全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 2 期 2015 年 1 月

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基于核磁代谢组学的驴皮与其伪品的鉴别研究
田俊生 1，那丽丹 1, 2，向 欢 3，陈建丽 1，马晓晴 2，秦雪梅 1*
1. 山西大学 中医药现代研究中心，山西 太原 030006
2. 山西大学化学化工学院，山西 太原 030006
3. 山西大学体育学院，山西 太原 030006
摘 要：目的 使用核磁共振（NMR）代谢组学技术对驴 Equus asinus 皮及其伪品（马 E. caballus 皮、骡 E. ferus × asinus
皮）的水提物进行鉴别研究，为阿胶的鉴别和质量控制研究提供依据。方法 从去毛后的驴皮及其伪品中提取水溶性成分，
然后进行核磁共振氢谱（1H-NMR）分析，对所得的核磁数据进行水溶性成分归属指认，并进行多元统计分析。 结果 在
驴皮及其伪品 1H-NMR 图谱中指认出了 42 种水溶性成分。与驴皮比较，马皮中含较多醋酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸，
含较少乳酸、丝氨酸、焦谷氨酸、肌酸，而骡皮中含较多乳酸、肌酸、丙氨酸、胆碱，含较少甘油、醋酸，并且都具有显著
性差异（P＜0.05）。结论 初步建立了基于核磁代谢组学技术对阿胶原料驴皮与其伪品的鉴别研究方法，为阿胶原料驴皮的
鉴别和质量控制研究提供实验依据。
关键词：驴皮；阿胶；代谢组学；核磁共振；伪品鉴别
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)02 - 0255 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.02.020
Identification of donkey-hide and its counterfeits based on 1H-NMR metabolomics
TIAN Jun-sheng1, NA Li-dan1,2, XIANG Huan3, CHEN Jian-li1, MA Xiao-qing2, QIN Xue-mei1
1. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Shanxi University, Taiyuan 030006, China
2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China
3. Department of Physical Education, Shanxi University, Taiyuan 030006, China
Abstract: Objective The aqueous extracts of donkey-hide and its counterfeits (horse-hide and mule-hide) were identified using
1H-NMR metabolomics to provide the basis for the identification and quality control of donkey-hide gelatin. Methods The
water-soluble components of the hairless donkey-hide and its counterfeits were extracted and the 1H-NMR technique was applied to
analyzing the components. Moreover, the NMR data were analyzed and the component belongings were recognized using relevant
software for the multivariate statistical analysis. Results Forty-two water-soluble components were identified in donkey-hide by
1H-NMR. There were more acetate, leucine, valine, isoleucine and less lactate, serine, pyroglutamate, and creatine in the horse-hide
than in the donkey-hide; While there were more acetate, creatine, alanine, choline and less glycerol and acetate in mule-hide than in
donkey-hide. And they were all in a significant difference (P < 0.05). Conclusion The identification method of the raw material of
Colla Corii Asini, namely, donkey-hide and its counterfeits based on 1H-NMR metabolomics was established for the first time, which
provides the experimental references for the donkey-hide identification and quality control study.
Key words: donkey-hide; Colla Corii Asini; metabolomics; NMR; counterfeit identification

驴皮为马科动物驴 Equus asinus L. 的干燥皮
或鲜皮，从宋代开始就一直是制备传统中药阿胶的
原料。阿胶最初记载于《神农本草》，其中写道：“主
心腹，内崩，劳极，洒洒如疟状，腰腹痛，四肢酸疼，
女子下血安胎，久服轻身益气，一名傅致胶”[1]，历
来被誉为“补血圣药”“滋补国宝”，与人参、鹿茸
一起被誉为“中药三宝”。《中国药典》2010 年版[2]
中记载，阿胶为马科动物驴的干燥皮或鲜皮经煎煮、

收稿日期：2014-06-06
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81102833）；山西省基础研究项目（2012021031-2）；山西大学本科生科研训练项目（2014012105）
作者简介：田俊生（1980—），男，内蒙古人，博士，副教授，研究方向为中药药理与新药研发。Tel: (0351)7019297 E-mail: jstian@sxu.edu.cn
*通信作者 秦雪梅 Tel: (0351)7018379 Fax: (0351)7011202 E-mail: qinxm@sxu.edu.cn
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浓缩制成的固体胶。在唐代以前制作阿胶的原料以牛
皮为主，兼用猪、驴、马等皮，至宋代由以牛皮为主
转为驴皮为主。明代李时珍在《本草纲目》[3]中对阿
胶原料写道：“大抵古方所用多是牛皮，后世乃贵驴
皮……，当以黄透如琥珀色，或光黑如漆者为真”。
近年来，随着人们养生保健意识的增强，阿胶
所具有的滋阴、补血、养颜等多重功效越来越受到
社会各界人士的关注与欢迎，阿胶的市场需求快速
增长。驴皮作为制作阿胶的主要原料，货源紧缺，
市场上劣质皮甚至伪品（如马皮、骡皮）等纷纷出
现，导致阿胶及其复方制剂产品质量差异较大。针
对这一现状，广大学者使用液相色谱法、紫外分光
光度法、近红外光谱法等对阿胶的各种化学成分包
括蛋白质成分[4-6]、脂溶性成分[7-8]及水溶性成分（氨
基酸）[9-13]、微量元素[14-17]等进行了研究，对阿胶
原料驴皮及其伪品进行了鉴别研究[18-20]，并对阿胶
及其复方制剂的质量均一性进行了研究[21-23]。而这
些研究方法目前尚有一定的局限性，由于驴皮及其
伪品的主要成分相似，难以找到专属性成分，需要
能够进行全面整体研究的新方法。
代谢组学[24]是近年来出现的继基因组学、蛋白
组学之后的一种新型组学技术，以组群指标分析为
基础，以高通量检测和数据处理为手段，具有整体
观的研究思路，特别适合于传统食品、中草药等复
杂体系分析。其主要对某一生物或是细胞内所有低
相对分子质量（1 000 以内）代谢产物进行动态检测
以及定性定量研究，在药物毒理学研究、疾病诊断、
植物和中药等领域应用广泛，其中核磁共振（NMR）
代谢组学技术是应用较多的一种。
NMR 技术[25]是一种利用物理原理来分析物
质分子结构与性质的无损检测方法，它在化学、
生命科学中具有广泛的应用。本研究拟采用基于
1H-NMR 的代谢组学方法对驴皮及其伪品（马皮、
骡皮）进行分析，通过多元统计分析方法鉴定驴
皮及其伪品的差异水溶性成分，为阿胶的质量控
制研究提供参考。
1 材料与仪器
1.1 材料
驴皮样品采集自不同产地（黑龙江、吉林、辽
宁、内蒙古、河北）；马皮样品共 3 份，采集自河北、
内蒙古，骡皮样本采集自内蒙古，所有样本均为整
张皮，样品信息见表 1。全部样本经山西大学中医
药现代研究中心秦雪梅教授鉴定为马科动物驴
Equus asinus L.、马科动物马 E. caballus L. 和马和
驴的杂交种骡 Equus ferus × asinus 的干燥皮。凭证
样本保存于山西大学中医药现代研究中心。
表 1 样本采集信息表
Table 1 Sources information of samples
编号 样品 产地 编号 样品 产地
1-1 驴皮 黑龙江哈尔滨 5-1 驴皮 河北唐山
1-2 驴皮 黑龙江哈尔滨 5-2 驴皮 河北唐山
2-1 驴皮 吉林 6-1 驴皮 内蒙古包头
2-2 驴皮 吉林 6-2 驴皮 内蒙古包头
3-1 驴皮 辽宁锦州 7 马皮 河北保定
3-2 驴皮 辽宁锦州 8 马皮 河北邢台
4-1 驴皮 内蒙古赤峰 9 马皮 河北保定
4-2 驴皮 内蒙古赤峰 10 骡皮 内蒙古包头

1.2 仪器与试剂
核磁仪器为 Bruker 600-MHz AVANCE III 核磁
共振检测仪（600.13 MHz proton frequency），旋转
蒸发器 RE-52A（上海亚荣生化仪器厂），真空泵
SHZ-III（上海知信实验仪器技术有限公司），中草
药粉碎机（天津市赛斯特仪器有限公司），高速离心
机 LG10-2.4A（北京时代北利离心机有限公司），高
速台式冷冻离心机TGL-16（湘仪离心机），KQ5200E
型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），
101-3AB 型电热鼓风干燥箱（天津泰斯特仪器有限
公司）。二氯甲烷为分析纯（北京化工厂，批号
20120329），重水（美国默克试剂公司，批号
C20111017）。
2 方法
2.1 样品溶液的制备
结合前期实验结果[20]，取 6-1、8、10 号样本为
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研究对象。每个样本分别从不同的部位（头部、四肢、
背部等）取样，平行制备 6 份，制备方法如下：称取
驴皮及其伪品（马皮、骡皮）样品粉末 500 mg，分别
置于 150 mL 锥形瓶中，加入 25 mL 蒸馏水，浸泡 40
min，超声提取 30 min；转入 50 mL 离心管中，4 000
r/min 离心 5 min，取上清液于 125 mL 分液漏斗中，
加入二氯甲烷 25 mL，振摇萃取 10 min，取水层置于
25 mL 圆底烧瓶中，减压蒸干，加入 700 μL 重水（含
0.005% 3-三甲基硅基丙酸钠），超声助溶，转移至 1.5
mL 离心管中，13 000 r/min 离心 20 min，取上清液 600
μL，置于 5 mm 核磁管中，待测。
2.2 NMR 测定条件
数据采集在 Bruker 600-MHz AVANCE III NMR
谱 仪 上 进 行 ， 采 用 nuclear overhauser effect
spectroscopy（NOESY）脉冲序列，参数设置为自
旋弛豫延迟为 320 ms、自由感应衰减为 64 K 数据
点、谱宽为 8 000 Hz、扫描 64 次。
2.3 1H-NMR 图谱处理
采用 MestReNova（Mestrelab Research，Santiago
de Compostella）核磁图谱专业处理软件对全部谱图
进行内标校准、相位校准及基线校准等规格化处理。
然后以 δ 0.01 积分段为单位，对 δ 0.70～8.47 区域
的谱图进行等宽度分割，去除 δ 4.70～5.09 区域水
峰；对图谱进行积分，对所产生的积分数据进行归
一化处理，进行多元统计分析。
2.4 统计学分析
采用 SIMCA-P 13.0软件对上述NMR采集处理
的归一化积分数据进行中心化和规格化后，进行主
成分分析（principal component analysis，PCA）和
正交偏最小二乘判别分析（ orthogonal partial
least-squares discriminant analysis，OPLS-DA）。然
后采用独立样本 t 检验对具有差异的水溶性成分进
行统计分析，找出差异性成分。
3 结果与分析
3.1 NMR 图谱的指认与分析
结合每个水溶性成分的化学位移，裂峰情况及
偶合常数，参照 Chenomx NMR Suite（Chenomx
Inc.，Edmonton，AB，Canada）数据库，并结合文
献对本实验所得的图谱进行指认，从图谱中共指认
了 42 种化合物（图 1），主要包括氨基酸、有机酸
等，化学位移指认结果见表 2。
由 1H-NMR 图谱直接观察可以发现，驴皮、马
皮、骡皮图谱的峰高、峰面积及峰的种类差别较为
明显，因此推断它们的水溶性成分在其相对量和种
类上都具有一定的差异。
3.2 NMR 代谢组学数据分析
采用 PCA 分析法及聚类分析法对驴皮
（6-1-1～6）、马皮（8-1～6）、骡皮（10-1～6）的
1H-NMR 图谱进行分析，结果见图 2、3。从图 2
中可以看出，驴皮与马皮、驴皮与骡皮有较好的
分开趋势。而它们的聚类分析图（图 3）也可以
进一步证明驴皮与马皮、驴皮与骡皮之间的差异
性。为了发现驴皮与马皮之间的差异性水溶性成
分，进一步对驴皮、马皮数据进行 OPLS-DA 分析，

图 1 1H-NMR 图谱主要水溶性成分归属指认
Fig. 1 1H-NMR spectra of attribution for main water soluble constituents
骡皮
马皮
驴皮
31
32 20 4
30 29
21
18 16
15
10 5
2 1
42
41
23 40
39
22
36
24
38
37
36
35
34
6
12 33 25
7 27
28
26
9 19 17
14
13
12
11 9
8
7 6
3
8.4 8.0 7.6 7.2 6.8 6.4 6.0 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
δ
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表 2 主要水溶性成分峰归属
Table 2 Peak attribution in 1H-NMR spectra for water-soluble constituents
编号 成分 δH 编号 成分 δH
1 2-羟基丁酸 0.90 (t, J = 7.2 Hz) 22 苯丙氨酸 7.40 (m)
2 异亮氨酸 1.02 (d, J = 7.2 Hz), 0.99 (t, J =7.2 Hz) 23 肌肽 2.68 (m), 7.1 (s), 8.1 (s)
3 亮氨酸 0.95 (t, J =6.6 Hz) 24 肌氨酸 2.72 (m), 7.1 (s)
4 缬氨酸 1.04 (d, J =7.8 Hz), 0.98 (d, J =7.2 Hz) 25 鹅肌肽 2.75 (s), 3.62 (s)
5 丙酸 1.07 (t, J =7.8 Hz), 2.19 (q, J =7.8 Hz) 26 肌酸 3.02 (s), 3.92 (s)
6 乳酸 1.33 (d, J = 6.6 Hz), 4.11 (q, J = 6.6 Hz) 27 肌酸酐 3.03 (s), 4.04 (s)
7 苏氨酸 1.33 (d, J = 6.6 Hz) 28 丙二酸 3.14 (s)
8 丙氨酸 1.44 (d, J = 7.8 Hz) 29 胆碱 3.20 (s), 3.52 (t, J = 4.8 Hz)
9 赖氨酸 1.73 (m), 3.02 (t, J = 7.8 Hz) 30 甘油 3.54 (dd, J = 6.6, 5.1 Hz), 3.63 (dd, J = 11.8, 4.3 Hz)
10 醋酸 1.91 (s) 31 甘氨酸 3.56 (s)
11 脯氨酸 2.04 (m) 32 乙醇胺 3.15 (t, J = 5.4 Hz)
12 焦谷氨酸 2.05 (m), 2.40 (t, J = 7.8 Hz) 33 丝氨酸 3.93 (dd, J = 5.67, 3.95 Hz)
13 谷氨酸 2.13 (m), 2.36 (m) 34 尿嘧啶 5.79 (d, J = 7.2 Hz), 7.52 (d, J = 7.8 Hz)
14 L-羟脯氨酸 2.15 (m), 4.34 (m) 35 尿苷 5.90 (dd, J = 12.96, 6.31Hz)
15 2-氨基乙二酸 2.24 (t, J = 7.8 Hz) 36 尿刊酸 6.38 (d, J = 9.6 Hz), 7.30 (d, J = 9.6 Hz)
16 琥珀酸 2.39 (s) 37 延胡索酸 6.51 (s)
17 柠檬酸 2.54 (d, J = 14.4 Hz) 38 酪氨酸 6.89 (m), 7.18 (m)
18 3-苯丙酸 2.50 (t, J = 7.8 Hz), 2.90 (t, J = 7.8 Hz) 39 组氨酸 7.10 (s), 7.89 (s)
19 β-氨基丙酸 2.56 (t, J = 6.6 Hz) 40 黄嘌呤 7.90 (s)
20 天冬氨酸 2.82 (dd, J = 3.8, 13.8 Hz) 41 腺嘌呤 8.17 (s), 8.21 (s)
21 N-甲基乙内酰脲 2.92 (s), 4.08 (s) 42 甲酸 8.46 (s)


图 2 1H-NMR 谱 PCA 分析 3D 散点图
Fig. 2 PCA 3D score plot in 1H-NMR spectra
散点图和载荷图见图 4 所示。由图 4 可知，驴皮与
马皮能够明显分开，差异显著。依据离原点越远的
点对分组贡献越大的原则，同时结合 Excel 软件对
位于在 OPLS-DA 的载荷图中边缘成分的峰面积进
行独立样本 t 检验，得到峰面积具有显著差异性的

图 3 1H-NMR 谱聚类分析图
Fig. 3 Cluster analysis in 1H-NMR spectra
水溶性成分，如图 5 所示。由图 5 可知，马皮中含
较多醋酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸，含较少乳
酸、丝氨酸、焦谷氨酸、肌酸，与驴皮比较具有显
著性差异（P＜0.05，0.01）。为了发现驴皮与骡皮
之间的差异水溶性成分，也对驴皮、骡皮数据进行
0 5 10 15 20 25
6-1-2
6-1-5
6-1-3
6-1-4
6-1-1
6-1-6
8-3
8-4
8-2
8-1
8-5
8-6
10-1
10-5
10-2
10-3
10-6
10-4
驴皮
马皮
骡皮
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图 4 驴皮与马皮 1H-NMR 谱 OPLS-DA 散点图及载荷图分析
Fig. 4 OPLS-DA score plot and its S-plot in 1H-NMR spectra of donkey-hide and horse-hide

与驴皮比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下同
*P < 0.05 **P < 0.01 vs donkey hide, same as below
图 5 驴皮与马皮 1H-NMR谱 OPLS-DA分析载荷图中具有
显著性差异的水溶性成分
Fig. 5 Water-soluble components with significant difference
of OPLS-DA S-plots in 1H-NMR spectra of donkey-hide
and horse-hide
了 OPLS-DA 分析，做了它们的散点图和载荷图，如
图 6 所示。由图可知，驴皮与骡皮能够明显分开，差
异显著。依据离原点越远的点对分组贡献越大的原则，
同时对位于在 OPLS-DA 的载荷图中边缘成分的峰面
积进行独立本 t 检验，得到峰面积具有显著差异性的水
溶性成分，如图 7 所示。由图 7 可知，骡皮中含较多
乳酸、肌酸、丙氨酸、胆碱，含较少甘油、醋酸，与
驴皮比较具有显著性差异（P＜0.05，0.01）。
4 讨论
在对实验样品的前期处理过程中发现，不同动物
的皮的干燥程度、厚薄程度、毛的浓疏程度会有所不
同，对实验结果可能产生一定程度的影响；同时，同
一张皮中，不同部位厚薄程度、毛的浓疏程度会有
所差异，在样品的去毛过程及粉碎过程中难易程度
不同，可能对所得样品有一定影响，因此本实验中

图 6 驴皮与骡皮 1H-NMR 谱 OPLS-DA 散点图及载荷图分析
Fig. 6 OPLS-DA score plot and its S-plot in 1H-NMR spectra of donkey-hide and mule-hide
样本制备之前先尽可能除去毛。在提取溶剂选择上，
对水相和有机相的提取物进行了预试验，发现水提
取物核磁图谱中化合物种类较多、相对量较大，因
此选择水为溶剂，这也与传统的阿胶制备工艺具有
一致性。另外，本实验对驴皮与其伪品以及不同产
地驴皮分别进行了 PCA 分析，结果发现种间差异明
显大于种内差异。由于所收集的马皮与骡皮样本有
限，在后续研究中将加强伪品样本收集的力度，并
对不同产地的样本进行分析。
核磁图谱分析结果中发现驴皮、马皮中出现了

驴皮
马皮

0.6
0.2
−0.2
−0.6
−1.0

0.6
0.2
−0.2
−0.6
−1.0
−1.5 −1 −0.5 0 0.5 1 −0.4 −0.2 0 0.1 0.3
t[1] p[1]
t 0[
1]

pc
or
r [
1]

驴皮
马皮
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0
相
对
表
达
量

**
**
*
* **
**
**
*
驴皮
骡皮
−2 −1.5 −1.0 −0.5 0 0.5 1.0 1.5 −0.4 −0.2 0 0.1 0.3
t[1] p[1]
0.6
0.2
−0.2
−0.6
−1.0
0.5
0
−0.5
−1.0
−1.5
pc
or
r [
1]

t 0[
1]

醋酸 亮氨酸 缬氨酸 异亮氨酸 乳酸 丝氨酸 焦谷氨酸 肌酸
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图 7 驴皮与骡皮 1H-NMR谱 OPLS-DA分析载荷图中具有
显著性差异的水溶性成分
Fig. 7 Water-soluble constituents of OPLS-DA S-plots in
1H-NMR spectra of donkey-hide and mule-hide
醋酸峰，且马皮中该峰的强度很大，对出现该现象
可能的原因进行了探讨。有文献报道用 Na2SO3[26]
与醋酸的溶液处理生皮，通过所释放的 SO2 来达到
抑菌的目的，因此猜测该现象可能的原因是马皮前
期加醋酸对其进行了防腐抑菌；为了进一步提高结
果的可靠性，在对核磁图谱积分处理时，切除了醋
酸峰，将所得数据进行 PCA 分析，发现驴皮、马皮、
骡皮仍具有较好的分开趋势。
图谱分析结果发现，有一些峰仅出现在马皮中，
如丙酸、2-羟基丁酸、2-氨基乙二酸、β-氨基丙酸
及 3-苯丙酸；同时，本实验也发现了可能存在于驴
皮或马皮中但不存在于骡皮中的物质有黄嘌呤和腺
嘌呤，但是，由于它们峰面积较小，因此并未进行
差异成分统计分析。对于《中国药典》2010 年版中
阿胶项下测定指标 L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和
L-脯氨酸，可明显观察到马皮中甘氨酸峰较小。但
由于核磁分析灵敏度及干扰峰的限制，还需进一步
采用 LC-MS 或 GC-MS 等手段对其进行完善分析。
另外，将驴皮的核磁图谱与阿胶（保定赛行阿
胶有限公司，生产批号 121003）（样品制备方法同
“2.1”项）核磁图谱进行对比，发现阿胶中氨基酸
类物质相对质量分数明显高，说明在阿胶的制备过
程中，驴皮中的氨基酸类成分得到富集；同时发现
它们的物质种类存在差异，如驴皮中的乳酸、胆碱
等阿胶中并没有，而阿胶中的乙酰丙酸（亦称戊隔
酮酸、左旋糖酸、果糖酸，是水解产生）在驴皮中
没有，这可能与制备阿胶过程中的工艺及所加辅料
有关，有待进一步研究。
综上所述，基于核磁代谢组学的驴皮与其伪品
的鉴别研究方法简便有效，为阿胶原料的质量控制
研究提供参考。在本实验基础上，进一步使用 NMR、
LC-MS、GC-MS 等技术对不同厂家的阿胶进行质量
差异性研究及对不同生产批次的阿胶复方制剂进行
质量均一性研究，从而建立相对完整的阿胶质量控
制体系。
参考文献
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驴皮
骡皮
乳酸 肌酸 丙氨酸 胆碱 甘油 醋酸
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
相
对
表
达
量

**
**
**
*
**
**
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 2 期 2015 年 1 月

• 261 •
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