全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 5 期 2016 年 3 月

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• 药材与资源 •
铁皮石斛 HDS 基因的克隆与初步表达分析
王 翔，吴林松，吴秋菊，林 毅，蔡永萍，樊洪泓*
安徽农业大学生命科学学院，安徽 合肥 230036
摘 要：目的 从铁皮石斛 Dendrobium officinale 中克隆 4-羟基 -3-甲基 -2-E-丁烯基 -1-焦磷酸合成酶（4-hydroxy-
3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate synthase，HDS）基因，在大肠杆菌中诱导融合蛋白，并探究该基因在铁皮石斛不同组织中
的表达规律。方法 采用 RT-PCR 和 RACE 等方法获取铁皮石斛 HDS（DoHDS）的 cDNA 全长，利用相关软件和在线网站
进行生物信息学分析，使用 Real-Time PCR 分析 DoHDS 在不同组织的表达特征，构建原核表达载体 pET-28a (+)-DoHDS，
转化大肠杆菌 BL21（DE3）进行诱导表达。结果 成功获得 DoHDS 的 cDNA 全长序列，GenBank 登录号为 KJ161312，全
长 2 666 bp，ORF 为 2 238 bp，编码 745 个氨基酸。DoHDS 在各组织中均有表达，在茎中表达量最高，为原球茎的 5 倍；
SDS-PAGE 结果显示诱导产物为 1 个相对分子质量（82 700）与理论值相符的融合蛋白。结论 克隆了 DoHDS 的 cDNA 全
长序列，探究其在不同组织中的表达模式，建立了原核表达体系，为后续研究 DoHDS 的功能提供了一定的理论基础。
关键词：铁皮石斛；4-羟基-3-甲基-2-E-丁烯基-1-焦磷酸合酶；基因克隆；表达分析
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)05 - 0803 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.05.020
Cloning and preliminary expression analysis on HDS gene in Dendrobium officinale
WANG Xiang, WU Lin-song, WU Qiu-ju, LIN Yi, CAI Yong-ping, FAN Hong-hong
School of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China
Abstract: Objective To clone the 4-hydroxy- 3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate synthase (HDS) gene from Dendrobium officinale,
induce fusion protein in Escherichia coli, and explore the regular pattern about HDS gene in different tissues of D. officinale.
Methods RT-PCR and RACE technologies were used to clone the full-length cDNA of DoHDS. Using relevant softwares and
online sites to analyze bioinformatics. Then the expression patterns of DoHDS were studied by real-time PCR. Constructing
prokaryotic expression vector pET-28a (+)-DoHDS to induce the expression protein in E. coli BL21 (DE3). Results The DoHDS
gene was successfully obtained (GenBank accession number KJ161312), the full-length cDNA was 2 666 bp and ORF was 2 238
bp, coding the protein containing 745 amino acids. Relative real-time PCR analysis indicated that DoHDS showed the higher
transcript abundance in the stems, 5 fold higher than protocorm-like bodies. The SDS-PAGE results showed that a relative molecular
weight of 82 700 recombinant protein was produced. Conclusion The cDNA encoding HDS from D. officinale is cloned. The
prokaryotic expression vector and different tissues expression patterns of DoHDS are constructed. It is helpful for the future research
on the mechanism of terpenoid biosynthesis in medicinal plants D. officinale.
Key words: Dendrobium officinale Kimura et Migo; 4-hydroxy- 3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate synthase; gene cloning; expression analysis

铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo，
又名黑节草，多年生草本植物，为兰科第 2 大属植
物。它是一种常用名贵中药[1]，至今已有 1 500 多年
药用历史。历代医著如《道藏》《神农本草经》《本
草纲目拾遗》等均有记载[2]。《中国药典》2010 年
版中记载铁皮石斛具有益胃生津、滋阴清热的疗效，
主要用于口干烦渴、胃阴不足、病后虚热不退、阴
虚火旺、骨蒸劳热等症[3]。现代医学研究表明，铁

收稿日期：2015-08-19
基金项目：安徽省教育厅自然科学重点项目（KJ2015A005）；江淮地区大学农业科技服务模式关键技术集成与示范（2013BAD20B09）
作者简介：王 翔（1990—），男，安徽宿松人，硕士在读，研究方向为药用植物分子生物学。E-mail: wangxiang0668@163.com
*通信作者 樊洪泓（1980—），女，博士，副教授，硕士研究生导师，研究方向为药用植物生物技术。Tel: (0551)65786216 E-mail: hhfan0551@126.com
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皮石斛具有抗衰老、抗肿瘤、降血糖和提高免疫
等作用[4]。十几年来，国内外学者对铁皮石斛化
学成分进行了大量研究，发现铁皮石斛化学成分
多样，包括生物碱、多糖、酚类、联苄、倍半萜
类和糖苷等，主要药用成分是多糖和生物碱[5-6]，
这些药用成分受到了人们极大的关注，具有很重
要的药用价值。有研究表明石斛中的生物碱大多
属于萜类吲哚生物碱[4,7]，此类生物碱起源于 2 条
途径，莽草酸途径（吲哚途径）和萜类途径（MVA、
MEP 途径）。
4-羟基 -3-甲基 -2-E-丁烯基 -1-焦磷酸合成酶
（4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate synthase，
HDS）参与 MEP 途径中的倒数第 2 个反应，催化
2-C-甲基赤藓醇-2,4-环焦磷酸生成 4-羟基-3-甲基-
2-E-丁烯基-4-磷酸，HDS 属于 gcpE 蛋白超家族，
是一种铁硫蛋白。目前 HDS 基因已从毛果杨[8]、黄花
蒿[9]、萝芙木[10]、银杏[11]、长春花[12]和拟南芥[13]等植
物中克隆出来，但在铁皮石斛中的克隆仍未见报道。
有研究表明，拟南芥 HDS 起到调控代谢流作用[13]和
转录后相关调控作用[12,14]。本实验以铁皮石斛为材
料，采用 RT-PCR 和 RACE 等方法克隆铁皮石斛 HDS
（DoHDS）cDNA 全长，并对其序列进行生物信息学
分析、原核表达分析和不同组织的 Real-Time PCR 分
析，为进一步研究 MEP 途径作用机制及 HDS 在萜类
化合物合成中的作用提供理论依据。
1 材料与试剂
1.1 材料
铁皮石斛组培苗取自安徽农业大学生命科学学
院，由安徽农业大学蔡永萍教授鉴定为铁皮石斛
Dendrobium officinale Kimura et Migo。
1.2 主要试剂
总 RNA 提取试剂盒 RNAprep Pure Plant Kit、
FastQuant RT Kit 购自北京 Tiangen 公司；RACE 试剂
盒、pMD18-T 载体试剂盒、SYBR® Premix Ex TaqTM II
均购自 TaKaRa 公司；EasyTaq Buffer、EasyTaq DNA
Polymerase、dNTPs 购自北京全式金公司。
2 方法
2.1 总 RNA 的提取与反转录
取新鲜的铁皮石斛组培苗 0.1 g，用灭菌水清
洗去除残留培养基，并用滤纸吸干，液氮中迅速
研磨成粉末，然后按照 RNAprep Pure Plant Kit
（Tiangen）说明书进行 RNA 提取。利用超微量分
光光度计检测 RNA 浓度和质量。并以此为模板按
照 FastQuant RT Kit 说明书进行 RNA 反转录成
cDNA。
2.2 引物设计
根据 GenBank 上已登录的 HDS 氨基酸序列，
如拟南芥、毛果杨、黄花蒿、萝芙木、银杏、长春
花等，利用 DNAMAN 软件比对氨基酸同源性，挑
选两段高度保守区段序列设计简并引物（表 1）。
表 1 引物名称及序列
Table 1 Names and seqences of primers
引物用途及预测大小 引物名称 引物序列 (5’-3’)
HDS-S GATGGYTCTGTWCYMATGTC 核心片段（约 850 bp）
HDS-R GGTCCATTBACAATRCADCCC
HDS-3-OUT GTTGGCAGGGTTCATTCTTC 3’RACE（约 700 bp）
HDS-3-IN GTGGATGGTTTTGGCGATGG
HDS-5-OUT CTGACAAGGGAACCAAAATG 5’RACE（约 1 600 bp）
HDS-5-IN CATCAGCATCATCGACAGGA
HDS-CDS-S GCCGGGATCCATGATGGTAGCTGGAACTATTTCAACC（下划线为 BamH I 酶
切位点）
cDNA全长（约2 600 bp）
HDS-CDS-R AATAGCGGCCGCCTACTCTTCTGCAGGCGGATCGACCCAA（下划线为 Not I
酶切位点）
HDS-RTS CGGGGACGAACGATATGAGG
HDS-RTR TGAACCCTGCCAACCTTCTC
β-actin-RTS GGTATTGTGTTGGATTCCG
qRT-PCR（约 200 bp）
β-actin-RTR TGAGTAGCCCCTCTCTGTGAG

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2.3 DoHDS 保守区片段的扩增
首先以反转录合成的 cDNA 为模板，利用引物
HDS-S 和 HDS-R 进行 PCR 扩增。PCR 反应体系：上
下游引物各 1.5 μL，模板 cDNA 2 μL，10×PCR Buffer
2.5 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，Taq 酶（5 U/μL）
0.25 μL，最后用 ddH2O 补充至总体积 25 μL；反应程
序：94 ℃预热 5 min，94 ℃变性 45 s，60 ℃退火 45 s，
72 ℃延伸 1 min，35 个循环，72 ℃再次延伸 10 min。
PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，根据 DNA
胶回收试剂盒（生工）说明书回收目的片段，然后连
接克隆载体 pMD18-T，转化大肠杆菌 DH5α感受态细
胞，经氨苄固体培养基过夜培养后，挑取单菌落经菌
液 PCR 鉴定后委托上海生工有限公司进行测序。
2.4 DoHDS 的 RACE 扩增及全长 cDNA 序列的
获得
参照 TaKaRa 3’-Full RACE Kit和 5’-Full RACE
Kit 说明书将铁皮石斛总 RNA 分别反转录成
cDNA；按照 TaKaRa 3’RACE 和 5’RACE 试剂盒说
明书，以及已得到的核心片段序列，使用 Primer
Premier 5.0 设计 3’RACE 和 5’RACE 反应所需的巢
式引物：HDS-3-OUT、HDS-3-IN、HDS-5-OUT、
HDS-5-IN（表 1）；分别对 DoHDS 的 3’端和 5’端进
行巢式 PCR 扩增，PCR 产物的回收、TA 克隆与测
序方法均同“2.3”项。将 DoHDS 的核心片段、3’
端和 5’端序列利用 DNAMAN 软件进行拼接，获得
该基因的全长 cDNA 序列。根据拼接得到的全长序
列 ， 分 别 在 5’ 端 和 3’ 端 设 计 特 异 性 引 物
HDS-CDS-S、HDS-CDS-R（表 1），进行 PCR 扩增
得到目的基因，PCR 产物的回收、TA 克隆与测序
方法均同上。
2.5 DoHDS 生物信息学分析
将获得的 DoHDS 编码的氨基酸序列在
GenBank 数据库中进行 Blast 比对分析，利用
DNAMAN软件对已发表的其他植物的HDS编码的
氨基酸序列进行同源性分析，并通过 MEGA6.0 软
件中的 Neighbor-Joining 法构建系统进化树。在线网
站分析，预测相对分子质量及等电点（http://web.
expasy.org/protparam/），进行疏水性分析（http://web.
expasy.org/protscale/），跨膜结构分析（http://www.
cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ ）， 预 测 信 号 肽
（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP），亚细胞定
位分析http://www.cbs.dtu.dk/services/（TargetP-1.1/ output.
php），蛋白质的二级结构分析（https://npsa-prabi. ibcp.
fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page＝npsa_sopma. html）。
2.6 DoHDS 的组织特异性表达分析
采用 RNAprep Pure Plant Kit 试剂盒分别提取
同一生长时期铁皮石斛原球茎、根、茎、叶的总
RNA，用超微量分光光度计检测 RNA 浓度和质
量。将上述总 RNA 按照 1 μg 的量用 PrimeScriptTM
RT reagent Kit（TaKaRa）反转录成 cDNA。以持
家 基 因 β-actin[15] （ 引 物 β-actin-RTS 和
β-actin-RTR，表 1）为内参；根据 DoHDS 的全长
cDNA 序列采用 Primer Premier 5.0 设计实时荧光
定量 PCR 引物：HDS-RTS 和 HDS-RTR（表 1）。
反应体系：10 μL SYBR® Premix Ex TaqTM II，2 μL
cDNA，0.8 μL HDS-RTS 和 HDS-RTR，0.4 μL
ROX，用 ddH2O 补至 20 μL；反应程序：95 ℃、
30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40 个循环。实验
进行 3 次重复；结果采用 2−ΔΔCt 法来计算 DoHDS
在不同组织的相对表达量。
2.7 DoHDS 的原核表达分析
2.7.1 原核表达载体的构建 根据目的基因
DoHDS 的核苷酸序列设计带有 BamH I 和 Not I 酶
切位点的引物 HDS-CDS-S 和 HDS-CDS-R（同全长
引物，表 1）来扩增 DoHDS 的 cDNA 全长。PCR
产物的胶回收、TA 克隆等方法均同“2.3”项。测
序验证正确后提取 pMD18-T-DoHDS 质粒，用
BamH I 和 Not I 酶将 HDS-pMD18-T 质粒和原核表
达载体 pET-28a (+) 质粒分别进行双酶切，胶回收
后用 T4 连接酶于室温过夜连接，转化大肠杆菌
DH5α过夜培养，挑取阳性单菌落进行菌液 PCR 鉴
定后，提取质粒后进行酶切验证，获得原核表达载
体 pET-28a (+)-DoHDS。
2.7.2 原核蛋白的诱导 将构建好的原核表达载体
pET-28a(+)-DoHDS 转化到表达菌株 BL21（DE3）中，
在含有 50 mg/L 卡那霉素的 LB 平板上过夜培养后，
挑取阳性单菌落到 5 mL含有 50 mg/L卡那霉素的LB
培养基中 37 ℃震荡培养，培养一段时间后菌液 A600
值达到 0.6～0.8，进行 PCR 鉴定，再加入 0.2 mmol/L
异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达，每隔 1
h 取 1 mL 菌液备用。空载质粒 pET-28a (+) 和不加
IPTG 诱导 DoHDS 蛋白表达的操作同上。将上述收集
的菌液 12 000×g 离心 5 min 后用 5×Loading Buffer
重悬菌体。然后 100 ℃煮沸 5 min，12 000×g 离心 2
min，收集上清液。取 10 μL 上清液进行 SDS-PAGE
电泳、染色、脱色。
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3 结果与分析
3.1 DoHDS 全长的克隆
以铁皮石斛 cDNA为模板，用简并引物HDS-S、
HDS-R（表 1）扩增得到 1 条约 850 bp 的 PCR 产物，
扩增产物符合引物设计的大小（图 1）。胶回收产物
经 TA 克隆和测序分析得到该基因中间片段，长度
为 821 bp，将该片段在 NCBI 的数据库中进行 Blast
比对分析，发现该序列与其他植物的 HDS 核酸序
列相似度较高，推测此序列为 DoHDS 基因的核心
片段。
根据已经获得的 DoHDS 核心序列设计 3’RACE
和 5’RACE 引物（表 1），进行巢式 PCR 扩增，获得
HDS 的 3’端 699 bp（图 1）和 5’端 1 572 bp（图 1），
用 DNAMAN 软件拼接 DoHDS cDNA 全长，并设计
全长引物（表 1），以铁皮石斛的 cDNA 为模板，进
行 PCR 扩增，经测序得到一段大小为 2 666 bp 的片
段（图 1）。将该片段再次在 NCBI 的数据库中进行
Blast 分析，进一步验证所得基因序列为 DoHDS 的
cDNA 完整序列。其中开放阅读框（ORF）长度为 2 238
bp，5-UTR 149 bp，3-UTR 279 bp，编码 745 个氨基
酸，命名为 DoHDS，并提交至 NCBI 数据库（GenBank
登录号 KJ161312）。


M-Marker 1-核心片段产物 2-3’RACE 产物 3-5’RACE 产物
4-全长 cDNA 扩增
M-Marker 1-core fragment product 2-3’RACE product
3-5’RACE product 4-full-length cDNA amplification
图 1 DoHDS 基因全长 cDNA 克隆
Fig. 1 Clone of full-length cDNA of DoHDS gene
3.2 DoHDS 生物信息学分析
利用在线网站（http://web.expasy.org/ protparam/）
预测 DoHDS 蛋白相对分子质量为 82 700，等电点
5.81，化学式 C3646H5843N1015O1104S3。利用 PBIL
LYON-GERLAND 信息库对 DoHDS 蛋白序列进行
二级结构预测，分析可知 DoHDS 蛋白由 α-螺旋、β-
转角、伸展链和无规则卷曲组成。其中 α-螺旋共 261
个，占总蛋白质的 35.03%；β-转角 81 个，占总蛋
白质的 10.87%；伸展链 172 个，占总蛋白质的
23.09%；无规卷曲 231 个，占总蛋白质的 31.01%
（图 2）。分析疏水性最小峰值为−3.056，在第 210
和 211 个氨基酸位置，疏水性最大峰值为 2.522，
在第 680 个氨基酸位置，分析可知 DoHDS 编码
的蛋白质为亲水性蛋白。TMHMM 跨膜结构分析
表明，DoHDS 蛋白无跨膜结构，分析得知 DoHDS
蛋白位于膜外。SignalP 4.1 Server 预测 DoHDS
蛋白无信号肽。亚细胞定位分析表明，DoHDS 蛋
白定位于叶绿体的机率为 0.147，线粒体为 0.026，
其他细胞器为 0.677。
通过 DNAMAN 软件对铁皮石斛 DoHDS 编码
的氨基酸序列在 NCBI 上与多种植物进行氨基酸序
列进行 Blast 比对（图 3），与拟南芥 Arabidopsis
thaliana (L.) Heynh、毛果杨 Populus trichocarpa
Torr. & Gray、丹参 Salvia miltiorrhiza Bge.、茶树
Camellia sinensis (L.) O. Ktze、萝芙木 Rauvolfia
verticillata (Lour.) Baill、银杏 Ginkgo biloba L. 和
长春花 Catharanthus roseus (L.) G. Don 等植物同源
性高达 89%。说明 HDS 在进化过程中较为保守。
与其他植物氨基酸序列比对后发现，均含有多个保
守半胱氨酸残基活性位点（图 3），这些活性位点可
能参与催化底物还原过程中铁硫键的形成[16-17]。利
用 MEGA 6.0 软件中的 Neighbor-Joining 方法，将
DoHDS 蛋白与 GenBank 登录的 11 种植物的 HDS
蛋白构建系统进化树，进行聚类分析。结果表明（图
4），DoHDS 蛋白与同为单子叶植物的海枣 Phoenix
dactylifera L. HDS 蛋白聚为一类。


图 2 DoHDS 蛋白的二级结构预测
Fig. 2 Predicted second arystrueture of DoHDS protein in D. officinale
-α-螺旋 -无规卷曲 -延伸链 -β-转角
-α- helix -Random cail -Extend strand - β-turn
M 1 M 2 M 3 M 4
1 000 bp
750 bp 1 000 bp
750 bp
2 000 bp
1 000 bp
3 000bp
2 000 bp
0 100 200 300 400 500 600 700
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▲-半胱氨酸残基保守位点
▲-The conserved cysteine residues
图 3 铁皮石斛与其他植物 HDS 氨基酸序列同源性比对
Fig. 3 Homologous comparison on HDS amino acid sequence in D. officinale and other plants
丹参
拟南芥
毛果杨
茶树
萝芙木
长春花
铁皮石斛
Consensus


丹参
拟南芥
毛果杨
茶树
萝芙木
长春花
铁皮石斛
Consensus

丹参
拟南芥
毛果杨
茶树
萝芙木
长春花
铁皮石斛
Consensus

丹参
拟南芥
毛果杨
茶树
萝芙木
长春花
铁皮石斛
Consensus

丹参
拟南芥
毛果杨
茶树
萝芙木
长春花
铁皮石斛
Consensus

丹参
拟南芥
毛果杨
茶树
萝芙木
长春花
铁皮石斛
Consensus

丹参
拟南芥
毛果杨
茶树
萝芙木
长春花
铁皮石斛
Consensus

丹参
拟南芥
毛果杨
茶树
萝芙木
长春花
铁皮石斛
Consensus

丹参
拟南芥
毛果杨
茶树
萝芙木
长春花
铁皮石斛
Consensus

丹参
拟南芥
毛果杨
茶树
萝芙木
长春花
铁皮石斛
Consensus
71
69
69
69
69
69
69
73
146
144
144
144
144
144
144
148
221
219
219
219
219
219
219
223
296
294
264
294
294
294
294
298
371
369
369
369
369
369
369
373
446
444
444
444
444
444
444
448
521
519
519
519
519
519
523
595
593
593
593
593
593
593
598
670
668
668
668
668
668
668
673
742
717
740
740
740
740
740
745
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图 4 铁皮石斛与其他植物 HDS 氨基酸的系统进化树
Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of HDS in D. officinale and
other plants
3.3 DoHDS 在铁皮石斛不同组织中的表达分析
以铁皮石斛的原球茎、根、茎、叶为研究材料，
选择持家基因 β-actin[15]为内参，利用实时荧光定量
PCR 仪检测不同组织中 DoHDS 的表达水平。结果
显示在铁皮石斛各组织中 DoHDS 都有表达，且表
达量依次为茎＞根≈叶＞原球茎（图 5）；其中在茎
中 DoHDS 表达量为原球茎的 5 倍。
3.4 DoHDS 的原核表达分析
3.4.1 DoHDS 的获得 使用含有 BamH I 和 Not I
酶切位点的引物扩增 DoHDS，经测序验证后，提取
pMD18-T-DoHDS 质粒，并使用 BamH I 和 Not I 同
时进行双酶切 pMD18-T-DoHDS 质粒和 pET28a (+)
质粒，琼脂糖凝胶电泳结果如图 6-A 所示，形成单
一的条带。结果表明酶切产物干净，没有拖带现象，
说明酶切彻底。
0
1
2
3
4
5
6
原球茎 根 茎 叶
器官
相
对
表
达
量

图 5 DoHDS 基因在铁皮石斛中的组织特异性表达分析
Fig. 5 Tissue-specific expression of DoHDS in D. officinale
3.4.2 pET-28a (+)-DoHDS 重组质粒的鉴定 将上
述的酶切产物胶回收后用 T4 连接酶连接，得到的
重组质粒转化大肠杆菌 DH5α，挑取阳性单菌落进
行菌液 PCR 验证，然后挑选其中一个菌落进行扩大
培养，提取质粒，进行酶切验证。由图 6-B 显示

M-Marker 1、2-PMD18-T-DoHDS 质粒酶切产物 3、4-pET-28a
(+) 质粒酶切产物 5-pET-28a (+)-DoHDS 质粒酶切产物
6-pET-28a (+) 质粒酶切产物
M-Marker 1, 2-PMD18-T-DoHDS plasmid by double enzymes
digestion 3, 4-result of pET28a (+) vector plasmid by double
enzymes digestion 5-pET-28a (+)-DoHDS plasmid by double
enzymes digestion 6-result of pET28a (+) vector plasmid by double
enzymes digestion
图 6 DoHDS 基因原核表达载体构建
Fig. 6 Construct DoHDS prokaryotic expression vector
pET-28a (+)-DoHDS 重组质粒经双酶切后出现 2 条
非常清晰的带，且一条与原片段大小一致，另一条
与 pET-28a (+)一致，说明 pET-28a (+)-DoHDS 重组
质粒已经初步构建成功。
3.4.3 DoHDS 蛋白的诱导表达与分析 重组质粒
pET-28a (+)-DoHDS 转化大肠杆菌菌株 BL21（DE3）
后进行诱导表达，以空载 pET-32a (+) 加 IPTG 与不
加 IPTG 为对照，pET-28a (+)-DoHDS 重组质粒在
IPTG 诱导 1、2、3、4 h 后，分离蛋白进行 SDS-PAGE
检测。结果如图 7 所示，在 80 000～120 000 有不同
于对照组的目的条带，显示诱导产物为一个相对分
子质量（82 700）与理论值相符的融合蛋白，说明
成功诱导表达了 DoHDS 蛋白，并发现不同时间的
诱导对其表达量的影响不明显。

M-Marker 1-pET-28a (+) 不加 IPTG 诱导 2-pET-28a (+) 加入
IPTG 诱导 3-pET-28a (+)-DoHDS 不加 IPTG 诱导 4～7-ET-28a
(+)-DoHDS 加入 IPTG 诱导 1、2、3、4 h
M-Marker 1-pET-28a (+) plasmid without IPTG 2-pET-28a (+)
plasmid with IPTG 3-pET-28a (+)-DoHDS plasmid without IPTG
4—7-SDS-PAGE of analysis for pET-28a (+)-DoHDS plasmid by
induced for 1, 2, 3, 4 h respectively
图 7 pET-28a (+)-DoHDS 在大肠杆菌 BL21 中的诱导表达
Fig. 7 Expression of pET-28a (+)-DoHDS in E. coli BL21
M 1 2 3 4 M 5 6
萝芙木 ADX06907.1

长春花 AAO24774.1

丹参 AEZ55668.1 铁皮石斛 AHN 91473.1

海枣 XP 008807336.1

粳稻 Q6K8J4.1

短花稻 XP 006647487.1 粟 XP 004953020.1

玉米 ACG47448.1

高粱 XP 002454137.1

短柄草 XP 003575307.1

节节麦 EMT15103.1
6
原球 根 茎
相
对
表
达
量

2 000 bp
3 000 bp
2 000 bp
A B
1 2 3 4 5 6 7 M
12 000
8 000
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 5 期 2016 年 3 月

• 809 •
4 讨论
铁皮石斛是我国兰科石斛属中珍稀濒危特有品
种，具有重要的药用价值，其中生物碱是其主要药
效成分之一。本研究从铁皮石斛中克隆出萜类化合
物生物合成 MEP 途径上倒数第 2 个酶基因-DoHDS。
HDS 被认为在 MEP 途径中起着关键的调节代谢流
的作用[13]；而且其表达量的变化影响到萜类代谢物
的产量。本研究表明，DoHDS cDNA 全长 2 666 bp，
编码了 745 个氨基酸；序列比对分析结果表明
DoHDS 与长春花、银杏和拟南芥等 HDS 具有很高
的同源性，保守结构域分析显示 DoHDS 蛋白为一
多结构域蛋白，属 gcpE 蛋白家族成员，结构域中
包括保守的半胱氨酸残基活性位点、底物结合位点
和催化位点[18]。
本研究表明，在铁皮石斛的不同组织中 DoHDS
均有表达，但存在一定的表达差异。DoHDS 在茎、
根与叶的表达量分别为对照（原球茎）的 5.1、1.69、
1.68 倍，在茎中表达量最高，而萝芙木[10]和茶树[18]
中，HDS 在叶片中的表达量均显著高于茎与根部。说
明了同一基因在不同植物中，基因表达量不同；在同
一植物不同组织中，基因表达量亦不相同。本实验构
建了 pET-28a (+)-DoHDS 重组质粒，在大肠杆菌BL21
成功诱导出 DoHDS 蛋白，其相对分子质量与预测一
致，但不同时间的诱导对其表达量的影响不大。
总之，研究 DoHDS 在不同器官中的表达特征
为探究 DoHDS 参与合成的萜类化合物代谢提供了
理论依据；研究 DoHDS 在大肠杆菌中的表达情况
为后续研究它的催化功能提供了一定的理论基础。
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