全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 18 期 2013 年 9 月

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五倍子抑制表皮生长因子受体活性及活性部位的 UPLC/Q-TOF-MS 分析
王冬梅 1，林森森 2，郑司浩 1，黄林芳 1*，陈士林 1
1. 中国医学科学院药用植物研究所，北京 100193
2. 中国药科大学新药筛选中心，江苏 南京 210009
摘 要：目的 应用均相时间分辨荧光（HTRF）技术，筛选发现具有抑制表皮生长因子受体（EGFR）活性的五倍子提取
物，同时采用超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪联用技术（UPLC/Q-TOF-MS）对其活性部位进行分析和鉴别。
方法 药材经石油醚渗滤、乙醇提取、醋酸乙酯萃取和水煎煮后，得到 4 个提取部位。采用 HTRF 法检测五倍子醋酸乙酯提
取物对 EGFR 的抑制作用，并计算抑制率。采用 Acquity UPLC BEH C18色谱柱，以 0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱，
200～400 nm 扫描，使用 ESI 离子源，在正离子模式下采集数据。结果 五倍子的醋酸乙酯部位显示较强的 EGFR 抑制活性，
并从其活性部位中分析鉴定出 14 个化合物，主要成分为鞣质类化合物，其中 11 个分别为石榴皮鞣素、香草醛、六羟基二苯
酰胺葡萄糖、鞣花鞣质、杨梅苷、原儿茶素、五倍子鞣质倍酰葡萄糖、五倍子鞣质、鞣花酸、3, 5-二咖啡酰奎宁酸、
monogalloyl-glucose，另外 3 个为未知成分。结论 本研究首次发现五倍子醋酸乙酯提取部位具有较强的 EGFR 抑制活性，
IC50 为 5.528 μg/mL，Q-TOF-MS 测定的相对分子质量及正离子信息鉴定表明五倍子醋酸乙酯提取物中主要为鞣质类成分，
其中五倍子鞣质、鞣花酸、鞣花鞣质为最主要成分。五倍子中含有的鞣质类成分为抑制 EGFR 活性的主要成分，为其在抗
癌方面的应用提供理论依据，同时为进一步跟踪分离活性成分奠定基础。
关键词：表皮生长因子受体抑制剂；均相时间分辨荧光；五倍子；有效成分；UPLC/Q-TOF-MS；鞣质
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)18 - 2515 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.18.005
Activity of anti-epidermal growth factor receptor in Calla Chinensis
and UPLC/Q-TOF-MS analysis on its effective part
WANG Dong-mei1, LIN Sen-sen2, ZHENG Si-hao1, HUANG Lin-fang1, CHEN Shi-lin1
1. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Beijing
100193, China
2. New Drug Screening Center, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China
Abstract: Objective Using homogeneous time-resolved fluorescence (HTRF) technology to screen the Calla Chinensis extracts with
anti-epidermal growth factor receptor activity and to analyze the active ingredients in Calla Chinensis by ultra-performance liquid
chromatography/quadrupole-time of flight mass-spectrometry (UPLC/Q-TOF-MS). Methods After percolation with petroleum
ether, ethanol extract, ethyl acetate extraction, and boiling with water, four fractions were obtained. HTRF method was applied to
detecting the inhibition of ethyl acetate fraction on EGFR, and the inhibitory rate was calculated. The chromatographic separation was
performed on Acquity UPLC BEH C18 column with a gradient elufion of 0.1% formic acid water-acetonitrile. The mass spectrometer
equipped with electrospay ionization source was used as defector, data were collected under the positive ion modes, and screened at
200—400 nm. Results The ethyl acetate fraction of Calla Chinensis showed the strong inhibitory activity on EGFR. Fourteen
compounds were analyzed and identified, among which tannins were the main active components, the 11 tannin compounds were
punicalin, vanillin, di-HHDP-glucose, ellagitannin, myricetin 3-O-rhamnoside, protocatechuic acid, gallotannin-glucose, ellagic
acid-hexose, 3, 5-dicaffeoylquinic acid, monogalloyl-glucose, and gallotannin, and the three others were unknown. Conclusion The
ethyl acetate fraction of Calla Chinensis has the significant EGFR inhibitory activity, and the IC50 value is 5.528 μg/mL. Tannins,

收稿日期：2013-02-27
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81274013）；国家自然科学基金重点项目（81130069）；人事部留学人员择优资助项目（2009-2011）；
国家重大科技专项创制新药（2011ZX09307-002-01）；教育部长江学者和创新团队发展计划（IRT1150）
作者简介：王冬梅（1984—），女，黑龙江人，硕士研究生，主要从事药用植物研究。E-mail: dongmei78160160@sina.cn
*通信作者 黄林芳 Tel: (010)57833197 E-mail: lfhuang@implad.ac.cn
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including Chinese tannin, gallogen, and ellagitannin as main constituents, are identified through the information of positive ion
and relative molecular mass determined by Q-TOF-MS. The results indicate that Calla Chinensis contains tannin ingredients to inhibit
EGFR, in the hope to provide a theoretical basis of the application in anticancer and to lay the foundation for the further tracking
separation of the active ingredients.
Key words: epidermal growth factor receptor inhibitor; homogeneous time-resolved fluorescence; Calla Chinensis; active ingredients;
UPLC/Q-TOF-MS; tannin

五倍子Calla Chinensis为漆树科植物盐肤木Rhus
chinensis Mill.、青麸杨 Rhus potaninii Maxim. 或红麸
杨 Rhus punjabensis Stew. var. sinica (Diels) Rehd. et
Wils. 叶上的虫瘿，主要由五倍子蚜Melaphis chinensis
(Bell) Baker 寄生而形成。其主要分为角倍和肚倍两
类。角倍，又名菱倍、花倍，呈不规则囊状，有若干
瘤状突起或角状分枝，干后呈黄棕色，有灰白色绒毛，
壁厚约 1～2 mm，破折面角质样。肚倍，又名独角倍，
呈纺锤状囊形，无突起或分枝，绒毛较少，壁厚 1～3
mm，折断面角质样，较角倍光亮。五倍子酸、涩、
寒，具有敛肺降火、涩肠止泻、敛汗、止血、收湿敛
疮。用于治疗肺虚久咳、肺热痰嗽、久泻久痢、自汗
盗汗、消渴、便血痔血、外伤出血、痈肿疮毒、皮肤
湿烂[1]。其化学成分主要有五倍子鞣质、没食子酸和
五倍子油等。其活性成分主要是五倍子鞣质，具有抗
氧化[2-4]、抗炎[5]、抗菌[6]、抗增殖及抗癌[7-12]等多方
面药理作用。本研究首次对“角倍”-五倍子醋酸乙酯
提取物进行了表皮生长因子受体（EGFR）激酶抑制
剂活性筛选实验，并对其有效部位进行 UPLC/Q-
TOF-MS 分析，以期寻找其抗肿瘤活性成分，并为其
在抗肿瘤方面的应用提供理论依据。
1 仪器与材料
生物素标记的蛋白酪氨酸激酶多肽底物
（poly-Glu-Ala-Tyr），链激酶素标记的 XL665（经过
修饰的异藻蓝蛋白），蛋白酪氨酸激酶 VEGFR-2 和
结合生物素标记的抗磷酸化酪氨酸抗体的铕联穴状
化合物（EuK）购自 CissbioBioassay 公司；VEGFR-2、
酶反应液中MnCl2和MgCl2购自 Sigma-Aldrich；ATP
和 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）购自北京拜耳迪
生物公司；384 低体积白板（Corning，美国）；进口
枪头（Axygen，美国）。
EGFR 激 酶 （ Invitrogen ， 美 国 ）； HTRF
KinEASE-TK（Cisbio，美国）；ATP、MgCl2、MnCl2、
二硫苏糖醇（DTT，国产）；Waters AcquityTM 超高
效液相色谱仪（Waters，Millford，MA，美国），配
备高压二元梯度泵、可控温自动进样器和二级管阵
列检测器；Waters Premier TOF 飞行时间质谱仪
（Waters，Millford，MA，美国），配有 ESI 电离源
接口，Lock-spray 接口和 MassL-ynxV4.1 工作站。
ELGA PURELAB Classic—UVF 纯水机，英国。
甲醇为色谱纯，美国 Fisher 公司；超纯水，实
验室自制；其他试剂均为市售国产分析纯；阳性药
选 EGFR 非选择性抑制剂星形孢菌素（批号 37095—
10MG，Sigma-Aldrich，美国）。
五倍子于 2011 年 11 月由黄林芳副研究员和银
福军副研究员采于重庆长寿云集。样品经中国医学
科学院药用植物研究鉴定中心林余霖教授鉴定为盐
肤木 Rhus chinensis Mill. 叶上虫瘿。
2 方法
2.1 样品的制备
药材样品粉碎成粗粉，取粗粉 500 g，先用石油
醚浸泡 1 d 后渗滤提取至提取液颜色变浅（或 5 倍
药材量），回收石油醚，得石油醚提取物（10.54 g）；
残渣挥去石油醚，用 80%乙醇湿润后，再用 3 倍量
80%乙醇回流提取 2 次，每次 2 h, 合并提取液，减
压回收乙醇至无醇味，用等体积醋酸乙酯萃取 2 次，
合并醋酸乙酯萃取液，回收醋酸乙酯至干，得醋酸
乙酯萃取物（15.93 g）；母液浓缩至干，得乙醇提取
物（20.47 g）；残渣挥干乙醇，用 3 倍量的水煎煮 2
次，每次 2 h, 合并水煎液，浓缩至干，得水提取物
（44.82 g）。
2.2 活性测定方法
2.2.1 原理 均相时间分辨荧光（HTRF）方法分
为2个步骤：一是酶促反应，即当加入ATP后启动反
应，激酶使底物发生磷酸化反应，将磷酸根连接在
有生物素标记的底物上；二是终止及检测过程，在
这个过程中EDTA终止了反应的进行，有铕元素标
记抗磷酸化酪氨酸抗体靠近底物的磷酸根上，标记
XL665的异藻蓝蛋白结合在底物的生物素标记上，2
个荧光基团在互相靠近的过程中发生能量共振转移
并发射出荧光，其信号强弱与底物的磷酸化程度成
正相关。所以通过检测荧光强弱就可得出激酶活性
强弱。HTRF是对待测样品进行双波长检测，样品分
别在620 nm 和665 nm处发射荧光，其中发生能量
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共振转移时在665 nm处产生荧光，游离的TK antibody
（标记铕离子）在620 nm处发生荧光，此信号可作
为背景信号，而游离的SA-XL665只产生短暂的荧光，
通过延后检测时间（加入终止剂后1 h再进行检测）可
将其忽略。最终仪器的信号值由以下公式计算。
信号比率 = (F1－B1) / (F2－B2)
F1 为所测样品孔在 665 nm 处的荧光强度值，F2 为所测样品
孔在 620 nm 处的荧光强度值，B1 为空白对照在 665 nm 处
的荧光强度值，B2 为空白对照在 620 nm 处的荧光强度值
2.2.2 EGFR 活性测定方法 以 384 孔板为实验容
器每孔加入 20 μL 缓冲液，10 μL 反应底物，10 μL
VEGFR-2 激酶，10 μL ATP。在 37 ℃孵箱中孵育
30 min。然后，依次加入 25 μL 链激酶素标记的
XL665 及 25 μL EuK 标记的抗磷酸化的酪氨酸激酶
抗体，室温反应用 60 min。荧光信号参数设置如下：
激发波长 670 nm，发射波长 670、612 nm，延迟时
间 150 s，测量时间 500 s，增益值 150。反应设 3 复
孔，检测时每孔读数 10 次，每次读取吸光度（A）
值，设阴性对照及空白对照。计算抑制率。
抑制率＝（A 对照－A 样品）/（A 对照－A 空白）
2.2.3 样品筛选 计算抑制率后对五倍子醋酸乙酯
提取物进行复筛。复筛时每个样品依次稀释为 5 个
质量浓度，实验重复 3 次，分别为 10、1、0.1、0.01、
0.001 μg/mL。根据测定结果计算 IC50 值。
2.3 活性成分测定条件
2.3.1 色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC
TM BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；体积流
量 0. 35 mL/min；柱温 35 ℃；流动相为 0.1%甲酸
水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0～3 min，15%
B；3～4 min，15 %～18% B；4～6 min，18 %B；6～
7 min，18%～22%B；7～8 min，22%～27%B；8～
9min，27%～30%B；9～10 min，30%～45%B；10～
11 min，45%～70%B；11～12 min，70%～85% B；
12～13 min，85%～95%B；13～14 min，95%～
100%B；进样量 4 μL。
2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），采用正离
子模式检测；脱溶剂气流量为 800 L/h，脱溶剂气温
为 450 ℃，锥孔气流量为 50 L/h，离子源温度为 120
℃，毛细管电压为 3 kV，锥孔电压为 40 V。0.1 s
（间隔 0. 02 s），质量扫描范围 m/z 50～1200。
2.4 供试品溶液的制备
取已制得的五倍子醋酸乙酯提取物 50.12 mg，精
密称定，置于 25 mL 的量瓶中，加甲醇定容至刻度（终
质量浓度 2.004 8 mg/mL），摇匀，滤过，备用。
3 结果与分析
由表 1、图 1 可见，五倍子 4 个部位具有不同程
度的 EGFR 抑制活性。在终质量浓度为 10 μg/mL 时，
石油醚提取物、乙醇提取物、醋酸乙酯提取物、水提
取物抑制率分别为 63.77%、19.08%、77.38%、63.88%。
而五倍子醋酸乙酯部位活性最强，其 IC50 值为 5.528
μg/mL，其他 3 个部位未检测到。图 1 表明，五倍
子醋酸乙酯提取物在对数浓度为 1 时，对 EGFR 活
性抑制作用才达到测定要求，故本实验选定的五倍
子提取物终浓度为 10 μg/mL。
按“2.3”项下分析条件进行测定，绘制五倍子
醋酸乙酯溶液的 UPLC/Q-TOF-ESI/MS (+)离子流
图，见图 2。
采用 Micro mass Marker lynx 软件进行数据处
理，根据正离子模式的一级质谱的分子离子峰得
到化合物的准确相对分子质量，计算出其元素组
成。再由正离子的二级质谱中碎片信息，结合文
献报道[14-17]，对五倍子用 UPLC 分离出的 14 个主
要峰进行分析，推断出其可能的成分，结果见表 2。
表 1 五倍子各提取部位对 EGFR 的抑制率及 IC50值
( ± = 3x s n, )
Table 1 Inhibitory rates of various fractions of Calla Chinensis
on EGFR and IC50 values ( ± = 3x s n, )
测试部位 抑制率 / % IC50 / (μg·mL−1)
石油醚提取物 63.77 —
乙醇提取物 19.08 —
醋酸乙酯提取物 77.38 5.528 0
水提取物 63.88 —
星形孢菌素 94.43 0.367 5


图 1 五倍子醋酸乙酯提取部位对 EGFR 活性抑制作用
Fig. 1 Inhibition of ethyl acetate fractions of Calla
Chinensis on EGFR activity

100
80
60
40
20
0
−20
−3 −2 −1 0 1 2
质量浓度对数
抑
制
率
/
%

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图 2 五倍子醋酸乙酯提取物总离子流图
Fig. 2 Total ion chromatogram of ethyl acetate
extracts of Calla Chinensis
4 讨论
五倍子始载于《开宝本草》，陈静岚等[18]用五
倍子注射液治疗早期宫颈癌是五倍子各种药理活性
的综合体现。本研究对五倍子醋酸乙酯提取物进行
了 EGFR 活性筛选，并对其活性部位进行成分分析，
分析鉴定出鞣质类成分 14 种，如五倍子鞣质，鞣花
酸，鞣花鞣质，这些化合物具有抗癌等药理作用，
作为中国特产的五倍子在抗癌方面其物质基础和作
用机制方面有待更深入的研究，以利于新药的开发
和为临床应用研究提供严实可靠的依据。
五倍子适宜生长在温暖湿润的山区和丘陵地带。
我国主要产区集中在四川、贵州、云南、湖北、陕西、
湖南、甘肃、广东、浙江、江西、福建、山西等地。
表 2 五倍子醋酸乙酯提取物中成分鉴定表
Table 2 Compounds identified in ethyl acetate extract of Calla Chinensis
峰号 t / min [M＋H]＋ (m/z) MS2 碎片 (m/z)
相对分子
质量
化学式 结构鉴定
1 0.93 783.114 3 782.114 6 782 C34H22O22 石榴皮肉素表[17]
2 1.19 153.008 9 136.009 3 152 C8H8O3 香兰素[15, 17]
3 5.41 785.113 4 481.301 0 784 C34H26O22 六羟基联苯二甲酰基葡萄糖[14-15]
6.82 934.128 7 757.104 6, 633.102 4, 527.110 1, 301.107 8 933
8.24 1 086.147 0 783.146 8, 301.108 0 1 085
4
10.69 1 125.524 7 [M＋Na]＋ 1101.120 4, 627.092 7, 144.105 9 1 102
C36H52O28 鞣花鞣质[14-15]
8.72 464.340 8 463, 3 162 463 5
12.23 518.322 1 [M＋Na]＋ 492.069 7, 476.095 8, 193.025 3, 175.090 2 494
C21H20O13 杨梅素 3-O-鼠李糖苷[17]
6 8.92 155.009 3 153.008 9, 109.009 0 154 C7H6O4 原儿茶酸 [15]
7 10.63 982.681 1 981.680 1, 802.680 8, 331.073 4, 169.025 3 981 C40H52O28 五倍子鞣质葡萄糖[14]
8 10.72 465.341 3 464.340 9, 301.321 0 464 C21H20O12 鞣花酸己糖[16-17]
9 10.74 856.734 5 857.735 0 未知
10 11.04 539.096 2 [M＋Na]＋ 516.095 6, 353.095 4, 179.095 8, 172.099 4 516 C25H24O12 3, 5-二咖啡酰奎宁酸[15]
11 11.68 274.265 9 未知
12 12.61 520.338 7 未知
13 12.72 333.328 9 271.322 2, 169.025 4 332 C13H16O11 单没食子酸葡萄糖[15]
14 15.37 788.561 8 788.560 6 787 C34H28O22 五倍子鞣质[15]

这些省份的五倍子产量占全国总产量的 90%以上。以
角倍的产量最大，肚倍的质量为佳。商品五倍子中角
倍类主产区分布在长江以南，产量约占全国五倍子总
产量的 75%；肚倍类则主产于长江以北，产量约占
总产量的 20%；倍花类分布较分散，仅占总产量的
5%[19]，随着五倍子活性的发现和作用机制的阐明，
作为中国特产的五倍子的应用前景将会越来越广阔。
本实验采用均相时间分辨荧光免疫分析方法筛
选得到了抑制 EGFR 活性较好的提取部位，其特点
是方法简便快速、灵敏度高、重复性好。本实验通
过 UPLC/Q-TOF-MS 对五倍子醋酸乙酯提取物进行
分析，具有快速、准确的特点，是一种相对较好的
定性方法，为今后五倍子药材的质量控制及应用提
供方法基础。
参考文献
[1] 中国药典 [S] 一部. 2010.

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