全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 20 期 2013 年 10 月

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• 药材与资源 •
宁夏枸杞查耳酮合成酶基因 cDNA 片段的克隆及生物信息学分析
尚 洁 1，陈阿丽 2，潘伟志 3
1. 北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏 银川 750021
2. 宁夏疾病预防控制中心，宁夏 银川 750004
3. 华中科技大学生命科学与技术学院，湖北 武汉 430074
摘 要：目的 克隆宁夏枸杞类黄酮/异黄酮生物合成途径中的关键酶查耳酮合成酶（CHS，EC2.3.1.74）。方法 以宁夏枸
杞为材料，利用同源克隆和 RT-PCR 技术得到 1 条 CHS 基因，并对其进行生物信息学分析。结果 该家族的 cDNA 片段长
为 1 148 bp，编码 382 个氨基酸，蛋白相对分子质量为 4.168×104，等电点为 6.22。氨基酸序列和结构分析显示 CHS 基因家
族有一个活性位点，即查耳酮和二苯乙烯合成酶活性位点。宁夏枸杞 CHS（LyCHS）蛋白很可能定位在细胞质。对二级结
构和三级结构进行预测，发现 LyCHS 蛋白中无规则卷曲 126 个，α 螺旋和 β 折叠分别为 166 和 25 个，延伸链 65 个。系统
进化分析表明，LyCHS 基因与马铃薯野生种、马铃薯、番茄具有很高的同源性。该基因已在 GenBank 上注册，基因序列
登录号为 JQ964237。结论 首次克隆了 LyCHS 基因片段，为研究其表达特性以及功能提供了基础。
关键词：枸杞；CHS 基因；克隆；生物信息学分析；LyCHS 蛋白
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)20 - 2898 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.20.020
Cloning and bioinformation analysis of chalcone synthase gene from Lycium
barbarum in Ningxia
SHANG Jie1, CHEN A-li2, PAN Wei-zhi3
1. College of Biological Science and Engineering, Beifang University of Nationalities, Yinchuan 750021, China
2. Ningxia Centers for Diseases Prevention Control, Yinchuan 750004, China
3. College of Life Science & Technology, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430074, China
Abstract: Objective To obtain cDNA of chalcone synthase (CHS, EC 2.3.1.74) involved in the flavonoid/isoflavonoid biosynthesis
pathway. Methods The partial sequence of CHS in Lycium barbarum (LyCHS) was successfully cloned by RT-PCR and using a
sequence homology strategy, and the bioinformation analysis was carried out. Results The cDNA fragment of CHS gene was 1 148
bp in length, which encoded a protein of 382 amino acids with the predicted relative molecular weight of 4.168 × 104. The estimated
isoelectric point (pI) of the putative protein is 6.22. According to the amino acid sequence and structural analysis, it showed that this
protein contained one conserved active site, namely chalcone and stilbene synthases active site. Subcellular localizations of LyCHS
proteins were likely in the cytoplasm. The secondary and tertiary structures of LyCHS were abundant in α-helixs (166) and random
coils (126), while were less in β-turns (25) and extended strains (65). Phylogenetic analysis showed that the genes of LyCHS were
closely related to CHS in Solanum pinnatisectum, S. tuberosum, and Lycopersicon esculentum. The sequences had been registered in
GenBank with the accession numbers JQ964237. Conclusion The present results provide the foundation for the next study of CHS
gene about its expression and function in L. barbarum.
Key words: Lycium barbarum L.; CHS gene; cloning; bioinformation analysis; LyCHS protein

宁夏枸杞 Lycium barbarum L. 是一种多年生灌
木，主要生长在中国大多数地区、欧洲各国和地中
海地区。在中国，宁夏枸杞是一味传统常用中药和
滋补品。研究表明，类黄酮是枸杞叶片中一种重要
的活性成分[1-3]，其与人类的健康有着密切的关系，
具有消除氧自由基、抗炎、抗过敏、抗癌、抗菌、
保护心脑血管系统等多种药理作用[4-11]。
查耳酮合成酶（CHS，EC2.3.1.74）催化苯丙烷

收稿日期：2013-04-28
基金项目：北方民族大学校级科研项目（2010Y046）
作者简介：尚 洁（1979—），女，硕士，讲师，研究方向为植物分子生物学。 Tel: (0951)2067893 E-mail: shangjie@126.com
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代谢途径中类黄酮合成支路的初始反应，是关键酶和
限速酶，类黄酮是高等植物重要的次生代谢物，在花
色形成、抗紫外线照射、生殖性能、抗真菌侵染、固
氮细菌的募集等过程中发挥不同的功能[12]。在类黄酮
代谢途径中，CHS 被认为是最重要的酶[13]。CHS 催
化 1 分子 4-对香豆酰-CoA 和 3 分子丙二酰-CoA 形成
4 分子二氧化碳、3 分子辅酶 A 和 1 分子柚皮素查耳
酮。CHS 是一种同型二聚体蛋白质，每个单体相对分
子质量 4.2×104～4.5×104 [14]。CHS 主要定位于细胞
质[15]，与内质网膜相连。而另一项研究显示，CHS
和查耳酮异构酶（CHI）共同定位于细胞核[16]。
目前已经对多种植物蝴蝶兰 Phalaenopsis
hybrid cv. Formosa rose[17] 、马铃薯 Solanum
tuberosum L.[18]、核桃 Juglans regia L.[19]、羽扇
豆 Lupinus luteus L.[20]、银杏 Ginkgo biloba L.[21]、
苔 藓 Physcomitrella patens (Hedw.) Bruch et
Schimp.[22]等 CHS 基因进行了 cDNA 克隆和序列
分析、表达。大多数 CHS 属于多基因家族，但是
不同物种的 CHS 拷贝数差异较大，在拟南芥中只
有 1 个[23]。CHS 的编码区十分保守，约为 1.2×
103 个碱基，编码近 400 个氨基酸。苜蓿等[24]植
物的 CHS 蛋白晶体结构已经解析，蛋白的保守
域和活性氨基酸位点的研究已较为深入。然而关
于宁夏枸杞 CHS 基因尚未报道。本研究对 CHS
基因进行克隆、序列分析，以期利用基因工程技
术提高宁夏枸杞对不良环境的抵御能力以及为
调控宁夏枸杞类黄酮的积累奠定基础。
1 材料与仪器
1.1 材料
供试材料为宁夏枸杞 Lycium barbarum L.，于
2011 年采自宁夏回族自治区中宁县，后种植于北方
民族大学生物化学实验室，采集新鲜幼苗，立即冰
冻于液氮中，置于−80 ℃超低温冰柜中，待用。
1.2 主要试剂与菌种
DNA Polymerase、RNAiso for Polysaccharide-
rich Plant Tissue、RevertAid First Strand cDNA
Synthesis Kit 反转录试剂盒、DL2000 DNA marker
购自 TakaRa 公司；DNA 胶回收试剂盒购自上海生
工生物公司；质粒 DNA 小量试剂盒购自 Axygen 公
司；pEASYTM-Blunt Zero Cloning Kit 、Trans1-T1
感受态细胞购自 Transgen 公司；一些常规试剂均为
国产分析纯；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合
成；测序由华中科技大学完成。
2 方法
2.1 总 RNA 的提取与 cDNA 链的合成
利用 TakaRa 公司的 RNAiso for Polysaccharide-
rich Plant Tissue 试剂提取总 RNA，操作步骤参考说
明书。按照反转录试剂盒 PrimeScript RT reagent Kit
（TaKaRa）说明书合成第一条链 cDNA。
2.2 简并引物设计
CHS 的简并引物是根据 GenBank 上收录的茄
科植物 Solanum lycopersicum L.、Petunia x hybrid
Vilm.、Solanum tuberosum L.、Nicotiana tabacum
L. 、 Nicotiana alata Link et Otto 、 Nicotiana
tomentosiformis L.、Solanum pinnatisectum Dunal、
Nicotiana benthamiana Domin 的氨基酸序列，使
用 clustalw2 进行序列比对，根据比对结果为上下
游引物确定两个合适的保守区域，应用 Primer
Premier 5.0 设计简并引物，结合密码子的偏向性，
对简并引物进行修饰。
PCR 反应条件：94 ℃预变性 180 s；94 ℃变
性 30 s，47.5 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 80 s；共计
35 循环；72 ℃后延伸 7 min。
2.3 宁夏枸杞CHS基因序列的生物信息学分析
通过Proteomics Server（http://web.expasy.org/
protparam/）预测氨基酸序列的相对分子质量、等电点、
稳定性指数等；利用Protscale（http://web.expasy.org/
p r o t s c a l e /）进行疏水性分析；利用T M H M M
（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）进行跨膜结
构域分析；利用Eslpred[25]（http://www.imtech.res.
in/raghava/eslpred/ ） 预 测 亚 细 胞 定 位 ； 利 用
Signalp4.1[26](http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）
预 测 蛋 白 质 的 信 号 序 列 ； 利 用 FoldIndex[27]
（http://bioportal.weizmann.ac.il/fldbin/findex）分析氨基
酸 序 列 的 无 序 化 特 性 。 用 SUMOsp 2.0[28]
（http://sumosp.biocuckoo.org/down.php）进行泛素化预
测；用 MotifScan（http://myhits.isb-sib.ch/cgibin/
motif_scan）和 InterPro[29]（http://www.ebi.ac.uk/int
erpro/）预测编码蛋白序列上潜在的结构域和功能位
点；用 NetPhos[30]（http://www.cbs.dtu.dk/services/
NetPhos/）预测蛋白磷酸化位点；使用 SOPMA[31]
（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=
npsa_sopma.html）对蛋白质二级结构进行预测；用
SWISS-MODEL[32-34]（http://swissmodel. expasy.org/）
预测蛋白三级结构；利用 MEGA 5.10 软件，采用
Neighbour-joining（NJ）法构建系统发育树。
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3 结果与分析
3.1 宁夏枸杞 CHS 基因大片段克隆
根据亲缘关系较近的几种茄科植物的CHS序列比
对，并使用 Primer Premier 5.0 软件设计得到一对简并
引物，每个引物的简并度都比较小，CHS-F 的简并度
仅为 12，CHS-R 为 4，见表 1。应用宁夏枸杞总RNA
反转录获得的 cDNA 为模板，采用以上引物进行简并
PCR，PCR 产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，
见图 1。PCR 扩增出一条大小约为 1 200 bp 特异的
条带，没有出现非特异性条带，表明此引物扩增特
异性强。目标条带经回收、克隆、测序后获得 1 条
长 1 148 bp 的 DNA 序列。编码 382 个氨基酸，相
对分子质量约为 4.168×104，命名为 LyCHS，提交
至 GenBank，基因序列登录号为 JQ964237。
表 1 CHS 基因克隆引物
Table 1 Primers for CHS gene cloning
引物名称 引物序列 (5’-3’) 简并度
CHS-F CGA AAATGGTSACMGTBGAGG 12
CHS-R ACAACAGTCTCAACWGTWAGCCC 4


M-Marker 1-RT-PCR 产物
M-Marker 1-RT-PCR product
图 1 RT-PCR 产物的电泳结果
Fig. 1 Electrophoresis of RT-PCR product
3.2 LyCHS 蛋白的理化性质
通过 ExPASy Proteomics Server 预测氨基酸序列
的相对分子质量、等电点、稳定性指数、脂溶性指数、
两亲性指数。LyCHS 蛋白质片段共 382 个氨基酸，碱
性氨基酸残基（Arg＋Lys）总数为 43，酸性氨基酸残
基（Asp＋Glu）总数为 46，相对分子质量为 41.68，
理论等电点为6.22。在溶液中，不稳定性指数为38.91，
脂溶性指数为 90.89，总平均亲水性指数为−0.082。
3.3 亲疏水性、亚细胞定位预测
利用位于 Expasy 的 Protscale 进行疏水性分析，
Window size 设置为 9。从图 2 得知 LyCHS 在第 342
位氨基酸处有最大值 2.422，大约在 340～350 位氨基
酸之间含有 1 个高疏水性区域；而在第 119 位氨基酸
处有最小值−2.489，大约在 40～60 位和 100～130 位
氨基酸之间有 2 个高亲水性区域。
利用 TMHMM 进行分析，宁夏枸杞 CHS 蛋白
都没有跨膜结构域，该蛋白位于细胞膜外。Eslpred

图 2 蛋白疏水区分析
Fig. 2 ProtScale output of hydrophobic area
预测宁夏枸杞 CHS 蛋白定位于细胞质的可能性最
大为 53%。另外，经 Signalp 4.1 预测 LyCHS 蛋白
质序列中无明显的信号序列。
3.4 蛋白质无序化特性分析
利用FoldIndex分析来源于宁夏枸杞LyCHS基因
氨基酸序列的无序化特性，结果表明蛋白含有无序区
2 处 MVTVEEYRKAQRAEGPATVMAIGTATPSNC-
VDQ（1～33）、FRITDSEHKTELKEKFKRMCDKS-
MIKKRYMHLT（41～73），无序残基最长 33 个氨基
酸残基，无序残基总共 66 个氨基酸残基，见图 3。
3.5 CHS 的结构域和功能位点预测
用 MotifScan 和 InterPro（图 4）预测 CHS 编码
蛋白序列上潜在的结构域和功能位点。结果表明，
该蛋白可能存在的翻译后修饰位点包括 1个N-糖基
化位点、7 个 N-豆蔻酰化位点、3 个蛋白激酶 C 磷
酸化位点、1 个 CAMP 磷酸化位点、8 个酪蛋白激
酶 II 位点。在 310～331 处可能存在 1 个亮氨酸拉
链。在 156～172 处有一段高度保守的结构功能域

M 1
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
1 148 bp

0 50 100 150 200 250 300 350
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
−0.5
−1.0
−1.5
−2.0
−2.5
得
分

位置
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图 3 无序化特性分析
Fig. 3 Disordered segment prediction
（RLMMYQQGCFA GGTVLR），这是查耳酮/二苯乙
烯合成酶的特征序列，符合 R-[LIVMFYS]-x-
[LIVM]-x-[QHG]-x-G-C-[FYNA]-[GAPV]-G-[GAC]-
[STAVK]-x-[LIVMF]-[RAL]查耳酮/二苯乙烯合成
酶标签序列。在第 1～382 位含有典型的 PKSIII 型
聚酮合酶、类硫解酶结构域。在 2～228 和 238～382
处分别是查耳酮和二苯乙烯合成酶N端和C端结构
域。除此之外，预测结果还发现蛋白质序列中有很
多与 ACP 合成酶 III 相似的结构域，这是因为 CHS
与脂肪酸合成酶基因具有很高的同源性，二者可能
是由同一个祖先基因进化而来[35]。


图 4 LyCHS 含有的结构域
Fig. 4 Domains of LyCHS
用磷酸化位点预测程序 NetPhos 2.0，发现 LyCHS
有 10 个潜在的 Ser 磷酸化位点、7 个 Thr 磷酸化位
点、2 个 Tyr 磷酸化位点。使用 SUMO sp 2.0 软件
对 LyCHS 蛋白序列进行泛素化修饰分析，在蛋白
序列中可能有两个泛素化位点 K49（SEHKTEL，
TypeII：Non-consensus）和 K320（LALKPEK，TypeI：
Ψ-K-X-E）。
3.6 LyCHS 片段的二级结构、三级结构预测
经SOPMA对LyCHS蛋白片段二级结构进行预
测，发现蛋白中以 α 螺旋和无规则卷曲为主，β 折
叠和延伸链较少。α 螺旋共 166 个，占总二级结构
的 43.46%；延伸链共 65 个，占总二级结构的
17.02%；β折叠共 25 个，占总二级结构的 6.54%；
无规则卷曲 126 个，占总二级结构的 32.98%。
利用 SWISS-MODEL Workspace 在线分析工具
对 LyCHS 蛋白三级结构进行预测。三级结构预测
采用同源建模方法，搜索蛋白质结构数据库（PDB）
得到同源序列 1bi5A（0.156 nm）作为宁夏枸杞
LyCHS 蛋白三级结构预测模板，依据模板调整待预
测蛋白序列主链原子位置生成预测蛋白三级结构模
型（图 5），最后依据能量最小化原理使侧链基团处
于能量最小的位置。预测信息显示，预测模型与同
源模板序列同源性为 84.03%。由于 CHS 是一种同
型二聚体蛋白质，因此预测结果是其亚基结构。
3.7 LyCHS 编码基因的系统进化分析
在 NCBI 上共选取茄科的 14 个物种 CHS 基因

1.0
0.5
0
−0.5
−1.0
0 50 100 150 200 250 300 350 380
倍
指
数

折叠
未折叠
氨基酸残基数
Chal_sti_synt_N
Type III polyketide synthase
Chal_sti_synt_C
no description
Thiolase-like
CHALCONE_SYNTH
FAMILY NOT NAMED
seg
InterPro 匹配 查询序列 描述
1 382
IPR001099
IPR011141
PF00195
PIRSF000451
IPR012328
PF02797
IPR016038
G3DSA:3.40.47.10
IPR016039
SSF53901
IPR018088
PS00441
nolPR
PTHR31565
seg
查耳酮/茋合酶, N 端
聚酮合酶, III 型
查耳酮/茋合酶, C 端
类硫解酶, 亚型
类硫解酶
查耳酮/茋合酶,活性位点
未整合
PRODOM PRINTS PIR PFAM SMART TIGRFAMs PROFILE
HAMAP PROSITE SUPERFAMILY SIGNALP TMHMM PANTHER GENE3D
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序列，以银杏 Ginkgo biloba CHS 基因作为外群
（outgroup），利用 MEGA 5.10 软件，采用 NJ 法构
建系统发育树，结果见图 6。结果显示 LyCHS 基因
在进化上与马铃薯野生种 Solanum pinnatisectum
Dunal 的 CHS、马铃薯 S. tuberosum 的 CHS 1a 和
1b、番茄 Lycopersicon esculentum 中的 CHS1 亲缘
关系较近。


图 5 预测的宁夏枸杞 LyCHS 蛋白三级结构
Fig. 5 Predicted tertiary structure of LyCHS
protein in L. barbarum

图 6 不同种植物 CHS 基因的系统进化树
Fig. 6 Phylogenetic tree of CHS genes from different plant species
4 讨论
查耳酮合成酶是类黄酮生物合成的关键酶和限
速酶，是一种同型二聚体蛋白质。它通过逐步缩合
3 分子丙二酰 CoA 和 1 分子的 4-对香豆酰-CoA 形
成类黄酮的骨架柚皮素查耳酮。柚皮素查耳酮进一
步派生出各种类黄酮物质[36]。类黄酮在植物花色、
生殖性能、防御反应中都起到重要作用。
本研究利用 RT-PCR 技术，首次从宁夏枸杞中
克隆到 CHS 基因家族 cDNA 片段，命名 LyCHS。
该序列长 1 148 bp，编码 382 个氨基酸，已在
GenBank 上注册，基因序列登录号为 JQ964237。该
基因编码的氨基酸序列分析显示，在 156～172 处有
一段高度保守的结构功能域（RLMMYQQGCFAG-
GTVLR），这是查耳酮/二苯乙烯合成酶的特征序
列。二级结构预测中发现，宁夏枸杞的 CHS 蛋白中
含有大量的 α 螺旋和无规则卷曲，β 折叠和延伸链
较少，无明显跨膜结构，蛋白含有无序化区域，很
可能定位在细胞质。在系统发生树中发现，宁夏枸
杞的 CHS 基因与马铃薯野生种、马铃薯、番茄的部
分 CHS 基因亲缘关系较近。CHS 基因的克隆及序
列分析将有助于深入了解 CHS 在宁夏枸杞类黄酮
生物合成代谢中的作用，更好调控类黄酮在枸杞中
的表达，包括表达的时间及部位。
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烟草
茸毛烟草
花烟草
本塞姆氏烟草
鸳鸯茉莉
矮牵牛
宁夏枸杞
马铃薯野生种
番茄 1
马铃薯栽培种 1b
马铃薯栽培种 1a
高杯花
马铃薯栽培种 2
番茄 2
银杏
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