全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 1 期 2011 年 1 月 • 108 •
龟板提取物靶向 BMP4 通路抑制 PC12 细胞凋亡
曹佳会 1，伍艺灵 1，张还添 2，陈 兰 1，刘 洋 1，李伊为 1，周健洪 1，陈东风 1, 3*
1. 广州中医药大学 解剖学教研室，广东 广州 510405
2. 暨南大学附属第一医院 骨科，广东 广州 510632
3. 南京大学 生物医药技术国家重点实验室，江苏 南京 210093
摘 要：目的 探讨龟板提取物（Testudinis Carapax et Plastrum extracts，TCPE）对血清饥饿诱导的 PC12 细胞凋亡的保护
作用及其机制。方法 采用血清饥饿 3 d 的方法建立 PC12 细胞凋亡模型，并将细胞分为对照组，模型组，TCPE 低、高剂
量（3、30 μg/mL）组。在施加处理因素 3 d 后，用 MTT 比色分析测定细胞吸光度值，Annexin V/PI 双染流式细胞术测定细
胞凋亡率，Western blotting 检测 Caspase-3、BMPs 信号通路的表达水平，并检测 BMPs 信号通路阻断后 TCPE 的抗凋亡作用。
用 Bio-Rad Quantity One 凝胶分析系统对条带进行半定量分析。结果 MTT 与流式细胞术结果显示，TCPE 能提高 PC12 细
胞活性，降低 PC12 细胞凋亡率，并呈剂量依赖性，TCPE 组与模型组相比差异具有统计学意义（P＜0.05、0.01）。Western blotting
结果显示，TCPE 能降低 Caspase-3 表达，增加 BMP4、BMPR-IA、p-Smad1/5/8 的表达，TCPE 组与模型组相比，差异具有
统计学意义（P＜0.05、0.01）。TCPE 对 BMP2、BMP7、BMPR-II 的表达没有影响，BMPR-IB 没有被检测出。BMP4 中和
抗体减弱了 TCPE 的抗凋亡活性。结论 TCPE 具有抑制血清饥饿诱导 PC12 细胞凋亡的作用，且这种作用呈剂量依赖性，
其作用机制可能与激活 BMP4 信号通路表达有关。
关键词：龟板提取物；BMPs 信号通路；PC12 细胞；细胞凋亡；血清饥饿
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)01 - 0108 - 06
Inhibition of Testudinis Carapax et Plastrum extracts targeting BMP4
pathway on PC12 cell apoptosis
CAO Jia-hui1, WU Yi-ling1, ZHANG Huan-tian2, CHEN Lan1, LIU Yang1, LI Yi-wei1, ZHOU Jian-hong1,
CHEN Dong-feng1, 3
1. Department of Anatomy, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China
2. Department of Orthopaedics, First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510632, China
3. The State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Nanjing University, Nanjing 210093, China
Abstract: Objective To observe the protection of Testudinis Carapax et Plastrum extracts (TCPE) on serum starvation-induced PC12
cell apoptosis and explore its mechanism. Methods The PC12 apoptosis model was established by serum starvation for 3 d. The cells
were randomly divided into four groups: control group, model group, low-dose and high-dose (3 and 30 μg/mL) TCPE groups. In the
three days of the treatment, cell absorbance was determined by MTT, ratio of cell apoptosis was examined by Annexin V/PI double
stain flow cytometry (FCM), Caspase-3, BMP4, BMPR-IA, and p-Smad1/5/8 signaling molecular expression were detected by
Western blotting, and the anti-apoptotic effect of TCPE was observed after blocking BMPs signal pathway. Semi-quantitative analysis
of bands was carried out by Bio-Rad Quantity One gel analysis system. Results MTT and FCM analyses demonstrated that TCPE
could increase PC12 cell viability and decrease their apoptotic ratios in a dose dependent manner. Western blotting results showed that
TCPE could decrease Caspase-3 expression, promote the expression of BMP4, BMPR-IA, and p-Smad1/5/8. There was statistically
significant difference between TCPE (3 and 30 μg/mL) groups and model group (P<0.05, P<0.01) in all above results. While TCPE
had no effect on the expression of BMP2, BMP7, and BMPR-II. BMPR-IB hadn’t been detected. The anti-apoptotic activity was
partially mitigated by neutralizing BMP4 antibody. Conclusion TCPE has the capacity to inhibit the apoptosis of PC12 induced by
serum starvation in a dose dependent manner and its mechanism may be associated with partially activating and up-regulating the
expression of BMP4 signaling pathway.
Key words: Testudinis Carapax et Plastrum extracts (TCPE); BMPs signal pathway; PC12 cell; cell apoptosis; serum starvation

收稿日期：2010-05-10
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30772861，30472272）
作者简介：曹佳会（1986—），女，四川泸州人，在读研究生，研究方向为中医药调控神经干细胞防治重大神经疾病。E-mail: xiaocaolike123@163.com
*通讯作者 陈东风 Tel: (020)39358001 E-mail: CDF27212@21cn.com
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研究表明，细胞凋亡在帕金森病（Parkinson
disease，PD）的黑质多巴胺能神经元死亡中起重要
作用[1-2]。目前，PD 神经保护的临床药物和方法主
要有单胺氧化酶抑制剂、线粒体保护剂、多巴胺受
体激动剂、抗炎药物以及神经营养因子和生长因子
移植治疗等，但药物不良反应大，机体耐药性强，
不能从根本环节延缓神经退行性病变，以及生长因
子半衰期短，价格昂贵，限制了其广泛使用。根据
肾生髓、通脑的脏象学说，龟板为常用益肾中药，
由其为主要组成的许多经典名方，如大补阴丸、左
归丸等益肾中药是中医临床治疗神经疾病最常用的
方药。龟板提取物是从龟的背甲和腹甲提取的有机
成分[3]，有资料表明龟背可能是从胚胎神经脊发育
而来，而成骨蛋白（bone morphological proteins，
BMPs）和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth
factor，FGF）等信号蛋白介导了龟背的发育过程[4]。
BMPs 是转化生长因子超家族成员，能通过 Smad、
MAPKs 等通路抑制细胞凋亡[5-6]，在神经发育和凋
亡过程中起着重要作用。因此，推测 BMPs 信号通
路可能是龟板发挥神经保护作用的靶点。前期研究
表明，长期（3 个月）ig 龟板能改善 PD 大鼠的旋
转行为，上调 Bcl-2 以及降低 Bax 蛋白的表达，对
PD 大鼠多巴胺能神经元具有明显的保护作用[7]，并
发现可能与 BMPs 表达上调有关[8]。立足于前期实
验基础上，本研究通过建立血清饥饿 PC12 细胞凋
亡模型，从体外角度探讨龟板提取物（TCPE）的抗
凋亡作用及 BMPs 信号通路的调控机制，旨在为龟
板防治 PD 提供药理学及分子生物学证据。
1 材料
1.1 药物
龟板产地为海南省海口市，由广东省汕头市药
材采购供应站提供，经广州中医药大学中药学院李
希灿鉴定为龟科动物乌龟 Chinemys reevesii (Gray)
的背甲及腹甲。将龟板低温粉碎成粗粉，醋酸乙酯
提取，得到由甾类、脂肪酸及其酯组成的 TCPE。
其中，甾类成分包括 4-甾酮、十四酸甾醇酯和甾醇；
脂肪酸及其酯包括十六酸、十六酸甲酯、十六酸乙
酯、十八酸、十八酸甲酯、十八酸乙酯[9]。TCPE
经二甲基亚砜（DMSO）溶解后配成 30 mg/mL 溶
液，备用。
1.2 细胞与试剂
PC12 细胞（中国科学院广州生物医药与健康研
究院），高糖 DMEM、马血清和胎牛血清（FBS）、
D-Hank’s 液、0.25%胰酶、青链霉素（美国 Gibcol
公司），BMP 中和抗体（neutralizing BMP4 antibody，
N-BMP4）购于 R&D 公司，Alexa Fluor 488 Annexin
V/PI kit 购于 Invitrogen 公司，β-actin 为小鼠抗大鼠
的单克隆抗体，一抗 BMP2、BMP7、BMPR-II、
Caspase-3 为兔抗大鼠的多克隆抗体（武汉博士德公
司），BMPR-IA、BMPR-IB、BMP4、p-Smad1/5/8
兔抗大鼠的多克隆抗体（美国 Santa Cruz 公司），二
抗为羊抗兔 IgG-HRP（武汉博士德公司），超敏发
光液（北京普利莱公司），其他试剂购自美国 Sigma
公司。
2 方法
2.1 PC12 细胞培养[10]
将 PC12 细胞按 1×106/cm2 接种于培养瓶，5%
CO2、37 ℃孵箱培养。培养液为含 10%马血清、5%
FBS、1%青链霉素的高糖 DMEM，2～3 d 换液 1
次，当 PC12 细胞汇合 80%时，用含 0.25%胰酶室
温消化 2～3 min，按 1×104/cm2 传代。取对数生长
期细胞进行各种处理。
2.2 血清饥饿诱导建立 PC12 细胞凋亡模型
将细胞按 1×103/mL 种入 96 孔板（MTT 检测）
或按 1×105/mL 种入 6 孔板（Annexin V 流式细胞
术、Western blotting 检测），并分为对照组，模型组，
TCPE 低、高剂量（终质量浓度分别为 3、30 μg/mL）
组。细胞种入培养板 24 h 贴壁后，吸出培养上清，
换用各种工作液。对照组加入完全培养液，模型组
加入无血清培养液，并加入与药物组同等剂量
DMSO 2 μL，TCPE 组在加入无血清培养液的同时
加入 TCPE，3 d 后行各种检测。
2.3 MTT 测定 PC12 细胞存活率
药物作用 3 d 后，每孔加入终浓度为 5 mg/mL
的 MTT 20 μL，继续培养 4 h 后，吸弃半量培养基，
每孔加入 DMSO 100 μL，振荡 10 min，溶解细胞中
的蓝紫色结晶物，用酶标仪测定 570 nm 波长处吸
光度（A）值，判定 PC12 细胞的活性。每组 5 孔，
2 次重复独立实验。
2.4 Annexin V/PI 双染流式细胞术检测细胞凋亡率
离心收集细胞，重悬于结合缓冲液中，加入5 μL
Annexin V-Fluor 和 1 μL PI，室温避光染色 10 min，
流式细胞仪检测细胞凋亡率。正常的活细胞不被
Annexin V-FITC 和 PI 染色，凋亡早期的细胞仅被
Annexin V-FITC 染色，坏死细胞和凋亡晚期细胞可
以同时被 Annexin V-FITC 和 PI 染色。每组 3 个复
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孔，2 次重复独立实验。
2.5 Western blotting 法检测
细胞称质量，加入适量蛋白裂解液及酶抑制剂，
低温高速离心，提取蛋白。取蛋白样品，加 6×（5︰1）
上样缓冲液，100 ℃煮，离心，取 20 μL 上样，SDS
聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶 5%，分离胶 10%，于
80～100 V 电泳 80 min。将分离胶完整取下，于转
移缓冲液静置 30 min 后，转移夹靠 PVDF 膜，排除
气泡，以 31 mA 转移 60 min。取出 PVDF 膜，TTBS
洗 5 min，3 次，5%脱脂牛奶封闭 30 min，加一抗
β-actin，BMP2、BMPR-II、Smad8（1︰500 稀释），
4 ℃过夜，次日用 TTBS 洗 PVDF 膜 3 次后，加
1︰5 000 二抗（兔抗小鼠、羊抗兔 IgG-HRP），室温
反应 1 h。TTBS 洗 10 min，3 次，超敏发光液反应
5 min，X 光片感光，显影，定影，Quantity one 扫
描条带吸光度值。每组 2 张片，2 次重复独立实验。
2.6 统计学分析
数据均以 sx ± 表示，应用 SPSS 17.0 医用统计
软件包进行单因素方差分析，组间比较采用
Dunnett-t 检验。
3 结果
3.1 TCPE 对 PC12 细胞活性的影响
结果见图 1，模型组与对照组比较，细胞活性明
显下降，TCPE 呈剂量依赖性提高 PC12 细胞活性。
3.2 TCPE 对 PC12 细胞凋亡的影响
Annexin V/PI 流式细胞术结果进一步证实了
TCPE 具有抗血清饥饿诱导 PC12 细胞凋亡的能力。
结果显示（图 2），模型组凋亡率明显比对照组高，
而 TCPE 能以剂量依赖方式减少细胞凋亡的发生。
3.3 TCPE 对促凋亡分子 Caspase-3 表达的影响
为在蛋白水平上证实 TCPE 的抗凋亡活性，本
实验检测了 Caspase-3 的表达水平。Caspase-3 作为
凋亡程序的执行者，在生长因子剥离而诱导的凋亡
中扮演着关键性的角色。Western blotting 结果显
示，对照组 Caspase-3 表达较低，模型组表达明显
增强，TCPE（3、30 μg/mL）组 Caspase-3 表达降低
（图 3）。
3.4 TCPE 对 BMP2、BMP4、BMP7、BMPR-IA、
BMPR-IB、BMPR-II、p-Smad1/5/8 蛋白表达的影响
Western blotting 结果显示，对照组 BMP4 表达
明显，模型组表达下降，TCPE 组表达上调；BMP2


与对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：△P＜0.05 △△P＜0.01
**P<0.01 vs control group; △P<0.05 △△P<0.01 vs model group
图 1 TCPE 对 PC12 细胞活性的影响 ( 5=± n , sx )
Fig. 1 Effect of TCPE on activity of PC12 cells
( 5=± n , sx )


与对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：△△P＜0.01；与 TCPE（3 μg/mL）比较：#P＜0.05
**P<0.01 vs control group; △△P<0.01 vs model group; #P<0.05 vs TCPE (3 μg·mL−1) group
图 2 TCPE 抑制血清饥饿诱导的 PC12 细胞凋亡
Fig. 2 Inhibition of TCPE on serum starvation-induced PC12 cell apoptosis
100 101 102 103 104
对照
2.04
4.83
10
0 1
01
1
02
1
03
1
04

100 101 102 103 104
模型
11.00
20.82
10
0 1
01
1
02
1
03
1
04


100 101 102 103 104
1
7.72
9.74
10
0 1
01
1
02
1
03
1
04



100 101 102 103 104
5.29
8.30
10
0 1
01
1
02
1
03
1
04

对照 模型 3 30
TCPE/(μg·mL−1)
凋
亡
率
/%

**

△△

△△ #

PI
Annexin V
35

30

25

20

15

10

5

0

TCPE 3 μg·mL−1 TCPE 30 μg·mL−1
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
3 30
TCPE/(μg·mL−1)
对照 模型
**
△ △△
A
值

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与对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：△P＜0.05 △△P＜0.01
**P<0.01 vs control group; △P<0.05 △△P<0.01 vs model group
图 3 TCPE 下调血清饥饿诱导的 PC12 细胞中 Caspase-3 表达
Fig. 3 TCPE down-regulated Caspase-3 expression in PC12 cells induced by serum starvation
和 BMP7 表达，模型组和 TCPE 组无明显变化（图
4），提示 TCPE 特异性诱导 BMP4 的表达，并呈剂
量依赖性。
对照组 BMPs 受体 BMPR-IA 表达明显，模型组
表达下降，TCPE（30 μg/mL）组表达上调；BMPR-II
表达模型组和 TCPE 组没有明显差异；BMPR-IB 未
被检测出（图 4）。模型组 p-Smad1/5/8 表达下降，
TCPE 低剂量组和高剂量组表达上调（图 4）。
3.5 N-BMP4 阻断 TCPE 抑制 PC12 细胞凋亡的
作用
为证实 BMP4 信号通路参与 TCPE 抗血清饥饿
诱导 PC12 细胞的凋亡过程，将实验分为对照组、
模型组、N-BMP4（0、100、500 ng/mL）共 5 组，并
向 N-BMP4 组中加入 30 μg/mL TCPE，AnnexinV/PI
流式细胞术检测 N-BMP4 阻断 BMP4 信号通路后，
TCPE 对 PC12 细胞凋亡的影响（图 5）。


与对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：△P＜0.05 △△P＜0.01；与 TCPE（3 μg·mL−1）比较：#P＜0.05
**P<0.01 vs control group; △P<0.05 △△P<0.01 vs model group; #P<0.05 vs TCPE (3 μg·mL−1) group
图 4 TCPE 上调 BMP4 信号通路分子的表达
Fig. 4 TCPE up-regulated expression of BMP4 signaling pathway molecular
对照 模型 3 30
TCPE/(μg·mL−1)
与
β-
ac
tin
比
值

BMP4
BMP2
BMP7
β-actin
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
**
△△
△△ # BMP4
BMP2
BMP7
对照 模型 3 30
TCPE/(μg·mL−1)

BMPR-IA
BMPR-II
β-actin
对照 模型 3 30
TCPE/(μg·mL−1)
对照 模型 3 30
TCPE/(μg·mL−1)
与
β-
ac
tin
比
值

1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
BMPR-IA
BMPR-II

p-Smad1/5/8
β-actin
对照 模型 3 30
TCPE/(μg·mL−1) 对照 模型 3 30
TCPE/(μg·mL−1)
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0 与
β-
ac
tin
比
值

**
△△
△△
△

**
Caspase-3
β-actin
对照 模型 3 30
TCPE/(μg·mL−1)

对照 模型 3 30
TCPE/(μg·mL−1)
C
as
pa
se
/β
-a
ct
in

**
△△
△ 1.2
0.8
0.4
0
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与对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：△△P＜0.01；与 N-BMP4 0 ng·mL−1 组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01
**P＜0.01 vs control group; △△P＜0.01 vs model group; #P＜0.05 ##P＜0.01vs N-BMP4 0 ng·mL−1 group
图 5 N-BMP4 阻断了 TCPE 抑制血清饥饿诱导的 PC12 细胞凋亡作用
Fig. 5 Blocking of N-BMP4 to inhibition of TCPE on serum starvation-induced PC12 cell apoptosis
结果表明，N-BMP4（100、500 ng/mL）与
N-BMP4（0 ng/mL）相比，凋亡发生率增加，但比
模型组凋亡发生率少；N-BMP4（500 ng/mL）凋亡
发生率比 N-BMP4（100 ng/mL）多，表明 N-BMP4
部分阻断了 TCPE 抗血清饥饿诱导 PC12 细胞的凋
亡，并呈剂量依赖性，提示 BMP4 信号通路部分参
与 TCPE 抑制 PC12 细胞凋亡的过程。
4 讨论
PC12 细胞源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤，合成并
释放多巴胺和去甲肾上腺素等神经递质，分化后的
PC12 细胞能显示出与神经元高度相似的生理、生化
特性等性状[11]。PC12 细胞在去血清后，诱发的凋
亡与许多神经系统退变性疾病的凋亡有共同之处，
如都有共同参与凋亡的基因表达，细胞凋亡的形态
特征极为相似。因此，PC12 细胞的去血清损伤模型
常用来研究神经营养因子剥夺性损伤，其效果明显
且稳定，这也是在神经科学研究中广泛接受的研究
神经系统细胞凋亡的体外模型[12-13]。本实验 MTT
与流式细胞术发现，TCPE 能够以剂量依赖的方式
提高 PC12 细胞活性，降低 PC12 细胞凋亡发生率，
在细胞学水平证明了 TCPE 的抗凋亡作用。
Caspase-3 是线粒体凋亡通路中的效应分子，是
细胞凋亡的执行者[14]。Western blotting 结果发现，
TCPE 能显著降低 Caspase-3 的表达水平，在分子水
平上证明了 TCPE 的抗凋亡作用。国内外学者研究
发现，血清饥饿由于生长因子的剥离启动了线粒体
凋亡通路[15]。据此可推测，TCPE 可能是首先促进了
生长因子的表达，继而下调 Caspase-3 的表达，从而
发挥其神经保护潜能。BMPs 是一种超级生长因子，
能够促进成年神经组织多巴胺能神经元存活[15-17]，
在调节神经系统凋亡过程中起着关键作用。然而，
BMPs 在血清饥饿诱导 PC12 凋亡中的机制目前仍
不清楚，为了阐明 TCPE 的抗凋亡机制，本研究探
讨了 BMPs 信号通路在此过程中的角色。
与 Kano 等[18]报道的结果一致，本研究发现
PC12 细胞表达 BMP2、BMP4、BMP7 等 BMPs 配
体，然而，TCPE 只是特异性地提高了 BMP4 信号
分子的表达，对 BMP2、BMP7 的表达水平没有影
响。研究表明，BMP4 是重要的神经营养因子，在
神经组织发育、分化、凋亡中可能具有更加重要的
作用[19-20]。因此，BMP4 信号可能是 TCPE 发挥神
经保护的有效靶点。为了检测是否是受体介导的
BMP4 的抗凋亡活性，本研究检测了 BMP 受体的表
达。BMP 受体分为 I 型和 II 型，BMPs 蛋白作用时
首先和Ⅱ型受体结合并使其活化，然后 I 型受体
（BMPR-I 分为 IA 和 IB）和 BMPs 蛋白结合，在活
化的Ⅱ型受体作用下通过转磷酸基被激活，激活的
I 型受体再作用于胞内信号分子。Western blotting

100 101 102 103 104 1
00

10
1
1
02

10
3
1
04

5.01
3.49
10
0
1
01

10
2
1
03

10
4

100 101 102 103 104
16.26
16.94
40
30
20
10
0
凋
亡
率
/%

对照 模型 0 100 500
N-BMP4/(ng·mL−1)+TCPE(30 μg·mL−1)Annexin V
PI
对照 模型
PI
10
0
1
01

10
2
1
03

10
4
8.34
5.80
100 101 102 103 104 1
00

10
1
1
02

10
3
1
04

100 101 102 103 104
8.02
9.56
10
0
1
01

10
2
1
03

10
4

100 101 102 103 104
13.87
8.27
Annexin V
N-BMP4 0 ng·mL−1+TCPE 30 μg·mL−1 N-BMP4 100 ng·mL−1+TCPE 30 μg·mL−1 N-BMP4 500 ng·mL−1+TCPE 30 μg·mL−1
**
△△
#
# #
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 1 期 2011 年 1 月 • 113 •
结果显示，TCPE选择性地提高了BMPR-IA的表达，
对 BMPR-II 表达没有影响，BMPR-IB 没有检测到，
表明了 BMPR-IA 介导了 BMP4 的效应。BMP 配体
与受体结合后，Smad1/5/8 能被特异性的磷酸化并
与 Smad4 结合形成二聚体进入细胞核内，是 BMP
受体直接作用底物，影响基因转录和翻译[21]。在本
研究中，使用 Western blotting 技术发现 TCPE 以剂
量依赖的方式刺激磷酸化的 Smad1/5/8 的表达，表
明 BMP4 介导的凋亡活性传递至细胞内。用 BMP4
中和抗体抑制 BMP4 信号通路后，流式细胞术检测
发现，细胞凋亡发生率增加，部分阻断了 TCPE 的
抗凋亡活性，证实了 BMP4 信号通路在 TCPE 抑制
血清饥饿诱导 PC12 细胞凋亡中的角色。
细胞对凋亡的易感性是受调节的，阻断或延缓
细胞的凋亡将有利于 PD 疾病的治疗，本实验发现，
TCPE 浓度依赖性地对抗了血清饥饿诱导 PC12 凋
亡的发生，并与部分上调 BMP4 通路表达有关。由
于 BMP4 通路在神经系统中的重要作用，TCPE 调
节 BMP4 信号通路的表达来抑制细胞凋亡，为治疗
PD 提供了一个新视角。然而，TCPE 中有多个有效
成分，究竟何种成分在发挥作用，仍需进一步研究。
此外，凋亡发生的过程是多种因素调控的，研究
BMPs 通路与其他通路的网络关系，阐明龟板的多
靶点保护机制，对 PD 创新药物的开发具有重要作
用，也是下一步的研究方向。
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