全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 3 期 2011 年 3 月 •521•
柞蚕雄蛾提取液对荷瘤大鼠放疗后肿瘤组织缺氧诱导因子-1α表达的影响
张俊平,张维东*,张月英,王朝霞,贾 青,王兆朋
山东省医学科学院基础医学研究所 山东现代医用药物与技术重点实验室,山东 济南 250062
摘 要:目的 探讨柞蚕雄蛾提取液对放疗后荷瘤大鼠肿瘤组织缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达的影响。方法 制备 W256
荷瘤模型,常规放疗后,柞蚕雄蛾提取液 16.53 mg/kg 连续 ig 给药 10 d。采用免疫组化染色检测肿瘤组织中 HIF-1α和血管
内皮生长因子(VEGF)的表达;原位杂交法检测肿瘤组织中 HIF-1α mRNA 表达。结果 免疫组化结果显示,与模型组比
较,放疗组肿瘤组织 HIF-1α 和 VEGF 蛋白表达有增强趋势(P>0.05);放疗联合柞蚕雄蛾提取液(联合组)和柞蚕雄蛾提
取液组肿瘤组织 HIF-1α 和 VEGF 的表达均显著减弱(P<0.05),且 HIF-1α 与 VEGF 呈明显正相关(r=0.649,P<0.01)。
原位杂交结果显示,放疗组较模型组 HIF-1α mRNA 表达无统计学意义(P>0.05);联合组及柞蚕雄蛾提取液组肿瘤组织
HIF-1α mRNA 表达均降低(P<0.05)。结论 柞蚕雄蛾提取液对放疗后及未实施放疗的肿瘤组织 HIF-1α的表达有下调作用。
关键词:柞蚕;雄蛾;缺氧诱导因子-1α(HIF-1α);血管内皮生长因子(VEGF);放疗
中图分类号:R285.5 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2011)03 - 0521 - 05
Effect of extract from male zooid of Antheraea pernyi on hypoxia-inducible factor-1α
expression in tumor-bearing rats after radiotherapy
ZHANG Jun-ping, ZHANG Wei-dong, ZHANG Yue-ying, WANG Zhao-xia, JIA Qing, WANG Zhao-peng
Key Laboratory for Modern Medicine and Technology of Shandong Province, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy
of Medical Sciences, Jinan 250062, China
Abstract: Objective To investigate the effect of the extract from male zooid of Ahtheraea pernyi on the expression of
hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) in tumor-bearing rats after radiotherapy. Methods W256 tumor model was established by
continuous ig administration of the extract from the male zooid of A. pernyi (16.53 mg/kg) for 10 d after conventional radiotherapy. To
observe the expression of HIF-1α and vascular endothelial growth factor (VEGF) in tumor tissue by immunohistochemical staining
and the HIF-1α mRNA expression by in situ hybridization (ISH). Results Compared with the model group, immunohistochemistry
results showed the expression of HIF-1α and VEGF increased with tendency (P>0.05) in tumor tissue of the rats in radiotherapy group,
and the HIF-1α and VEGF expression in the combination group and the extract from the male zooid of A. pernyi group decreased
significantly (P<0.05). HIF-1α and VEGF were correlation positively (r = 0.649, P<0.01). ISH results revealed the expression of
HIF-1α mRNA was no statistical significance (P>0.05) in radiotherapy group compared with the model group. However, the HIF-1α
mRNA expression in tumor tissue was lower in both the combined group and the extract from male zooid of A. pernyi group (P<0.05).
Conclusion The extract from male zooid of A. pernyi could down-regulate the HIF-1α expression in tumor tissue after radiotherapy
or without radiotherapy.
Key words:Antheraea pernyi Guérin-Méneville; mail zooid; hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α); vascular endothelial growth factor
(VEGF); radiotherapy
缺氧是大多数实体瘤的特征之一[1],缺氧诱导
因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是
肿瘤细胞对缺氧反应的主要调节者[2]。局部肿瘤放
疗产生大量的活性氧簇(reactive oxygen species,
ROS)和自由基[3],具有稳定 HIF-1α 的作用[4]。细
胞缺氧、ROS 和自由基增多均可调控 HIF-1α表达[5],
并诱导其下游基因,如血管内皮生长因子(VEGF)、
转化生长因子(TGF-β)等表达,参与肿瘤血管生
收稿日期:2010-05-25
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30472260);山东省自然科学基金资助项目(Y2006C92)
作者简介:张俊平(1981—),女,山东德州人,在读硕士,从事肿瘤病理研究。E-mail: junpingzhang1@163.com
*通讯作者 张维东 Tel: (0531)82919939 E-mail: zhangweidongkui@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 3 期 2011 年 3 月 •522•
成,抑制免疫细增殖及功能,促进肿瘤生长[6]。近
年来,以 HIF-1α为靶点寻找改善肿瘤组织缺氧微环
境的途径,从而提高肿瘤治疗的疗效已成为研究热
点。前期研究发现柞蚕雄蛾提取液可逆转荷瘤大鼠
放射性免疫抑制[7],为减轻放疗不良反应提供了新
的治疗途径。本实验进一步探讨柞蚕雄蛾提取液对
荷瘤大鼠放疗后缺氧微环境的影响,观察肿瘤组织
中 HIF-1α表达的变化,为柞蚕雄蛾提取液的进一步
开发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 药品及试剂
柞蚕雄蛾提取液 [8](含游离氨基酸总量为
11.336 mg/mL),由山东省蚕业研究所提供,HIF-1α
单克隆鼠抗购于 Santa Cruz 公司,VEGF 单克隆兔
抗购于 Biotechnology 公司;原位杂交试剂盒均由武
汉博士德公司生产,HIF-1α 探针序列为(1)
5’-TTATGAGCTTGCTCATCAGTTGCCACTTCC-3’;
( 2) 5’-CTCAGTTTGAACTAACTGGACACAGTG
TGT-3’;(3)5’-GGCCGCTCAATTTATGAATATT
ATCATGCT-3’。DAB 显色试剂盒购自北京中杉金
桥生物技术有限公司。
1.2 主要仪器
SW—CJ—IC 标准型双人净化工作台为苏州净
化设备厂产品;西门子 PRIMUS 医用电子直线加速
器为德国西门子公司产品;德国 Leica DM4000B 光
学显微镜和德国 Leica Qwin V3 图像分析软件为德
国 Leica 公司产品。
1.3 大鼠 W256 荷瘤模型制备
雄性 Wistar 大鼠 45 只,体质量(180±20)g,
购自山东大学实验动物中心,动物许可证:SCXK
(鲁)20030004。W256 腹水瘤种,购自中国医学科
学院药物研究所药理室。从荷腹水型 Walker-256 瘤
种大鼠腹腔中抽取传代 7~9 d 的腹水,用生理盐水
稀释成 4×107/mL 细胞悬液,于大鼠右侧腋部皮下
接种,0.2 mL/只,5 d 成瘤。
1.4 分组、照射及干预
荷瘤大鼠随机分为模型组、放疗组、放疗联合
柞蚕雄蛾提取液组(联合组)和柞蚕雄蛾提取液组,
每组 10 只。放疗组和联合组给予常规肿瘤组织放
疗,吸收剂量 1 Gy/min,源皮距 205 cm,5 Gy/d,
连续照射 2 d,共 10 Gy,其他部位铅板屏蔽;给药
组于照射后 24 h ig 给予柞蚕雄蛾提取液,剂量为
16.53 mg/kg[9],模型组和放疗组给予等量生理盐水,
每日 1 次,连续 10 d。于末次给药 24 h 后处死动物,
剥离瘤体,固定、包埋、切片,免疫组化染色检测
肿瘤组织 HIF-1α 和 VEGF 的表达,原位杂交法检
测 HIF-1α mRNA 的表达。
1.5 免疫组化染色检测肿瘤组织HIF-1α及VEGF的
表达
免疫组化采用 SP 法,具体步骤:石蜡切片常
规脱腊至水,0.3% H2O2室温孵育 10 min 以消除内
源性过氧化物酶;水浴高温抗原修复 10 min,PBS
洗涤 3 次,5 min/次;滴加一抗(1︰100),4 ℃过
夜,37 ℃孵育 1 h;PBS 洗涤 3 次,5 min/次;滴
加 HRP 标记的二抗(1︰100),37 ℃孵育 50 min;
PBS 洗涤 3 次,5 min/次;DAB 显色 5~10 min,
显微镜下控制显色程度;苏木素复染,酒精脱水,
二甲苯透明,封片,镜下观察。用 PBS 替代一抗作
为阴性对照。应用 Leica Qwin V3 图像分析软件在
相同灰度阈值设定条件下,放大倍数为 200 倍,随
机选取 5 个视野,取平均灰度值,其值越小说明
HIF-1α及 VEGF 蛋白表达越多。
1.6 原位杂交法检测肿瘤组织HIF-1α mRNA表达
步骤按照试剂说明书进行,阴性对照用预杂交
液代替寡核苷酸探针,其余成分相同。灰度值检测
方法同上。
1.7 统计学处理
各组数据采用 sx ± 表示,凡符合正态分布和方
差齐性检验的数据,应用单因素方差分析(One-way
ANOVA);对不符合正态分布或方差齐性的数据,
则应用 Wilcoxon 秩和检验;HIF-1α 与 VEGF 相关
性采用 Sparman 相关分析。数据均采用 SPSS11.0
统计软件处理。
2 结果
2.1 各组肿瘤组织 HIF-1α及 VEGF 表达
HIF-1α和 VEGF 阳性反应均为棕黄色颗粒,均
定位于肿瘤细胞的细胞核或细胞质。HIF-1α主要表
达于肿瘤坏死区周围或坏死区内,VEGF 主要表达
于肿瘤坏死区周围。数据显示,放疗组肿瘤组织
HIF-1α和 VEGF 表达较模型组呈一定的增高趋势,
但无统计学意义(P>0.05);给予柞蚕雄蛾提取液
后,联合组与放疗组相比,肿瘤组织HIF-1α和VEGF
表达均降低(P<0.05),柞蚕雄蛾提取液组与模型
组比较,差异显著(P<0.05),与联合组比较,差
异无统计学意义(P>0.05)。结果见图 1,其灰度
值分析见表 1。
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图 1 免疫组化检测各组肿瘤组织中 HIF-1α和 VEGF 表达
Fig. 1 Immunohistochemical staining detection of HIF-1α and VEGF expression in tumor tissue of every group
表 1 荷瘤大鼠放疗后肿瘤组织 HIF-1α和 VEGF 表达的灰度值分析 ( 01=± n , sx )
Table 1 Gray value analysis on HIF-1α, VEGF, and HIF-1α mRNA expression in tumor bearing rats
after radiotherapy ( 01=± n , sx )
组 别 剂量/(mg·kg−1) HIF-1α VEGF HIF-1α mRNA
模型 − 159.46±17.58 150.98±20.18 161.46±17.20
放疗 − 120.52±18.40 142.24±14.21 154.52±17.72
联合 16.53 180.43±16.65* 173.53±15.74* 190.43±15.55*
柞蚕雄蛾提取液 16.53 164.77±19.52△ 166.86±17.48△ 182.57±18.46△
与放疗组比较:*P<0.05;与模型组比较:△P<0.05
*P<0.05 vs radiotherapy group; △P<0.05 vs model group
2.2 肿瘤组织中 HIF-1α与 VEGF 的关系
Spearman 相关分析显示,HIF-1α 与 VEGF 表
达呈正相关(r=0.649,P<0.01)。
2.3 各组肿瘤组织 HIF-1α mRNA 表达
HIF-1α mRNA 在肿瘤组织中普遍表达,主要分
布于肿瘤坏死区周围或坏死区内,其阳性反应结果
为棕黄色杂交颗粒,主要定位于肿瘤细胞细胞核或
细胞质。放疗后肿瘤组织较模型组 HIF-1α mRNA
表达有一定的升高趋势,但差异无统计学意义(P>
0.05);给予柞蚕雄蛾提取液后,联合组与放疗组相
比,肿瘤组织 HIF-1α mRNA 表达明显降低(P<
0.05),柞蚕雄蛾提取液组与模型组比较,差异显著
(P<0.05),与联合组比较,差异无统计学意义(P>
0.05)。结果见图 2,其灰度值分析见表 1。
图 2 原位杂交检测各组肿瘤组织中 HIF-1α mRNA 表达
Fig. 2 In situ hybridization detection of HIF-1α mRNA expression of in tumor tissue of every group
3 讨论
研究证实,缺氧参与了多种疾病的病理生理过
程,包括肿瘤、炎症、动脉粥样硬化、贫血及局部
缺血等。快速生长的实体瘤随体积的增大,肿瘤内
模型组 放疗组 联合组 柞蚕雄蛾提取液组
模型组 放疗组 联合组 柞蚕雄蛾提取液组
HIF-1α
VEGF
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 3 期 2011 年 3 月 •524•
部血供不足,致氧供和氧耗不平衡。研究发现肿瘤
内部存在一定程度或一定区域的缺氧,缺氧是实体
瘤的突出特征,在促进肿瘤组织恶性进展和治疗抵
抗过程中起重要作用[10]。放射治疗是治疗肿瘤的重
要措施之一,约 70%的恶性肿瘤患者需要接受不同
程度的放射治疗[11],但其在发挥治疗作用的同时,
也产生了很多不良反应,如间接产生大量的活性氧
簇和自由基等[12],均具有稳定 HIF-α的作用,进而
调节 HIF-α基因的转录和翻译[4]。
HIF-1 是降低低氧张力分子反应的关键调节
者,且在肿瘤组织中过表达[13]。HIF-1 由 α 和 β 两
个亚单位组成,α 亚基是决定 HIF-1 活性的调控亚
基,组织处于缺氧状态时它发挥转录和基因调控作
用。细胞内缺氧和(或)ROS 增多时,脯氨酰羟化
酶(prolyl hydroxylase domains,PHDs)的作用受
到抑制,使 HIF-1α的表达增加,转移到细胞核,与
HIF-1β 结合形成杂合二聚体,与缺氧效应元件结
合,激活下游基因转录[14]。HIF-1α 的下游基因有
40 多种,涉及肿瘤细胞能量代谢、血管生成、免疫
抑制、肿瘤转移等,其中 VEGF、TGF-β1 等绝大多
数基因对肿瘤的生长起促进作用[15]。
柞蚕雄蛾提取液是选用初羽化、未交尾的柞蚕
雄蛾为原料,采用低温负压抽提的方法,加工浓缩
而成。在低温下(0 ℃以下)为棕黄色,是透明度
极高、似油状的液体,并随着温度的升高(0 ℃以
下至常温)色泽逐渐变深,为棕紫色,具有典型的
蛾香味,主要含有雄性激素(蜕皮激素,12 ng/mL
以上),保幼激素及脑激素、细胞色素 C 等;18 种
游离氨基酸总量为 11.336 mg/mL,其中,人体必需
氨基酸达 3.287 mg/mL,占总量的 29%,赖氨酸高
达 0.377 mg/mL;含维生素 A 1.52 U/100 g,维生素
E、B1、B2 总量 0.992 mg/100 g;8 种矿质元素含量
丰富;含脂肪量仅为 0.09%[8]。保幼激素是一种抗
氧化剂,具有抗氧化和清除自由基的作用。
通过对放疗后 W256 荷瘤大鼠体内实验,应用
免疫组化染色和原位杂交方法观察到:HIF-1α 和
VEGF 在肿瘤组织中普遍表达,放疗后肿瘤组织中
表达均有升高趋势;联合组与放疗组相比,肿瘤组
织 HIF-1α 和 VEGF 表达均降低,表明柞蚕雄蛾提
取液对放疗后肿瘤组织 HIF-1α 和 VEGF 表达有下
调作用,柞蚕雄蛾提取液组与模型组比较,差异有
统计学意义(P<0.05),提示柞蚕雄蛾提取液可下
调未实施放疗的肿瘤组织 HIF-1α 的表达。另外,
HIF-1α与 VEGF 表达呈较强的正相关,这与文献报
道结果基本一致[16],表明柞蚕雄蛾提取液可间接抑
制肿瘤组织中 VEGF 的表达。本研究结果表明,柞
蚕雄蛾提取液对放疗后及未放疗肿瘤组织中
HIF-1α的表达有抑制作用,从而阻断肿瘤组织的自
身保护,在辅助肿瘤治疗中具有一定的应用前景,
值得深入研究。
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