGAG-3’
4 S17 5’-TGCCGAGCTG-3’
5 S42 5’-GGACCCAACC-3’
6 S43 5’-GTCGCCGTCA-3’
7 S47 5’-TTGGCACGGG-3’

2.2.3 正交试验反应体系的优化 选用质量较好的
模板 DNA 和前期筛选出的最适引物进行 RAPD 扩
增，在初始反应体系的基础上，采用 L16(45) 对体
系中 Mg2+、dNTP、引物、模板 DNA、Taq DNA 聚
合酶等设计 5 因素 4 水平正交试验进行优化，并用
6 μL 扩增产物于 1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，用
直观分析法确定最佳反应体系。PCR 反应的因素及
水平见表 3。
2.2.4 RAPD 扩增反应及电泳检测 在优化后的反
应体系基础上，应用所筛选出来的最适引物和最佳
反应体系对12个驴皮样品及3个伪品马皮样品进行
PCR 扩增反应和电泳检测。取样品 DNA 6 μL，加
入 2 μL 6×Loading 缓冲液混匀后上样，用 1.5%琼
脂糖凝胶于 5 V/cm 的电压下进行电泳检测，电泳缓
冲液为 1×TBE，用 DNA Marker 作为标准相对分子
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表 3 RAPD-PCR 反应体系的因素与水平
Table 3 Factors and levels of RAPD-PCR reaction system
因 素
水平
Mg2+/ (mmol·L−1) dNTP / (mmol·L−1) 引物 / (μmol·L−1) Tap DNA 聚合酶 / (U·μL−1) 模板 DNA / μL
1 0.10 0.10 0.30 0.04 1.5
2 0.15 0.15 0.40 0.06 2.0
3 0.20 0.20 0.50 0.08 2.5
4 0.25 0.25 0.60 0.10 3.0

质量标记，在凝胶成像系统中观察拍照。
2.3 数据处理
RAPD 为显性标记，同一引物的扩增产物在琼
脂糖凝胶电泳中迁移率相同的条带被认为是同源
性的，处于同一位点的条带按清晰可见的强带或反
复出现的弱带记为“1”，无带记为“0”，形成二元
数据矩阵[7]。使用 SPSS 17.0 软件，对矩阵进行聚
类分析。
3 结果与分析
3.1 基因组 DNA 的提取
将所提取的基因组 DNA 在 1.5%琼脂糖凝胶
上进行电泳检测，结果在各样品泳道均出现明显
的特异亮带，表明样品基因组 DNA 已成功地提取
出，结果见图 1。经过反复试验后最终确定样品
用量约为 25 mg，水解时间为 4 h 时，各样品条带
清晰。
3.2 PCR 引物及退火温度筛选
按照 PCR 反应程序对所选的 7 条引物进行筛
选，结果见图 2，可知 2 号引物（S22）电泳条带最
为清晰，且稳定可重复，因此选择 S22 引物进行后
续研究。以 S22 引物为对象，筛选最佳退火温度，
结果见图 3，可知泳道 D、E 的条带均较多且清晰，
故退火温度应为 36.2～38.3 ℃为宜，最后确定退火

1～12-驴皮样品 M-DNA Marker
1—12-furs of E. asinus M-DNA Marker
图 1 基因组 DNA 提取电泳图
Fig. 1 Electrophoresis of extracted genomic DNA

1～7-引物 M-DNA Marker
1—7-primers M-DNA Marker
图 2 随机引物筛选电泳图
Fig. 2 Electrophoresis of random screening for primers

A-47.8 ℃ B-44.8 ℃ C-41.3 ℃ D-38.3 ℃
E-36.2 ℃ F-35.0 ℃ M-Marker
图 3 退火温度筛选电泳图
Fig. 3 Electrophoresis of screening for annealing
temperature
温度为 37 ℃进行后续研究。
3.3 正交试验 PCR 反应体系的优化
正交试验的结果见图 4。实验结果表明不同反
应体系中，随着各因素水平的不同，DNA 条带存在
明显差异。体系 1～4 结果较差，可能因为 Mg2+浓
度过低，导致 Taq DNA 聚合酶活性降低；体系 10
和 15 拖尾现象严重，可能由于高浓度的 Mg2+导致
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp

2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 2 3 4 5 6 7 M

A B C D E F M
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
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非特异性扩增；体系 5 和 6 产生条带少，可能是由于
dNTP 浓度过低，扩增产生的片段太少；体系 11 和 16
产生条带数量少且不清晰，原因可能为引物浓度低，
使反应不能有效扩增；体系 12 的结果不好可能是由
于酶的浓度低，以致反应无法顺利进行，产物产量过
低；体系 7、8、9、13 和 14 的谱带多态性高且比较
清晰，其中以反应体系 8 效果最好，结果见表 4。

1～16-PCR 反应体系正交组合中的各因素组合 M-DNA Marker
1 — 16-PCR reaction system orthogonal combination of factor
combinations M-DNA Marker
图 4 正交试验优化 PCR 反应体系电泳图
Fig. 4 Electrophoresis of PCR reaction system
by orthogonal test
表 4 最佳 PCR 反应体系
Table 4 Optimal PCR reaction system
试 剂 体积 / μL
10×PCR 缓冲液 2.5
Mg2+ (25 mmol/L) 1.5
dNTP (2.5 mmol/L) 2.5
引物 (2.5 μmol/L) 5.0
Taq DNA 聚合酶 (5 U/μL) 0.3
模板 DNA 1.5
超纯水 11.7
3.4 RAPD 反应电泳检测
按照上述正交试验确定的最佳 RAPD-PCR 反
应体系及扩增程序对驴皮及其伪品马皮进行电泳检
测，结果见图 5。可知驴皮样品中位于 1 000～1 100
bp、900～1 000 bp、600～700 bp、500～600 bp 以
及 300～400 bp 有 5 条较为清晰的 DNA 条带。在马
皮样品中大部分 DNA 条带与驴皮样品比较接近，
但有两条明显的条带是不一致的，其中位于 1 600～
1 700 bp 的弱亮条带在马皮中有而驴皮中没有，而
位于 300～400 bp 的较明亮条带在驴皮中有而马皮
中没有，这两条 DNA 带有可能成为区别驴皮与马
皮的特异性条带。
3.5 聚类分析
聚类分析结果见图 6。可知，在距离为 5～15

1～12-驴皮样品 13～15-马皮样品 M-Marker
1—12-furs of E. asinus 13—15-furs of E. caballus orientalis M-Marker
图 5 引物 S22 扩增结果的电泳检测
Fig. 5 Electrophoresis of Primer S22 PCR

1～12-驴皮样品 13～15-马皮样品
1—12-furs of E. asinus 13—15-furs of E. caballus orientalis
图 6 样品聚类分析图
Fig. 6 Cluster analysis of samples
时，样品明显地分成 2 类，即驴皮样品和马皮样品。
其中，驴皮样品 1～7 与 9～11 距离较为接近，聚为
一类，而样品 8 和 12 距离较为接近，聚为一类。马
皮样品 13 和 15 距离较为接近，聚为一类，而样品
14 距离较远，单独聚为一类。对聚类分析结果进一
步分析可知，驴皮样品和马皮样品可明显地区分，
聚类分析结果与电泳检测结果具有一致性。
4 讨论
PCR 反应程序包括预变性、变性、退火以及延
伸的温度和时间等参数，其中退火温度是最为重要
的参数之一。退火温度过高会使引物与模板难于结
合，过低则会引起引物与模板的非特异性结合，导
致 RAPD 反应的特异性降低[8]。本研究筛选出的驴
皮 RAPD 反应的最佳退火温度为 37 ℃，这与关于
哺乳动物的现有研究如藏獒、西藏牦牛、大汉梅猪
等物种 RAPD-PCR 反应的退火温度较为接近[9]。在
建立和优化 RAPD-PCR 反应体系时，常用单因素考
察法和正交试验设计两种方法。但是单因素考察法
无法考虑到各因素间的相互影响作用，而正交试验

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp

2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M
0 5 10 15 20 25
13
15
14
8
12
10
11
1
7
9
5
6
3
4
2
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设计具有均衡分散、综合可比、效应明确等特点，
可 较 快 地找 到 因 素间 的 最 优组 合 [10-12] 。 在
RAPD-PCR 反应体系中引物浓度通常为 0.1～2.0
μmol/L，这时大多数引物能产生6～12条扩增条带[13]。
Taq DNA 聚合酶是反应中的催化剂，一般在 25 μL
的体系中使用 1～5 U的Taq酶，用量过低则使DNA
新链合成效率太低，导致扩增产物过少，过高则容
易产生非特异性扩增产物[14]。DNA 模板量过低，
会导致无扩增产物或者扩增产物少，过高又会导致
扩增条带模糊和非特异性产物的出现[15]，一般认为
5～500 ng的模板量能提供扩增效果较好的谱带[16]。
因此，本研究重点对这 5 个重要影响因素进行了正
交试验研究，确定了最佳的反应体系。
本研究对采集自黑龙江、内蒙古、辽宁、吉林、
河北等地的 12 批驴皮样品及 3 批马皮样品进行了
DNA 分子标记研究，凝胶电泳检测结果与聚类分析
结果均显示驴皮和马皮可以明显地区分开，且在
300～400 bp 处，驴皮样品具有一条明显亮带，而马
皮样品则没有，表明所建立的 RAPD-PCR 分析方法
不仅有望成为鉴别驴皮及其伪品的有效而简便的方
法，而且可以作为驴皮药材的质量控制新方法。针
对驴皮样品中扩增条带的特异性，可以将 300～400
bp 处条带进行基因测序研究，从而设计出鉴别驴皮
的特异性引物，相关工作正在进行中。
鉴于驴皮商品来源复杂、质量参差不齐、鉴别
非常困难的现状，建立 RAPD 分析方法用于驴皮的
鉴别及其质量控制是一种新的探索。由于动物类药
材本身存在着某些特殊性，而且产地遍布全国，考
虑到不同产地、不同人工繁殖条件等因素可能会影
响到 RAPD-PCR 鉴别结果，为此在后续的研究中还
需收集更多产地的驴皮样品以及更多种类的混伪
品，增加鉴别的可信度，消除可能存在的假阳性。
综上所述，本实验构建的 RAPD-PCR 方法为
25 μL 反应体系中含有 Taq 酶 1.5 U、Mg2+ 0.15
mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、模板 DNA 1.5 μL、引
物 0.5 μmol/L，PCR 反应条件 95 ℃预变性 5 min，
94 ℃变性 30 s，37 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，
共 30 个循环，最后 72 ℃延伸 7 min。位于 300～
400 bp 处的条带可明显区分驴皮与马皮，有望成为
鉴别驴皮及其伪品的特异性条带。
致谢：保定赛行阿胶有限公司为本研究提供驴
皮和马皮样品。
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