全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 4 期 2012 年 4 月

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铁皮石斛磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及表达分析
曾淑华 1，文国松 1*，徐绍忠 1，查应红 2，杨生超 1，段承俐 1, 3
1. 云南农业大学中药材研究所/云南省中药材规范化种植技术指导中心，云南 昆明 650201
2. 云南红河群鑫石斛种植有限公司，云南 屏边 661200
3. 浙江农林大学林业与生物技术学院，浙江 临安 311300
摘 要：目的 克隆铁皮石斛 Dendrobium officinale 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（pepc）基因，并对其在 F 型和 H 型铁皮石
斛中的表达进行分析，为研究铁皮石斛 pepc 基因的结构、功能提供依据。方法 基于 GenBank 上已知的 pepc 基因的同
源序列设计引物，应用 RT-PCR 和 RACE 等方法，克隆铁皮石斛 pepc 基因全长。采用荧光定量 PCR 方法研究 pepc 基因
在 2 种铁皮石斛中的表达。结果 成功克隆了铁皮石斛 pepc 基因，登录号为 JF423930，该基因全长为 3 560 bp，其中 cds
序列为 2 895 bp，与兰科植物的同源性为 80%左右，与其他科属植物的同源性达到 70%以上，编码 964 个氨基酸。pepc
基因在 F 型铁皮石斛中的表达量为 H 型的 5.55 倍。结论 成功克隆了铁皮石斛 pepc 基因，且 F 型铁皮石斛 pepc 基因的
表达量高于 H 型。
关键词：铁皮石斛；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；基因克隆；同源性分析；RT-PCR
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)04 - 0766 - 06
Cloning and expression analysis on phosphoenolpyruvate carboxylase gene
in Dendrobium officinale
ZENG Shu-hua1, WEN Guo-song1, XU Shao-zhong1, ZHA Ying-hong2, YANG Sheng-chao1, DUAN Cheng-li1, 3
1. Institue of Chinese Medical Materials, Yunnan Agricultural University / Yunnan Provincial Good Agricultural Practice Center
of Chinese Medical Materials, Kunming 650201, China
2. Yunnan honghe Dendrobium planting Co., Ltd., Pingbian 661200, China
3. Faculty of Forestry and Biotechnology, Zhejiang Agriculture and Forestry University, Lin’an 311300, China
Abstract: Objective To study the structure and function of phosphoenolpyruvate carboxylase (pepc) gene in Dendrobium officinale,
pepc was cloned and gene sequence was analyzed. Expression of pepc gene in H and F type of D. officinale was analyzed. Methods
Primers were designed by analyzing the homologous sequence of pepc gene in GenBank, and complete pepc sequence in D. officinale
was cloned by RT-PCR and RACE. Expression of pepc gene was detected by fluorescent quantitative PCR in two kinds of D. officinale.
Results The complete sequence (3 560 bp) of pepc gene in D. officinale was cloned (Genebank accession number: JF423930),
including 2 895 bp cds sequence, and shared 80% identity with orchid plants and 70% identity with other plants. The pepc cDNA
encoded a precursor protein of 964 amino acids. Expression of pepc gene of F type D. officinale was 5.55 times as that of H type.
Conclusion The complete sequence of pepc gene in D. officinale is cloned, and expression of pepc in F type D. officinale is higher
than H type.
Key words: Dendrobium officinale Kimura et Migo; phosphoenolpyruvate carboxylase (pepc); gene cloning; homologous analysis; RT-PCR

铁皮石斛 Dendrobium officinale Kimura et Migo
为兰科（Orchidaceae）石斛属 Dendrobium Sw.多年
生草本植物，主要分布于云南、四川、贵州、西藏、
广西、安徽、浙江、福建等地[1-2]。铁皮石斛含石斛
多糖、石斛碱、双苄酚类、菲酚类等多种药效成分，
现代医学研究显示，铁皮石斛具有抗肿瘤、抗衰老、
增强机体免疫力等功效[3-7]。铁皮石斛分为 H 型和 F
型 2 种，其中 F 型铁皮石斛含丰富的黏性多糖成分，

收稿日期：2011-10-23
基金项目：云南省重大产业项目（云发改高技[2007]1718 号）；云南省科技计划项目重点产业创新工程（2008IF027）；国家科技支撑计划项目
（2011BAI13B02-5）
作者简介：曾淑华（1977—），女，土家族，湖北利川人，讲师，博士，从事药用植物研究。E-mail: zshgsp@163.com
*通讯作者 文国松 E-mail: wengs@163.com
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适合加工枫斗，H 型铁皮石斛只含有少量多糖成分，
不适合加工枫斗 [1]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
（phosphoenolpyruvate carboxylase，pepc）是 C4 植
物（在光合作用中固定 CO2 的最初产物为含 4 个碳
的二羧酸，故称为 C4-二羧酸途径，简称 C4 途径，
这些植物被称为 C4 植物）和兼性景天酸代谢途径
（CAM）植物光合碳代谢的源头关键酶，在 C4 和
CAM 植物的光合作用中催化大气 CO2 固定的第一
步反应[8]。1984年，首次从已克隆到的大肠杆菌 pepc
基因推测出 PEP 羧化酶基因的一级结构[9]。目前约
有 60 种植物和细菌 PEP 羧化酶基因的全长序列被
推测出来[10]。铁皮石斛为 CAM 植物，随着环境条
件的变化，其光合作用在 CAM 与 C3 途径间变化，
特别是晴天 CAM 途径更加明显[11]。通过登录 NCBI
检索，发现还没有石斛 pepc 基因的全序列，本实验
克隆铁皮石斛的 pepc 基因并对其在 F 型和 H 型铁
皮石斛中的表达进行分析，为进一步了解铁皮石斛
pepc 基因的结构、功能及其定位奠定基础，同时为
探索铁皮石斛多糖代谢途径提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
铁皮石斛 Dendrobium officinale Kimura et Migo
种植于红河州群鑫石斛种植有限公司铁皮石斛种植
园，样本经云南农业大学植物和中药材系郭凤根教
授鉴定。pepc 基因克隆的铁皮石斛叶片为 F 型铁皮
石斛 1 年生幼嫩叶片，pepc 基因表达分析的 F 型和
H 型铁皮石斛叶片于 8 月采摘，均为 2 年生，且采
相同叶位的叶片，保存于−80 ℃冰箱，用于 RNA
提取。
1.2 方法
1.2.1 RNA 提取 采用百泰克通用植物 RNA 提取
试剂盒提取铁皮石斛的 RNA，并用 Fermentas 公司
的 DNA 消化试剂盒消化 DNA，用 Fermentas 公司
的反转录试剂盒对 RNA 进行反转录。
1.2.2 pepc 基因部分片段的克隆 根据 GenBank
pepc 基因的保守区域，利用 Primer 5 软件设计一对特
异性扩增引物，F1：TGGGCGAGGTGGAACTGT，
R1：GATGCCTGTGCTGCCTTT，以铁皮石斛的
cDNA 为模板进行 PCR 扩增，PCR 反应条件如下：
94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，54 ℃、45 s，72 ℃、1 min，
35 个循环；72 ℃，10 min。获得一条 DNA 片段，将
片段克隆到 PMD19-T 上，选取 2 个克隆测序。
1.2.3 pepc 基因的 3’端和 5’端扩增 根据 3’RACE
试剂盒（购自大连宝生物公司）要求及已知的 pepc
部分序列，设计两条特异性引物（F2：GCCTTCC-
AACCTTCGCCACAGT；F3：CGGCATTTAAACAC
GTCATCGAA）。根据试剂盒原理，进行巢式 PCR
反应，以引物 F2 及试剂盒中的 outer primer 进行第
1 轮 PCR，反应程序如下：94 ℃、5 min，94 ℃、
30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、2 min，30 个循环；72 ℃，
10 min。取第 1 次 PCR 产物 1 μL 为第 2 轮 PCR 反
应的模板，以 F3 及 inner primer 为引物，反应程序
如下：94 ℃、5 min； 94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，
72 ℃、2 min，30 个循环；72 ℃，10 min。获得一
条目的 DNA 片段，进行克隆，测序。
根据莫氏兰的 pepc 基因序列，采用 Primer 5 软
件设计特异引物（R2：CGGCATTTAAACACGTCAT-
CGAA；R3：ATGTTCAAGAGTAGCAGCAGTA），
并根据已获得的 pepc 基因序列设计一条正向引物
（F4：TTGTCTCAGCCACCAGATACCAT），以 cDNA
为模板进行巢式 PCR 反应，反应程序如下：94 ℃、
5 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、2 min，
30 个循环；72 ℃，10 min。获得一条目的 DNA
片段，进行克隆，测序。
根据 5’RACE 试剂盒（购自大连宝生物公司）
要求及已知部分序列设计引物，R4：ATTGCCATC-
ACGATCACCACCCA；R5：TGTATCAACCCGCC-
GCAGGAACT。根据试剂盒原理，进行巢式 PCR
反应，以引物 R4 及试剂盒中的 outer primer 进行第
1 轮 PCR，反应程序如下：94 ℃、5 min，94 ℃、
30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、2 min，30 个循环；72 ℃，
10 min。取第 1 次 PCR 产物 1 μL 为第 2 轮 PCR 反
应的模板，以 R5 及 inner primer 为引物，反应程序
如下：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72
℃、2 min，30 个循环；72 ℃，10 min。获得一条
目的 DNA 片段，进行克隆，测序。
1.2.4 pepc 在 H 型和 F 型铁皮石斛叶片中的表达分
析 根据金钗石斛 GAPDH 基因的部分序列
（GQ250049.1），利用 Primer 5 软件设计特异引物
（F6：TCTTGAATTCCTCACCGCAG，R6：ATTAAC-
AGACCAGTGATTGCG），以铁皮石斛的 cDNA 为模
板进行 PCR 扩增，PCR 反应条件如下：94 ℃、5 min，
94 ℃、30 s，52 ℃、45 s，72 ℃、1 min，35 个循环；
72 ℃，10 min。获得一条 DNA 片段，将片段克隆到
PMD19-T 上，选取 2 个克隆测序。
根据铁皮石斛 pepc 和 GAPDH 基因的已知序
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列，采用 Primer 5 软件设计用于荧光定量的特异引
物，pepc 基因的引物序列为 QF1：CCGGCCATCA-
AAGAGGAAA，QR1：TTAAATGCCGCACCAAAT-
CC；GAPDH 基因的引物序列为 QF2：TTGGA-
GGGACACAGATTGCT，QR2：CACCGCCCTGT-
TATTACATG。以铁皮石斛的 cDNA 为模板进行普
通 PCR 扩增，PCR 反应条件如下：94 ℃、5 min，
94 ℃、30 s，55 ℃、45 s，72 ℃、1 min，35 个循
环；72 ℃，10 min，检测所设计引物的特异性。
采用荧光染料法进行荧光定量反应，荧光染料
（SYBR Premix Ex TaqTM II）购于宝生物工程（大
连）有限公司，反应在 BIO-RAD 荧光定量 PCR 仪
上进行。空白对照采用 ddH2O 代替 cDNA，其他试
剂不变，PCR 反应程序为 95 ℃、3 min，循环 1 次，
预变性；PCR 扩谱，40 次循环，95 ℃、40 s，55 ℃、
40 s，72 ℃、40 s，77 ℃、10 s，95 ℃、l min，
循环 1 次；55 ℃，1 min，循环 1 次；55 ℃，10 s，
循环 80 次。反应体系见表 1。
表 1 荧光定量 PCR 反应体系
Table 1 Reaction system of fluorescent quantitative PCR
试 剂 用量 / μL
cDNA 模板 2
SYBR® Premix Ex TaqTM II (2×) 12.5
PCR Forward Primer (10 μmol/L) 1
PCR ReversePrimer (10 μmol/L) 1
ROX Reference Dye II (50×)×3 0.5
ddH2O 8
总体积 25

2 结果与分析
2.1 pepc 基因全序列的克隆
2.1.1 铁皮石斛总 RNA 提取 采用北京百泰克
通用植物RNA提取方法提取铁皮石斛RNA，1.0%
琼脂糖凝胶电泳，Image Quant 凝胶成像系统成
像，由图 1 可知，提取的铁皮石斛 RNA 完整性较
好，28S 和 18S 两条带清晰，没有发生降解，用分
光光度计测得 A280 和 A260，计算其比值在 1.8～2.0，
可以用于后续研究。
2.1.2 pepc 基因部分序列克隆 获得的铁皮石斛
cDNA 第一链用引物 F1/R1 进行 PCR 扩增，获得的
片段大小为 600 bp（图 2），与引物设计时目的片段
大小吻合。所得序列进行 NCBI BLASTn 分析发现，
该序列与杓唇石斛 D. moschatum Sw.、流苏石斛 D.
fimbriutam Hook.、美花石斛 D. loddiqesii Rolfe、木
石斛D. crumentatum Sw. 部分mRNA序列的同源性

图 1 H 型 (A) 和 F 型 (B) 铁皮石斛的 RNA
Fig. 1 RNA of H (A) and F (B) types of D. officinale

图 2 引物 F1/R1 扩增 cDNA 结果
Fig. 2 Amplification result of cDNA by Primer F1/R1
在 90%以上。
2.1.3 铁皮石斛 pepc 基因的 3’端和 5’端扩增 通
过 TaKaRa 公司的 3’RACE 试剂盒进行铁皮石斛
pepc 基因的 3’RACE 扩增，套式 PCR 产物经 1.2%
琼脂糖凝胶电泳，Image Quant 凝胶成像系统成像，
发现有 1 kb 左右的特异 DNA 片段（图 3-A），目的
DNA 片段进行胶回收，连接和转化，蓝白斑筛选，
挑选白斑液体培养后进行 PCR 检测，选取具有重组
子的菌液测序，测序后结果进行 NCBI BLASTn 分
析，发现与其他植物 pepc 基因的同源性较高，通过
DNAMAN 软件比对，获得大小为 908 bp 的 DNA
序列。
根据莫氏兰的 pepc 基因序列（AF530570.1）设
计特异引物，套式 PCR 产物经 1.2%琼脂糖凝胶电泳，
Image Quant 凝胶成像系统成像，发现有 1.5 kb 左右
的特异 DNA 片段（图 3-B），目的 DNA 进行胶回收，
连接和转化，蓝白斑筛选，挑选白斑液体培养后进行
PCR 检测，选取具有重组子的菌液测序，测序后结果
进行 NCBI BLASTn 分析，发现与莫氏兰、香子兰以
及陆地棉、碱蓬、花生等 pepc 基因的同源性较高，
同源性达到 99%甚至 100%。通过 DNAMAN 软件比
对，获得大小为 1 365 bp 的 DNA 序列。
采用 TaKaRa 公司的 5’RACE 试剂盒进行铁皮
A B
28S
18S


1 000 bp
750 bp

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石斛 pepc 基因的 5’RACE 扩增，套式 PCR 产物经
1.2%琼脂糖凝胶电泳，Image Quant 凝胶成像系统
成像，发现有 1 kb 左右的特异 DNA 片段（图 3-C），
目的 DNA 片段进行胶回收，连接和转化，蓝白斑
筛选，挑选白斑液体培养后进行 PCR 检测，选取具
有重组子的菌液测序，测序后结果进行 NCBI
BLASTn 分析，发现与莫氏兰、香子兰的 pepc 基因
同源性较高，分别达到 91%和 71%。通过 DNAMAN
软件比对，获得大小为 944 bp 的 DNA 片段。

A-3’RACE 扩增 (F2/F3) B-5’端的同源序列扩增 (R2/R3) C-5’
端的同源序列扩增 (R4/R5)
A-amplification result of 3’RACE B-5’amplication of homologous
sequence (R2/R3) C-amplification result of 5’RACE (R4/R5)
图 3 3’端和 5’端扩增结果
Fig. 3 Amplification results of 3’ and 5’ ends
2.2 H 型和 F 型铁皮石斛 pepc 基因荧光定量 PCR
检测
2.2.1 铁皮石斛 GAPDH 基因（内参基因）部分序
列扩增 以铁皮石斛 cDNA 为模板，以 F6/R6 为引
物进行 PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳，获得 1 条 600
bp 左右的特异条带（图 4）。将扩增的特异 DNA 条
带进行胶回收，连接和转化，蓝白斑筛选，挑选白
斑液体培养后进行 PCR 检测，选取具有重组子的菌
液测序，测序后结果进行 NCBI BLASTn 分析，发现
与金钗石斛 GAPDH 基因的部分序列（GQ250049.1）

图 4 引物 F6/R6 扩增 cDNA 结果
Fig. 4 Amplification result of cDNA by Primer F6/R6
同源性高达 96%，扩增序列长度为 528 bp。
2.2.2 荧光定量 PCR 溶解曲线分析 由图 5 可知，
pepc 基因和 GAPDH 基因的溶解曲线都只有一个明
显的主峰，说明设计的荧光定量特异引物良好，实
验结果不受非特异性扩增和引物二聚体的干扰。
2.2.3 荧光定量 PCR 标准曲线分析 目的基因
（pepc 基因）和内参基因（GAPDH 基因）荧光
定量 PCR 的标准曲线分别为 Y1＝−3.268 X1＋
43.249，r1＝0.999 8 和 Y2＝−3.398 X2＋44.092，
r2＝0.999 7；其中 Y 为 Ct 值，X 为拷贝数。未
知样品处于不同稀释倍数的对照品之间，定量
准确；pepc 基因和 GAPDH 基因的扩增效率分
别 102.3%和 96.9%，说明 2 个基因荧光定量 PCR
引物设计合理，反应条件适宜。
2.2.4 荧光定量 PCR 扩增曲线分析 pepc 和
GAPDH 的荧光定量 PCR 扩增曲线见图 6，由图可
知，2 个基因的扩增曲线均为 S 形曲线，pepc 基因
的 Ct 值均在 15～30，而 GAPDH 基因的 Ct 在 15～
32，说明对照品的稀释倍数基本合理，未知样品模
板量适宜，因此试验数据准确性高。
2.2.5 荧光定量 PCR 数据分析 根据未知样品的
Ct 值和荧光定量的标准曲线，计算两种铁皮石斛

图 5 pepc 基因 (A) 和 GAPDH 基因 (B) 熔解曲线
Fig. 5 Melting curves of pepc (A) and GAPDH (B) genes

A B C
2 000 bp
1 000 bp

5 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp

54 58 62 66 70 74 78 82 86 90 94 54 58 62 66 70 74 78 82 86 90 94
350

250

150

50

−50
−d
(R
FU
) /
d
T
450
350
250
150
50
−50
−d
(R
FU
) /
d
T
A B
温度 / ℃
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图 6 pepc 基因 (A) 和 GAPDH 基因 (B) 扩增曲线
Fig. 6 Amplification curves of pepc (A) and GAPDH (B) genes
pepc 基因和 GAPDH 基因的 Ct 值和起始拷贝数。F
型和 H 型铁皮石斛 pepc 基因的 Ct 值分别为 26.49、
28.95，拷贝数分别为 1.36×105、2.45×104；F 型和
H 型铁皮石斛 GAPDH 基因的 Ct 值分别为 31.22、
31.25，拷贝数分别为 6.14×103、6.00×103。pepc
基因在两种铁皮石斛叶片中的表达存在差异，F 型
铁皮石斛 pepc 的表达量明显高于 H 型，前者为后
者的 5.55 倍。而 GAPDH 基因在两种铁皮石斛叶片
中的表达量相当。
3 讨论
3.1 铁皮石斛 pepc 基因核苷酸与其他植物 pepc 基
因有较高的同源性
本研究克隆了铁皮石斛的 pepc 基因，全长为
3 560 bp，其中 cds序列为 2 895 bp，A/T量为 56.3%，
G/C 量为 43.7%，与兰科植物的同源性为 85%，与
其他科属植物的同源性也达到 70%以上。
3.2 铁皮石斛 pepc 基因与其他植物 pepc 基因的生
物信息学基本一致
铁皮石斛pepc基因cds序列编码964个氨基酸，
其中编码的亮氨酸和谷氨酸较多，而半胱氨酸较少，
氨基酸序列与兰科植物的同源性为 89%，多肽的分
子质量为 109 990，理论等电点为 5.995。对多肽进
一步分析表明存在信号肽的可能性为 0.000，进行结
构域分析发现，只有 pepc 结构域，数据库编号为
COG235，与蔡小宁等[12]对 C3 和 C4 植物 pepc 基因
的生物信息学分析结果一致。
3.3 pepc基因在F型铁皮石斛中的表达量高于H型
PEPC 催化 C4 和 CAM 代谢途径中的第一步反
应，是光合作用源头关键酶，因此 pepc 基因表达量
的高低对光合速率有着至关重要的作用，也必定会
对光合产物的积累起促进作用。在转 pepc 基因的植
物中发现，pepc 基因高表达的植株确实能提高光合
效率，如迟伟等[13]研究了转 pepc 基因水稻的光合生
理特性，结果表明转 pepc 基因水稻 PEPC 活性比原
种提高 20 倍，饱和光合速率比原种高 55%，测定
光合日变化看出在 1 d 中不同时间，转 pepc 基因水
稻的光合速率均高于原种。铁皮石斛为 CAM 植物，
特别是晴天 CAM 途径更加明显，而光合产物（多
糖类物质）又是铁皮石斛的主要药效成分，要提高
铁皮石斛的多糖量，提高其叶片 pepc 基因的表达量
是一条重要的途径。对 F 型和 H 型铁皮石斛叶片的
糖代谢源头关键酶 pepc 基因进行荧光定量分析结
果表明，pepc 基因在 F 型铁皮石斛中的表达量为 H
型的 5.55倍，这一结果可能说明 F型铁皮石斛源（铁
皮石斛叶片）的同化能力较强，以产生更多的同化
产物（包括多糖类物质）向库器官（铁皮石斛茎）
输出。但是对于铁皮石斛 pepc 基因的作用机制、定
位以及功能还有待于进一步研究。
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0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
荧
光
强
度

2 200
1 800
1 400
1 000
600
200
−200
荧
光
强
度

2 200
1 800
1 400
1 000
600
200
−200
A B
PCR 扩增循环数
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天津中草药杂志社售过刊信息
天津中草药杂志社是经国家新闻出版总署批准于 2009 年 8 月在天津滨海新区注册成立。编辑出版
《中草药》、Chinese Herbal Medicines、《现代药物与临床》（2009 年由《国外医药•植物药分册》改刊）、
《药物评价研究》（2009 年由《中文科技资料目录•中草药》改刊）。欢迎投稿，欢迎订阅。
《中草药》杂志合订本：1974—1975 年、1976 年、1979 年、1988—1993 年（80 元/年），1996、1997
年（110 元/年），1998 年（120 元/年），1999 年（135 元/年），2000 年（180 元/年），2001—2003 年（200 元
/年），2004 年（220 元/年），2005 年（260 元/年），2006—2008 年（280 元/年），2009 年（400 元/年），2010
年（400 元/年），2011 年（550 元/年）。
《中草药》增刊：1996 年（50 元），1997 年（45 元），1998 年（55 元），1999 年（70 元），2000、2001
年（70 元），2002—2007 年（65 元/年），2008、2009 年（55 元/年）。凡订阅《中草药》杂志且提供订阅凭
证者，购买增刊 7 折优惠，款到寄刊。
Chinese Herbal Medicines 合订本：2010 年（150 元/年），2011 年（150 元/年）。
《现代药物与临床》合订本：2009 年（120 元/年），2010 年（120 元/年），2011 年（120 元/年）。
《国外医药 • 植物药分册》合订本：1996—2008 年（80 元/年），2006—2008 年（90 元/年）。
《药物评价研究》2009 年单行本每册 15 元，2010 年合订本（120 元/年），2011 年（120 元/年）。
《中文科技资料目录·中草药》：1993—2006 年合订本（全套 2040 元），2007—2008 年单行本，每册定
价 30 元，全年订价 210 元（6 期＋年索引）。

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