全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 11 期 2014 年 6 月

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DNA 条形码技术鉴定贝母属植物
俞 超，梁孝祺，陈金金，盛梦俊，冯亚斌，王忠华*
浙江万里学院 生物技术研究所，浙江 宁波 315100
摘 要：目的 采用 DNA 条形码技术，比较了条形码序列 ITS1 和 ITS2 在贝母属植物中的鉴定效果。方法 从 8 个贝母属
21 个样品中提取了基因组 DNA，进行 ITS1、ITS2 序列的 PCR 扩增和测序，并比较了各样品 DNA 提取率、PCR 扩增率及
测序成功率。测序数据采用 BLAST 搜索法评价 2 种序列的鉴定能力，采用 SPSS 软件进行遗传距离分析，采用 MEGA 软件
进行系统发育树的构建。结果 对比不同物种 ITS1、ITS2 序列的一级结构差异，发现其 ITS1 序列长度为 205～229 bp，有
信息位点 27 个（所占比例 11.8%），鉴定成功率为 72.2%；ITS2 序列长度为 236～244 bp，有信息位点 20 个（所占比例 8.2%），
鉴定成功率为 100%。ITS1 序列的种内及种间遗传距离分别为 0.001 8 和 0.066 1，而 ITS2 序列的种内及种间遗传距离分
别为 0.000 5 和 0.046 8，且种内高度保守；系统发育树构建结果显示，2 种 ITS 序列能准确区分出浙贝母类群、川贝母类群
和北方贝母类群，而 ITS2 序列所构建的系统发育树准确度更高。结论 ITS2 序列能够更准确鉴定不同物种贝母，适合作为
贝母属植物的通用条形码序列。
关键词：贝母属；ITS1；ITS2；DNA 条形码；分子鉴定
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)11 - 1613 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.11.021
Identification of plants in Fritillariae L. by DNA barcoding technology
YU Chao, LIANG Xiao-qi, CHEN Jin-jin, SHENG Meng-jun, FENG Ya-bin, WANG Zhong-hua
Institute of Biotechnology, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China
Abstract: Objective DNA barcoding technology was employed to compare the identification efficiency of ITS1and ITS2 sequences
in plants of Fritillariae L. Methods Twenty-one samples from eight species of Fritillariae L. were collected. Genomic DNAs from
these samples were extracted, ITS1 and ITS2 sequences were amplified by PCR, and the PCR products were sequenced. The DNA
extraction rate, PCR amplification rate, and sequencing achievement ration were compared. The identification efficiency of two
sequences was evaluated by BLAST-Search, the distribution of genetic distance was analyzed by SPSS software, and the phylogenetic
trees were constructed by MEGA software. Results Comparing the primary structures of ITS1 and ITS2 sequences amplified from
different species, the results showed that the sequence length of IT1 was 205—229, informative sites were 27 and occupied 11.8%, and
the identification achievement rate was 72.2%; The sequence length of IT2 was 236—244, informative sites were 20 and occupied
8.2%, and the identification achievement rate was 100%. Intra-specific and inter-specific genetic distances of ITS1 were 0.001 8 and
0.066 1, and those of ITS2 were 0.000 5 and 0.046 8, respectively; The results also showed that ITS2 was relatively conservative in
intra-species; The NJ phylogenetic trees showed that these two sequences could accurately identify Fritillaria thunbergii, F. cirrhosa,
and north-Fritillaria, but phylogenetic trees based on ITS2 had a higher degree of accuracy. Conclusion ITS2 sequence is optimal as
barcoding sequence for Fritillaria L. genus and is more suitable for identifying the different species of Fritillaria L.
Key words: Fritillaria L.; ITS1; ITS2; DNA barcoding; molecular; identification

浙贝母是中国传统中药之一，原产地为宁波
象山，现产地主要为鄞州、磐安、南通、东阳等
地，是著名的“浙八味”之一，具有清热散结、
化痰止咳的功效，主治痰火咳嗽、肺痈、乳痈、
疮毒、瘰疬等[1]，在祛痰[2]、平喘和镇咳[3]上的效
果显著，以及在抗肿瘤[4]及逆转多药耐药方面[5]
作用明显。
贝母属植物部分类群的特征性状相似性高，如

收稿日期：2013-10-22
基金项目：浙江省中药材育种专项资助（2012C12912）；宁波市科技局择优委托项目资助（2012C10036）；浙江万里学院重中之重学科自设课
题项目资助（ZS2013006）
作者简介：俞 超（1979—），女，讲师，研究方向为植物分子生物学。E-mail: 32897949@qq.com
*通信作者 王忠华 E-mail: wang1972@zwu.edu.cn
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浙贝母与其近缘品种湖北贝母、东贝母性状相似
性高，川贝母与米贝母、砂贝母、太白贝母等相
似性较高，且市场流动的贝母多为干燥鳞茎切片，
给药用植物的鉴定带来了困难，导致药材品质不
一[6]。近年来遗传物质多样性的鉴别方法技术十
分热门，包括 RAPD、AFLP、ISSR 等分子标记方
面的研究，都为浙贝母及其贝母属其他植物的物
种鉴定提供了可行的方法[7-8]。
DNA 条形码技术是一种建立在 PCR 技术及
DNA 测序技术基础之上的新型分子鉴定技术，它利
用基因组中一段通用的标准短序列进行物种鉴定及
种间亲缘关系的分析[9-12]。动物 DNA 条形码的研究
已经趋向成熟[13]，而在植物界，还未能找到一个能
覆盖所有植物，具有高度通用性和高鉴定能力的
DNA 序列[14-15]。但已有研究发现，ITS 区间在种间
的变异距离较大[16]，是潜在的优秀 DNA 条形码候
选序列[17-18]。
本实验通过 DNA 条形码技术，利用 ITS1 和
ITS2 序列对包括浙贝母在内的贝母属主要物种进
行物种鉴定及聚类关系分析，评价其鉴定效果。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验的 8 种贝母属植物分别为浙贝母 F.
thunbergii Miq.、暗紫贝母 F. unibracteata Hsiao.、
卷叶贝母 F. cirrhosa D. Don.、梭砂贝母 F.
delavayi Franch.、湖北贝母 F. hupehensis Hsiao.、
伊贝母 F. pallidiflorae、东贝母 F. thunbergii
Miq.Var. Chekiangensis.、平贝母 F. ussuriensis
Maxim.，其中浙贝母包括 5 个主要栽培品种（多
子、狭叶、宽叶、三子、轮叶）及 5 个变种（变
种 A、变种 B、变种 C、变种 D、变种 E）共 21
份样品，样品信息及来源见表 1。其中样品 P01～
P11 采集地为宁波市章水镇养殖基地；样品 P12
采集地为江苏南通市养殖区；样品 P13 采集地为
象山县下峙后村养殖地；样品 P14、P15 为磐安县
新渥镇种植基地采集，其余样品均由宁波中药制
药有限公司提供。上述样品均由浙江省中药研究
所沈晓霞高级工程师鉴定。
表 1 贝母样品信息及其来源
Table 1 Samples information and sources
编号 种 名 性 质 产 地 编号 种 名 性 质 产 地
P01 浙贝母（多子） 叶片鲜品 浙江省宁波市章水镇 P12 浙贝母（狭叶） 鳞茎鲜品 江苏省南通市
P02 浙贝母（狭叶） 叶片鲜品 P13 浙贝母（狭叶） 鳞茎鲜品 浙江省宁波市象山县
P03 浙贝母（宽叶） 叶片鲜品 P14 浙贝母（狭叶） 鳞茎干片 浙江省金华市磐安县
P04 浙贝母（三子） 叶片鲜品 P15 东贝母 鳞茎鲜品
P05 浙贝母（轮叶） 叶片鲜品 S01 暗紫贝母 鳞茎干品 四川省甘孜州东部
P06 浙贝母（变种 A） 叶片鲜品 S02 卷叶贝母 鳞茎干品
P07 浙贝母（变种 B） 叶片鲜品 S03 梭砂贝母 鳞茎干品
P08 浙贝母（变种 C） 叶片鲜品 S04 伊贝母 鳞茎干品 新疆省伊犁哈萨克自治州
P09 浙贝母（变种 D） 叶片鲜品 S05 湖北贝母 鳞茎鲜品 湖北省宜昌市五峰县
P10 浙贝母（变种 E） 叶片鲜品 S06 平贝母 鳞茎干品 黑龙江五常
P11 浙贝母（狭叶） 鳞茎鲜品
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取、PCR 扩增及测序 浙贝母新鲜
鳞茎切片后，置于洗净灭菌的塑料方盒中，编号，
65 ℃烘干 3～5 h。称取新鲜叶片 200～300 mg，
加入适量液氮充分研磨；称取烘干的鳞茎样品
80～100 mg，直接研磨成粉末；所有浙贝母叶片和
鳞茎样品使用北京康为世纪公司的植物基因组
DNA 提取试剂盒提取总 DNA。在凝胶成像仪下观
察拍照并筛选出提取效果较好的样品用于下一步
的 PCR 扩增。
PCR 反应体积为 30 μL，体系内包含：ddH2O 17
μL、2×Taq mastermix 10 μL、DNA 模板 1 μL、正
向引物 1 μL、反向引物 1 μL。ITS1 序列正向引物
为 5’-AAGGATCATTGTCGAGAACCG-3’，反向引
物为 5’-TTGCGTTCATAGACTCGATGG-3’；ITS2
序列正向引物为 5’-GCATCGATGAAGAACGCAG-
C-3’，反向引物为5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。
将反应体系中的所有成分准确移取至 PCR 管
中并充分混匀后放入 PCR 仪中。扩增程序：ITS1
为 94 ℃变性 10 min，再进行 35 个循环（94 ℃变
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性 30 s，54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s），最后 72
℃延伸 10 min。ITS2 为 94 ℃变性 10 min，再进行
35 个循环（94 ℃变性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃
延伸 45 s），最后 72 ℃延伸 10 min。
选择 PCR 扩增成功的 DNA 样品交由英潍捷基
（上海）贸易有限公司进行测序。
1.2.2 数据处理 为了更准确地评价 ITS 序列的鉴
定能力，从 GeneBank 中下载了 12 种其他贝母属序
列，见表 2。并运用各种基础软件及生物技术软件
对 DNA 测序结果进行分析，其主要分析步骤及所
用软件见表 3。除了 PC 端的软件外，还利用 BLAST
在线搜索页面（http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/ Blast.cgi?
PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlas
t&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=o
n&LINK_LOC=blasthome）对测序结果进行初步搜
表 2 12 种其他贝母属序列信息
Table 2 Sequence information of 12 species of Fritillaria L.
downloaded from GeneBank
编号 种名 GeneBank
Q01 甘肃贝母 F. przewalskii GQ205115.1
Q02 暗紫贝母变种F. unibracteata var. longinectareaGQ205119.1
Q03 太白贝母 F. taipaiensis HM045470.1
Q04 瓦布贝母 F. wabuensis GQ205131.1
Q05 轮叶贝母 F. maximoviczii HM045471.1
Q06 阿尔泰贝母 F. meleagris AY616730.1
Q07 滩贝母 F. karelini AY616727.1
Q08 黑百合 F. camtschatcensis AY616714.1
Q09 大金贝母 F. dajinensis GQ205114.1
Q10 厚叶贝母 F. crassifolia AY616717.1
Q11 细叶百合 L. pumilum AF088194.1
Q12 土贝母 Bolbostemma paniculatum FJ980305.1
表 3 数据处理及软件
Table 3 Data processing and software
分析步骤 软件 文献
引物设计 Primer Premier 19
测序峰图查看、序列文本提取 Chromatogram 2.3 19
多序列对比、修剪 ClustaW 2 19
突变位点、保守位点统计 MEGA 4.0 20
遗传距离矩阵、转换/颠换计算 MEGA 4.0 20
系统发育树构建 MEGA 4.0 19-20
遗传分布、平均遗传分布计算 Matlab 21
索，确认测序准确性。在序列信息分析步骤，运用
SMS 网站的在线 DNA 和蛋白质序列处理工具
（http://www.91bio.com/ SMS2/dna_stats.htmL），对各
个序列的碱基组成、G＋C 量进行计算。
2 结果与分析
2.1 DNA 提取、PCR 扩增及测序
本实验对 10 份叶片样品，6 份鳞茎干品和 5
份鳞茎鲜品提取了总 DNA，电泳鉴定结果见图 1，
DNA 长度在 15 000 bp 左右，与预期片段大小相
符。挑选出条带较完整清晰的 DNA 样品，进行
ITS1、ITS2 序列的 PCR 扩增，ITS1 和 ITS2 序列
扩增后的片段长度分别为 400 bp 和 350 bp 左右，
部分样品的 PCR 产物电泳图见图 2。整理 PCR 扩
增成功的 DNA 样品交由英潍捷基（上海）贸易有
限公司进行测序。

图 1 样品 DNA 提取产物电泳图
Fig. 1 Electrophoregram of DNA extracted from some samples
2.2 ITS 序列信息
对测序所得序列进行修剪，ITS2 序列去除两端
5.8 S 和 26 S 区段，ITS1 序列去除两端 18 S 和 5.8 S
区段，获得 ITS1、ITS2 间隔区序列。其中 ITS1 序
列的片段长度在 205～229 bp，ITS2 序列的片段长
度在 237～244 bp。选取本实验材料中的 8 个不同种
贝母（P14、P15、S01、S02、S03、S04、S05、S06）
加上 12 条网上下载的贝母序列，计算保守位点、信
息位点、突变位点及转换/颠换值，通过 Blast1 搜索法
计算序列的鉴定效率，计算结果见表 4，通过 MEGA
的 Sequence Data Explorer 功能比对序列信息见图 3。
2.3 遗传距离分析
通过 MEGA 软件分别计算 ITS1、ITS2 序列种
内（浙贝母）及种间（贝母属不同物种）的遗传距
离，基于 Kimura 2-parameter（K2-P）距离模型，建
立种内及种间遗传距离矩阵[19]。通过 Overall mean
distance 算法，计算出 ITS1 序列的种内及种间平均
7 500 bp
5 000 bp
2 500 bp

1 000 bp

500 bp
S06 S05 S04 S03 S02 S01 P15 P14 P13 P12 P11 M P10 P09 P08 P07 P06 P5 P04 P03 P02 P01 M
7 500 bp
5 000 bp
2 500 bp
1 000 bp
500 bp
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图 2 样品中 ITS1 (A) 和 ITS2 (B) 序列的 PCR 产物电泳图
Fig. 2 Electrophoregram of PCR products from samples ITS1 (A) and ITS2 (B)
表 4 ITS1 和 ITS2 序列基本信息
Table 4 Main information of ITS1 and ITS2 sequences
序列 全长 / bp G＋C 量 / % 保守位点 变异位点 信息位点 转换/颠换 鉴定效率 / %
ITS1 205～229 67.22 154 75 27 5.373 72.2
ITS2 236～244 69.25 192 51 20 3.802 100

遗传距离分别为 0.001 8 和 0.066 1，而 ITS2 序列的
种内及种间平均遗传距离分别为 0.000 5和 0.046 8。
再利用 Matlab 软件结合遗传距离矩阵的数据，
计算 ITS1、ITS2 序列在种内及种间的遗传距离分
布，生成遗传距离分布柱状图，该柱状图代表了条
形码序列两两对比的遗传距离在各距离范围内所占
的比值，体现了该 DNA 条形码序列在不同物种中
遗传距离的分散度和在同一物种中的稳定度。
从 ITS1、ITS2 序列遗传距离分布图可见（图
4），ITS1 序列的种内与种间变异分布重叠度较高，
其种内各样品遗传距离在 0～0.02的序列占比高达
18.75%，种间则为 21.57%，表明 ITS1 序列在种内
的稳定性不高，重叠度较高，影响鉴定效果。使得
种间遗传距离在 0.10～0.18 内均有分布。ITS2 的
遗传距离高峰集中在 0.04～0.08，种内种间遗传距
离分布重叠度较低。ITS2 序列种内高度保守，变
异序列仅占 6.25%。ITS1 序列过大的遗传距离可能
使其聚类分析结果远离同属物种而接近近缘属物
种，而 ITS2 序列更为保守稳定，更适合作为条形
码序列。
2.4 系统发育树建立
选取本实验材料中的 8 个不同种贝母（P14、
P15、S01、S02、S03、S04、S05、S06）与种内发
生变异的浙贝母序列（P03、P07、P10），加上 12
条网上下载的贝母序列，运用 MEGA 4.0 软件，基
于 K2-P 距离模型进行 ITS1、ITS2 序列的 NJ 树构
建，并进行 Bootstrap consensus tree 显著性筛选[20]。
结果见图 5。
对比 ITS1 序列与 ITS2 序列所构建的 NJ 树，
发现 ITS1 序列在浙贝母中的遗传稳定性较差，样品
P03、P07、P10 均有一定程度变异，其亲缘关系接
近于 P15，且 ITS1 系统发育树中，浙贝母类群被划
分为川贝母类群的一个分支，而川贝母类群中的
S03 和甘肃贝母（GQ205115.1）、S01 和大金贝母
（GQ205114.1）等均由于序列无差异而难以被区分。
ITS2 序列构建的聚类直观图，在区分北方贝母类群、
川贝母类群、浙贝母类群的效果明显，区分度和准
确度高，不同贝母类群的变异速度较均匀。但是无
论是 ITS1 序列还是 ITS2 序列，都难以区分主产
于新疆地区的阿尔泰贝母、伊贝母等和主产于东
S06 S05 S04 S03 S02 S01 P15 P14 P13 P12 P11 M P10 P09 P08 P07 P06 P05 P04 P03 P02 P01 M
S06 S05 S04 S03 S02 S01 P15 P14 P13 P12 P11 M P10 P09 P08 P07 P06 P05 P04 P03 P02 P01 M
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
B
A
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图 3 贝母属不同物种 ITS1 (A) 和 ITS2 (B) 序列对比图
Fig. 3 Sequence comparison on ITS1 (A) and ITS2 (B) of different species of Fritillaria L.

1-0 2-0～0.02 3-0.02～0.04 4-0.04～0.06 5-0.06～0.08 6-0.08～0.10
7-0.10～0.12 8-0.12～0.14 9-0.14～0.16 10-0.16～0.18
图 4 ITS1 (A) 和 ITS2 (B) 序列种内及种间遗传距离分布
Fig. 4 Intraspecific and interspecific genetic distance
distribution of ITS1 (A) and ITS2 (B)
北地区的平贝母、轮叶贝母等。推测其两类居群
为同一个祖先且在相似环境中遗传距离较小，差
异较少。通过考察各个贝母物种的地理分布和形
态学差异[22]，对比 NJ 树聚类分析结果认为 ITS2
在其物种鉴定及聚类分析效果上具有简单、准确、
高效的特点，在大量样本的物种鉴定中，具有一定
的优势。
3 讨论
3.1 种内遗传情况对比
将本实验计算得出的 ITS1 与 ITS2 序列的平均
遗传距离、可变位点占比，与柑橘属 DNA 条形码
鉴定[20]中的实验结果进行对比，发现同为 ITS 区域
的序列，贝母属的平均遗传距离 ITS1 为 0.066 1、
ITS2 为 0.046 8，要高于柑橘属的 0.030 5 和 0.025 7。
但是信息位点占比 ITS1 为 11.8%、ITS2 为 8.2%，
略低于柑橘属的 14.7%和 14.6%。原因可能是选取
的贝母属物种聚类关系较分散，而文献中柑橘属样
品含有较多的近缘物种，聚类关系较为集中，但两
者都表现出 ITS1 序列的信息位点及平均遗传距离
要高于 ITS2 序列的特点。matK 与 rbcL 序列种间差
异则显著低于 ITS 区域序列。
种间遗传
种内遗传
种间遗传
种内遗传
100
80
60
40
20
0

100
80
60
40
20
0



遗
传
距
离
分
布
比
/
%






遗
传
距
离
分
布
比
/
%

A
B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A
B
遗传距离
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图 5 基于 ITS1 (A) 和 ITS2 (B) 序列构建的 NJ 树
Fig. 5 NJ tree based on ITS1 (A) and ITS2 (B) sequences
3.2 ITS1 与 ITS2 的鉴定效果对比
本实验中，单一片段的鉴定能力中以 ITS2 的鉴定
效率最高，为 100%；ITS1 序列在区分属内近缘物种
的能力较差，模糊鉴定率高达 27.8%。在早期的研究
中已发现，ITS2 序列在物种水平上的遗传稳定性高、
种间差异稳定、对近缘物种的区分度高，在物种鉴定
上的综合能力高于 ITS1 序列，在柑橘属[20]、木兰属[23]、
鸟足兰属[23]等均达到鉴定成功率在 90%以上；在蔷薇
科[24]、豆科[26]、菊科[27]等较为庞大的科系中，鉴定效
率有所下降，如菊科的鉴定效率仅为 76%。即使如此，
也远高于其他条形码候选序列的鉴定效果。
3.3 系统发育树的构建与物种聚类情况分析
结合不同贝母在地理分布、形态特征上的差异，
并通过系统发育树对贝母属不同物种的聚类能力进
行对比，认为 ITS2 构建的 NJ 树、ITS1 与 ITS2 组
合序列构建的 NJ 树对参与实验物种的聚类情况分
析准确度最高，能在一定程度上准确判断不同地理
位置、形态特征的贝母种的遗传距离，区分浙贝母
类群、川贝母类群、北方高纬度地区贝母类群 3 个
中国贝母主要类群。但是对于新疆地区贝母和东北
地区的贝母无明显区分能力。
本实验的聚类结果与 4 种浙贝母与其他品种贝
母的 RAPD 分析结果[28]相一致，伊贝母区别于南方
贝母类群，而南方贝母类群分成了川贝母系与浙贝
母系。
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川贝母类群
浙贝母类群
北方贝母类群
0.005
B

浙贝母类群
川贝母类群
北方贝母类群
0.005
A
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 11 期 2014 年 6 月

·1619·
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