全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 3 期 2011 年 3 月 •521•
柞蚕雄蛾提取液对荷瘤大鼠放疗后肿瘤组织缺氧诱导因子-1α表达的影响
张俊平，张维东*，张月英，王朝霞，贾 青，王兆朋
山东省医学科学院基础医学研究所 山东现代医用药物与技术重点实验室，山东 济南 250062
摘 要：目的 探讨柞蚕雄蛾提取液对放疗后荷瘤大鼠肿瘤组织缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达的影响。方法 制备 W256
荷瘤模型，常规放疗后，柞蚕雄蛾提取液 16.53 mg/kg 连续 ig 给药 10 d。采用免疫组化染色检测肿瘤组织中 HIF-1α和血管
内皮生长因子（VEGF）的表达；原位杂交法检测肿瘤组织中 HIF-1α mRNA 表达。结果 免疫组化结果显示，与模型组比
较，放疗组肿瘤组织 HIF-1α 和 VEGF 蛋白表达有增强趋势（P＞0.05）；放疗联合柞蚕雄蛾提取液（联合组）和柞蚕雄蛾提
取液组肿瘤组织 HIF-1α 和 VEGF 的表达均显著减弱（P＜0.05)，且 HIF-1α 与 VEGF 呈明显正相关（r＝0.649，P＜0.01）。
原位杂交结果显示，放疗组较模型组 HIF-1α mRNA 表达无统计学意义（P＞0.05）；联合组及柞蚕雄蛾提取液组肿瘤组织
HIF-1α mRNA 表达均降低（P＜0.05）。结论 柞蚕雄蛾提取液对放疗后及未实施放疗的肿瘤组织 HIF-1α的表达有下调作用。
关键词：柞蚕；雄蛾；缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）；血管内皮生长因子（VEGF）；放疗
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)03 - 0521 - 05
Effect of extract from male zooid of Antheraea pernyi on hypoxia-inducible factor-1α
expression in tumor-bearing rats after radiotherapy
ZHANG Jun-ping, ZHANG Wei-dong, ZHANG Yue-ying, WANG Zhao-xia, JIA Qing, WANG Zhao-peng
Key Laboratory for Modern Medicine and Technology of Shandong Province, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy
of Medical Sciences, Jinan 250062, China
Abstract: Objective To investigate the effect of the extract from male zooid of Ahtheraea pernyi on the expression of
hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) in tumor-bearing rats after radiotherapy. Methods W256 tumor model was established by
continuous ig administration of the extract from the male zooid of A. pernyi (16.53 mg/kg) for 10 d after conventional radiotherapy. To
observe the expression of HIF-1α and vascular endothelial growth factor (VEGF) in tumor tissue by immunohistochemical staining
and the HIF-1α mRNA expression by in situ hybridization (ISH). Results Compared with the model group, immunohistochemistry
results showed the expression of HIF-1α and VEGF increased with tendency (P>0.05) in tumor tissue of the rats in radiotherapy group,
and the HIF-1α and VEGF expression in the combination group and the extract from the male zooid of A. pernyi group decreased
significantly (P<0.05). HIF-1α and VEGF were correlation positively (r = 0.649, P<0.01). ISH results revealed the expression of
HIF-1α mRNA was no statistical significance (P>0.05) in radiotherapy group compared with the model group. However, the HIF-1α
mRNA expression in tumor tissue was lower in both the combined group and the extract from male zooid of A. pernyi group (P<0.05).
Conclusion The extract from male zooid of A. pernyi could down-regulate the HIF-1α expression in tumor tissue after radiotherapy
or without radiotherapy.
Key words：Antheraea pernyi Guérin-Méneville; mail zooid; hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α); vascular endothelial growth factor
(VEGF); radiotherapy

缺氧是大多数实体瘤的特征之一[1]，缺氧诱导
因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是
肿瘤细胞对缺氧反应的主要调节者[2]。局部肿瘤放
疗产生大量的活性氧簇（reactive oxygen species，
ROS）和自由基[3]，具有稳定HIF-1α的作用[4]。细胞
缺氧、ROS和自由基增多均可调控HIF-1α表达[5]，并
诱导其下游基因，如血管内皮生长因子（VEGF）、
转化生长因子（TGF-β）等表达，参与肿瘤血管生

收稿日期：2010-05-25
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30472260）；山东省自然科学基金资助项目（Y2006C92）
作者简介：张俊平（1981—），女，山东德州人，在读硕士，从事肿瘤病理研究。E-mail: junpingzhang1@163.com
*通讯作者 张维东 Tel: (0531)82919939 E-mail: zhangweidongkui@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 3 期 2011 年 3 月 •522•
成，抑制免疫细增殖及功能，促进肿瘤生长[6]。近
年来，以HIF-1α为靶点寻找改善肿瘤组织缺氧微环
境的途径，从而提高肿瘤治疗的疗效已成为研究热
点。前期研究发现柞蚕雄蛾提取液可逆转荷瘤大鼠
放射性免疫抑制[7]，为减轻放疗不良反应提供了新
的治疗途径。本实验进一步探讨柞蚕雄蛾提取液对
荷瘤大鼠放疗后缺氧微环境的影响，观察肿瘤组织
中HIF-1α表达的变化，为柞蚕雄蛾提取液的进一步
开发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 药品及试剂
柞蚕雄蛾提取液 [8]（含游离氨基酸总量为
11.336 mg/mL），由山东省蚕业研究所提供，HIF-1α
单克隆鼠抗购于Santa Cruz公司，VEGF单克隆兔抗
购于Biotechnology公司；原位杂交试剂盒均由武汉
博士德公司生产， HIF-1α探针序列为（ 1 ）
5’-TTATGAGCTTGCTCATCAGTTGCCACTTCC-3’；
（ 2） 5’-CTCAGTTTGAACTAACTGGACACAGTG
TGT-3’；（3）5’-GGCCGCTCAATTTATGAATATT
ATCATGCT-3’。DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥
生物技术有限公司。
1.2 主要仪器
SW—CJ—IC 标准型双人净化工作台为苏州净
化设备厂产品；西门子 PRIMUS 医用电子直线加速
器为德国西门子公司产品；德国 Leica DM4000B 光
学显微镜和德国 Leica Qwin V3 图像分析软件为德
国 Leica 公司产品。
1.3 大鼠 W256 荷瘤模型制备
雄性Wistar大鼠 45 只，体质量（180±20）g，
购自山东大学实验动物中心，动物许可证：SCXK
（鲁）20030004。W256 腹水瘤种，购自中国医学科
学院药物研究所药理室。从荷腹水型Walker-256 瘤
种大鼠腹腔中抽取传代 7～9 d的腹水，用生理盐水
稀释成 4×107/mL细胞悬液，于大鼠右侧腋部皮下
接种，0.2 mL/只，5 d成瘤。
1.4 分组、照射及干预
荷瘤大鼠随机分为模型组、放疗组、放疗联合
柞蚕雄蛾提取液组（联合组）和柞蚕雄蛾提取液组，
每组 10 只。放疗组和联合组给予常规肿瘤组织放
疗，吸收剂量 1 Gy/min，源皮距 205 cm，5 Gy/d，
连续照射 2 d，共 10 Gy，其他部位铅板屏蔽；给药
组于照射后 24 h ig给予柞蚕雄蛾提取液，剂量为
16.53 mg/kg[9]，模型组和放疗组给予等量生理盐水，
每日 1 次，连续 10 d。于末次给药 24 h后处死动物，
剥离瘤体，固定、包埋、切片，免疫组化染色检测
肿瘤组织HIF-1α和VEGF的表达，原位杂交法检测
HIF-1α mRNA的表达。
1.5 免疫组化染色检测肿瘤组织HIF-1α及VEGF的
表达
免疫组化采用SP法，具体步骤：石蜡切片常规
脱腊至水，0.3% H2O2室温孵育 10 min以消除内源性
过氧化物酶；水浴高温抗原修复 10 min，PBS洗涤
3 次，5 min/次；滴加一抗（1︰100），4 ℃过夜，
37 ℃孵育 1 h；PBS洗涤 3 次，5 min/次；滴加HRP
标记的二抗（1︰100），37 ℃孵育 50 min；PBS洗
涤 3 次，5 min/次；DAB显色 5～10 min，显微镜下
控制显色程度；苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透
明，封片，镜下观察。用PBS替代一抗作为阴性对
照。应用Leica Qwin V3 图像分析软件在相同灰度阈
值设定条件下，放大倍数为 200 倍，随机选取 5 个
视野，取平均灰度值，其值越小说明HIF-1α及VEGF
蛋白表达越多。
1.6 原位杂交法检测肿瘤组织HIF-1α mRNA表达
步骤按照试剂说明书进行，阴性对照用预杂交
液代替寡核苷酸探针，其余成分相同。灰度值检测
方法同上。
1.7 统计学处理
各组数据采用 sx ± 表示，凡符合正态分布和方
差齐性检验的数据，应用单因素方差分析（One-way
ANOVA）；对不符合正态分布或方差齐性的数据，
则应用 Wilcoxon 秩和检验；HIF-1α 与 VEGF 相关
性采用 Sparman 相关分析。数据均采用 SPSS11.0
统计软件处理。
2 结果
2.1 各组肿瘤组织 HIF-1α及 VEGF 表达
HIF-1α和 VEGF 阳性反应均为棕黄色颗粒，均
定位于肿瘤细胞的细胞核或细胞质。HIF-1α主要表
达于肿瘤坏死区周围或坏死区内，VEGF 主要表达
于肿瘤坏死区周围。数据显示，放疗组肿瘤组织
HIF-1α和 VEGF 表达较模型组呈一定的增高趋势，
但无统计学意义（P＞0.05）；给予柞蚕雄蛾提取液
后，联合组与放疗组相比，肿瘤组织HIF-1α和VEGF
表达均降低（P＜0.05），柞蚕雄蛾提取液组与模型
组比较，差异显著（P＜0.05），与联合组比较，差
异无统计学意义（P＞0.05）。结果见图 1，其灰度
值分析见表 1。
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模型组 放疗组 联合组 柞蚕雄蛾提取液组

HIF-1α

VEGF
图 1 免疫组化检测各组肿瘤组织中HIF-1α和VEGF表达
Fig. 1 Immunohistochemical staining detection of HIF-1α and VEGF expression in tumor tissue of every group
表 1 荷瘤大鼠放疗后肿瘤组织 HIF-1α和 VEGF 表达的灰度值分析 ( 01=± n , sx )
Table 1 Gray value analysis on HIF-1α, VEGF, and HIF-1α mRNA expression in tumor bearing rats
after radiotherapy ( 01=± n , sx )
组 别 剂量/(mg·kg−1) HIF-1α VEGF HIF-1α mRNA
模型 − 159.46±17.58 150.98±20.18 161.46±17.20
放疗 − 120.52±18.40 142.24±14.21 154.52±17.72
联合 16.53 180.43±16.65* 173.53±15.74* 190.43±15.55*
柞蚕雄蛾提取液 16.53 164.77±19.52△ 166.86±17.48△ 182.57±18.46△
与放疗组比较：*P＜0.05；与模型组比较：△P＜0.05
*P<0.05 vs radiotherapy group; △P<0.05 vs model group
2.2 肿瘤组织中 HIF-1α与 VEGF 的关系
Spearman 相关分析显示，HIF-1α 与 VEGF 表
达呈正相关（r＝0.649，P＜0.01）。
2.3 各组肿瘤组织 HIF-1α mRNA 表达
HIF-1α mRNA 在肿瘤组织中普遍表达，主要分
布于肿瘤坏死区周围或坏死区内，其阳性反应结果
为棕黄色杂交颗粒，主要定位于肿瘤细胞细胞核或
细胞质。放疗后肿瘤组织较模型组 HIF-1α mRNA
表达有一定的升高趋势，但差异无统计学意义（P＞
0.05）；给予柞蚕雄蛾提取液后，联合组与放疗组相
比，肿瘤组织 HIF-1α mRNA 表达明显降低（P＜
0.05），柞蚕雄蛾提取液组与模型组比较，差异显著
（P＜0.05），与联合组比较，差异无统计学意义（P＞
0.05）。结果见图 2，其灰度值分析见表 1。
模型组 放疗组 联合组 柞蚕雄蛾提取液组
图 2 原位杂交检测各组肿瘤组织中 HIF-1α mRNA 表达
Fig. 2 In situ hybridization detection of HIF-1α mRNA expression of in tumor tissue of every group
3 讨论
研究证实，缺氧参与了多种疾病的病理生理过
程，包括肿瘤、炎症、动脉粥样硬化、贫血及局部
缺血等。快速生长的实体瘤随体积的增大，肿瘤内
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部血供不足，致氧供和氧耗不平衡。研究发现肿瘤
内部存在一定程度或一定区域的缺氧，缺氧是实体
瘤的突出特征，在促进肿瘤组织恶性进展和治疗抵
抗过程中起重要作用[10]。放射治疗是治疗肿瘤的重
要措施之一，约 70%的恶性肿瘤患者需要接受不同
程度的放射治疗[11]，但其在发挥治疗作用的同时，
也产生了很多不良反应，如间接产生大量的活性氧
簇和自由基等[12]，均具有稳定HIF-α的作用，进而
调节HIF-α基因的转录和翻译[4]。
HIF-1 是降低低氧张力分子反应的关键调节
者，且在肿瘤组织中过表达[13]。HIF-1 由α和β两个
亚单位组成，α亚基是决定HIF-1 活性的调控亚基，
组织处于缺氧状态时它发挥转录和基因调控作用。
细胞内缺氧和（或）ROS增多时，脯氨酰羟化酶
（prolyl hydroxylase domains，PHDs）的作用受到抑
制，使HIF-1α的表达增加，转移到细胞核，与HIF-1β
结合形成杂合二聚体，与缺氧效应元件结合，激活
下游基因转录[14]。HIF-1α的下游基因有 40 多种，
涉及肿瘤细胞能量代谢、血管生成、免疫抑制、肿
瘤转移等，其中VEGF、TGF-β1 等绝大多数基因对
肿瘤的生长起促进作用[15]。
柞蚕雄蛾提取液是选用初羽化、未交尾的柞蚕
雄蛾为原料，采用低温负压抽提的方法，加工浓缩
而成。在低温下（0 ℃以下）为棕黄色，是透明度
极高、似油状的液体，并随着温度的升高（0 ℃以
下至常温）色泽逐渐变深，为棕紫色，具有典型的
蛾香味，主要含有雄性激素（蜕皮激素，12 ng/mL
以上），保幼激素及脑激素、细胞色素C等；18 种游
离氨基酸总量为 11.336 mg/mL，其中，人体必需氨
基酸达 3.287 mg/mL，占总量的 29%，赖氨酸高达
0.377 mg/mL；含维生素A 1.52 U/100 g，维生素E、
B1、B2总量 0.992 mg/100 g；8 种矿质元素含量丰富；
含脂肪量仅为 0.09%[8]。保幼激素是一种抗氧化剂，
具有抗氧化和清除自由基的作用。
通过对放疗后W256 荷瘤大鼠体内实验，应用
免疫组化染色和原位杂交方法观察到：HIF-1α和
VEGF在肿瘤组织中普遍表达，放疗后肿瘤组织中
表达均有升高趋势；联合组与放疗组相比，肿瘤组
织HIF-1α和VEGF表达均降低，表明柞蚕雄蛾提取
液对放疗后肿瘤组织HIF-1α和VEGF表达有下调作
用，柞蚕雄蛾提取液组与模型组比较，差异有统计
学意义（P＜0.05），提示柞蚕雄蛾提取液可下调未
实施放疗的肿瘤组织HIF-1α的表达。另外，HIF-1α
与VEGF表达呈较强的正相关，这与文献报道结果
基本一致[16]，表明柞蚕雄蛾提取液可间接抑制肿瘤
组织中VEGF的表达。本研究结果表明，柞蚕雄蛾
提取液对放疗后及未放疗肿瘤组织中HIF-1α的表达
有抑制作用，从而阻断肿瘤组织的自身保护，在辅
助肿瘤治疗中具有一定的应用前景，值得深入研究。
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