全 文 ：血症小鼠肾脏 mURAT 1 mRNA 和蛋白高表达, 表
明氧嗪酸钾盐所引起小鼠血清尿酸水平的升高与肾
脏 mURAT1 过表达致尿酸重吸收功能增强有关。
二妙丸及黄柏水提取物可显著降低高尿酸血症小鼠
肾脏 mURAT 1 mRNA 和蛋白表达, 表明二妙丸及
黄柏水提取物可通过抑制高尿酸血症小鼠肾脏尿酸
重吸收转运子功能而达到降低血清尿酸的目的,
mURAT1 可成为二妙丸水提取物干预高尿酸血症
小鼠以维持体内尿酸盐平衡的关键靶点, 二妙丸及
黄柏水提取物对 mURAT1 调控机制等后续的相关
研究仍在进行中。
本实验在高尿酸血症小鼠模型上未观察到苍术
降尿酸及改变与尿酸合成和排泄有关组织 XOD 和
mURAT1 表达等作用, 提示二妙丸水提取物所具
有降尿酸作用可能主要源于黄柏。黄柏与苍术配伍
作用及其机制仍需要进一步探索。
参考文献:
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灵芝孢子油体内抗 Friend鼠白血病病毒的实验研究
黄鸣清,谢友良,蒋东旭,陈长青,江 滨,赖小平
(广州中医药大学, 广东 广州 510405)
摘 要:目的 探讨灵芝孢子油体内抗 F riend 鼠白血病病毒 ( Fr iend murine leukemia virus, Fr . MuLV) 感染的疗
效和作用机制。方法 用 Fr . MuLV 感染 BALB/ C 雌性小鼠, 造模小鼠 ig 给药 21 d, 比较各组动物的体质量、脾
指数、胸腺指数, CD4 + 、CD8 + 、CD4 + / CD8 + 等指标变化情况。结果 小鼠感染 F r. MuLV 后体质量严重减轻,脾明
显肿大,胸腺萎缩, CD4 + 、CD8 + 、CD4 + / CD8 + 值均显著降低。灵芝孢子油 50、100、200 mg / kg 剂量均可显著改善
体质量增长抑制、脾肿大及胸腺萎缩 ( P< 0 01) , 100、200 mg / kg 剂量组 CD4 + 、CD8 + 、CD4+ / CD8 + 值均有明显升
高 ( P< 0 01、0 05)。结论 灵芝孢子油对 F r. MuLV 感染小鼠有保护作用 ,能够改善体质量增长抑制, 抑制脾肿
大及胸腺萎缩,升高感染小鼠的 T 淋巴细胞。
关键词: F riend 鼠白血病病毒; 灵芝孢子油; 淋巴细胞
中图分类号: R285 5 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 03042304
In vivo treatment for Friend murine leukemia virus with ganoderma spore oil
HUANG M ingqing, XIE Youliang, JIAN G Dongxu, CHEN Changqing, JIANG Bin, LA I Xiaoping
( Guangzhou U niversit y of T raditiona l Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China)
Abstract: Objective T o study the ef fects of ganoderma spore oil on Friend murine leukemia v ir us
( Fr . MuLV) and its mechanism. Methods The BALB/ C female mouse was infected w ith Fr. M uLV,
body w eight , spleen index , thymus index, the percentag es of CD4
+
, CD8
+
, and CD 4
+
/ CD8
+
were mea
sured. Results Compared to the control g roup, body w eight extenuat ion, splenomegaly , and at rophy of
thymus g land severely in the model gr oup, the percentag es of CD 4
+
, CD8
+
, and CD4
+
/ CD8
+
were signif i
cant ly decreased in the model. Body w eight , spleen index, and thymus index ( P< 0 01) in ganoderma
spore oil g roup w ere improved w ith the do sage o f 50, 100, and 200 mg/ kg, the percentages of CD4 + ,
423 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
收稿日期: 20090627 基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( ! 岭南地产药材抗流感病毒药效物质基础∀ ,编号 u0732004)作者简介:黄鸣清( 1980 # ) ,男,福建福州人,广州中医药大学 2007级博士,主要从事中药新药研究与开发。
T el : 13824429004 Fax : ( 020) 39358390 Email : hmq 1115@ yah oo. com . cn
CD 8 + and CD4 + / CD 8 + were cut dow n ( P< 0 01 and 0. 05) w ith the dosage o f 100 and 200 mg/ kg . Conclu
sion Ganoderma spore oil can protect the Fr. MuLVinfected model mouse by improving body w eight
ex tenuat ion, inhibit ing splenomegaly and at rophy o f thymus g land, and increasing T lymphocyte.
Key words: F riend murine leukem ia virus ( Fr. M uLV) ; g anoderma spor e oil; lymphocy te
灵芝具有增强免疫功能、抗肿瘤、抗病毒、抗氧
化、抗衰老等多种药理作用[ 1] 。灵芝孢子油为灵芝
孢子经破壁、萃取而得到的活性部位,其主要成分三
萜类物质的量明显高于灵芝药材 [ 2]。本实验建立
Friend 鼠白血病病毒 ( F riend murine leukem ia vi
r us, Fr. MuLV) 感染 BALB/ C 雌性小鼠模型, 首
次对灵芝孢子油进行体内抗病毒作用研究, 并对其
作用机制进行初步探讨。
1 材料
1 1 主要药物、试剂与仪器: 灵芝孢子油,由广州中
医药大学新药开发研究中心提供 (总三萜质量分数
为 16 72%, 多糖质量分数为 1 09%) ; 齐多夫定
( AZT ) 胶囊, 厦门迈克制药有限公司生产, 批号
080102。CD4、CD8FITC 单克隆抗体, 均购自 e
Bioscience Ltd. ; GeneAmp PCR System 2400 仪,
PERKIN ELMER; 凝胶成像仪, Alpha Inno tech
Co rpo ration; H ITACHI # CR21F 型离心机, 日本;
流式细胞仪, Coultere Pics XL TM and XLMCL TM
flowcy tometer sy stem, Deckman Coulter Inc.。
1 2 动物: BALB/ C 雌性小鼠, SPF 级, 由广东省
医学实验动物中心提供,体质量 16~ 18 g , 饲养环
境为室温 ( 23 ∃ 2) % ,相对湿度 ( 75 ∃ 5) %, 新购入
动物观察 1周, 各项指标符合要求者用于实验。
1 3 病毒: F r. M uLV 引自美国经典培养物收藏中
心 ( AT CC) ,经 BALB/ C 小鼠体内传代,制成 10%
脾悬液, - 70% 保存。
2 方法
2 1 Friend 病毒株及其传代方法 [ 3, 4] : 取 10% 脾
悬液用流水冲浸融化, 按 1 & 10 PBS 稀释, 敏感
BALB/ C 小鼠腹腔内接种,小鼠发病增强毒力后传
代 1次,测定其半数致死量,感染 3周后处死小鼠,
灭菌取脾, 测其脾脏质量,根据各组脾脏肿大 (脾质
量大于正常对照小鼠脾质量均数+ 3倍标准差) 的
例数计算 T ID 50 ,将感染鼠脾 - 80 % 保存。
2 2 造模及分组给药:试验前,取毒种,用流水冲浸
融化,以 DMEM 稀释 10 倍, 4 % 下、2 000 r/ m in
离心 10 min,取其上清液, 置冰水中保存。
取 BALB/ C 雌性小鼠 60只,除对照组 ( 10 只
动物) 接种上述病毒上清液外, 其余各组小鼠腹部
皮肤经碘酒和酒精消毒后, 每只小鼠 ip 40 T ID50
Fr. M uLV 0. 5 mL。感染鼠脾组接种病毒后, 按体
质量分层随机分 5组,每组 10只。分别为模型组,
齐多夫定 ( 100 mg/ kg) 阳性对照组, 灵芝孢子油
高、中、低剂量 ( 200、100、50 mg/ kg ) 组, 药物治疗
组小鼠于接种后 4 h 开始 ig 给药,每天 1次, 每周 7
d,连续给药 3 周, 给药容积为 40 mL/ kg ,每周按体
质量调整给药剂量。模型组给予等体积溶媒。3周
后,观察动物毛发色泽, 精神活动状态等, 称取体质
量,眼眶取血,颈椎脱臼处死,取脾及胸腺。
2 3 评价指标
2 3 1 体质量: 在给药前, 给药第7、14、21 (给药终
末) 天各称量体质量 1次,计算体质量变化率[体质
量变化率= (给药终末体质量- 给药前体质量) /给
药前体质量 ∋ 100%]。
2 3 2 脾指数: 以滤纸吸除残留脾脏表面的血液
后,以电子天平精密称取其质量,计算脾指数 ( mg/
g )。脾指数大于对照组的均数+ 3倍标准差者视为
脾肿大,并计算脾肿大抑制率[ (药物组脾指数- 模
型组脾指数) /模型组脾指数 ∋ 100% ]。
2 3 3 胸腺指数:以滤纸吸除残留胸腺表面的血液
后, 以电子天平精密称取其质量, 计算胸腺指数
( mg/ g )。
2 3 4 CD 4 + / CD8 + 淋巴细胞亚群测定: 每 1 mL
全血加入 50 L 6% EDT A 抗凝。取 50 L 抗凝全
血分别加入 CD 3 + / CD4 + / CD8 + 特异性荧光单抗充
分混匀,室温 ( 25 % 左右) 孵育 25 min, 避光染色,
加入 500 L 溶血素于 50 L 鼠血中,室温下孵育
4~ 5 min (轻微摇动) ,加入 1 mL PBS 稀释 ( 4 %
保存) 终止反应, 以 1 000 r/ min 离心 5 min, 弃上
清,加入 500 L PBS 重悬成单细胞悬液,上流式细
胞仪分析。
2 4 统计学方法: 实验数据均以 x ∃ s 表示, 用
SPSS 11 0 统计软件包进行 ANONA 单因素方差
分析。
3 结果
3 1 动物大体观察: 经 Fr . MuLV 病毒感染 3 周
后, BALB/ C 小鼠出现体质量严重减轻、皮毛不光
泽、活动减少等变化。除模型组于接种后第 7天及
424 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
第 16天各死亡 1只外,其余各组均未见动物死亡。
3 2 体质量变化: 除对照组外, 各病毒感染鼠体质
量下降,体质量增长明显缓慢,模型组尤为明显, 体
质量基本没有增长 ( P< 0 01)。与模型组比较, 各
药物组小鼠均有不同程度的体质量增长, 能对抗病
毒引起的小鼠体质量增长受抑 ( P< 0 01) , 但其体
质量变化率均明显低于对照组小鼠 ( P< 0 01) , 见
表 1。
3 3 脾肿胀情况: 感染 3 周后, 模型组小鼠比对照
组脾脏质量显著增加,脾肿大程度明显 ( P< 0 01)。
各药物组小鼠脾质量显著减轻,脾肿大明显受抑制。
与阳性药物齐多夫定比较, 灵芝孢子油高剂量的抑
制作用与之相当 ( P> 0 05) , 中、低剂量组脾肿大抑
制率均显著降低 ( P< 0 01) ,见表 2。
表 1 Fr. MuLV 病毒感染 3 周后小鼠体质量变化 (x ∃ s)
Table 1 Body weight changes of mice in three weeks
of infection with Fr. MuLV (x ∃ s)
组别
剂量/
( mg kg- 1)
体质量 / g
给药前 给药终末
体质量变化率/ %
对照 - 17 44 ∃ 0 83 22 93 ∃ 1 95 31 70 ∃ 9 51
模型 - 17 57 ∃ 0 49 17 90 ∃ 1 84 1 82 ∃ 9 85( (
齐多夫定 100 17 22 ∃ 0 62 19 42 ∃ 1 38 12 72 ∃ 8 15( ( * *
灵芝孢子油 200 16 95 ∃ 0 55 19 86 ∃ 1 72 17 01 ∃ 9 43( ( * * ) )
100 17 33 ∃ 0 56 19 30 ∃ 0 91 11 40 ∃ 6 74( ( * * ) )
50 17 71 ∃ 0 53 18 09 ∃ 1 59 12 34 ∃ 11 14( ( * * ) )
与对照组比较: ( (P < 0 01; 与模型组比较: * * P< 001
与齐多夫定组比较: ) )P < 0 01
( (P< 0 01 v s cont rol gr ou p; * * P< 0 01 v s model group
) )P< 0 01v s AZT group
表2 Fr. MuLV 病毒感染 3 周后小鼠脾脏、胸腺指数 ( x∃ s)
Table 2 Spleen and thymus gland indexes of mice in three
weeks of inf ection with Fr. MuLV ( x∃ s)
组别
剂量 /
( mg kg- 1)
动物/
只
脾指数/
(mg g- 1)
脾肿大抑
制率 /%
胸腺指数/
(mg g- 1)
对照 - 10 4 43 ∃ 0 37 - 2 08 ∃ 044
模型 - 8 48 07 ∃ 10 27( ( - 0 92 ∃ 038( (
齐多夫定 100 10 12 61 ∃ 11 81( ( * * 73 77 1 91 ∃ 045( (* *
灵芝孢子油 200 10 14 51 ∃ 13 05( ( * * 69 81 1 62 ∃ 046( (* * ) )
100 10 22 91 ∃ 15 36( ( * * ) ) 52 34 1 36 ∃ 042( (* * ) )
50 10 34 72 ∃ 17 28( ( * * ) ) 27 77 1 17 ∃ 038( ( ) )
与对照组比较: ( (P < 0 01; 与模型组比较: * * P< 001
与齐多夫定组比较: ) )P < 0 01
( (P< 0 01 v s cont rol gr ou p; * * P< 0 01 v s model group
) )P< 0 01v s AZT group
3 4 胸腺肿胀情况: 与对照组小鼠相比, 模型组小
鼠胸腺质量明显减少,胸腺生长受抑制 ( P< 0 01)。
与模型组比较, 除灵芝孢子油低剂量组外,各药物均
能提高感染鼠的胸腺指数 ( P< 0 01) , 但仍低于对
照组小鼠的胸腺指数 ( P< 0 01)。与齐多夫定组比
较,灵芝孢子油高、中、低剂量组的抑制作用均显著
降低 ( P< 0 01) ,见表 2。
3 5 CD4 + 、CD8 + 淋巴细胞亚群变化情况: 与对照
组小鼠比较,模型组的 CD4 + 、CD8 + 、CD4 + / CD8 + 值
均显著下降 ( P< 0 01)。与模型组比较, 灵芝孢子
油高剂量组 CD 4 + 、CD8 + 、CD4 + / CD 8 + 值均有升高
( P < 0 05、0 01) , 灵芝孢子油中剂量组 CD4 + 、
CD8 + 均有升高 ( P< 0 05) , 但均显著低于齐多夫定
组 ( P< 0 01) ,见表 3。
表 3 Fr. MuLV 病毒感染 3 周后小鼠 CD4 + 、CD8 +
淋巴细胞亚群变化 (x ∃ s)
Table 3 CD4 + and CD8+ Changes in mice in three weeks
of inf ection with Fr. MuLV ( x∃ s)
组别
剂量/
(mg kg- 1 )
CD4
+ /
%
CD8
+ /
%
(CD4
+ /CD8
+ ) /
%
对照 - 56 88∃ 5 56 1918 ∃ 230 2 97 ∃ 037
模型 - 18 07∃ 4 88 ( ( 868 ∃ 228( ( 2 08 ∃ 070 ( (
齐多夫定 100 49 58∃ 5 19 ( (* * 1655 ∃ 172( (* * 2 99 ∃ 040* *
灵芝孢子油 200 35 04∃ 4 13 ( (* * ) )1271 ∃ 221( (* ) ) 2 75 ∃ 065 ( (* ) )
100 27 46∃ 5 33 ( (* ) ) 1141 ∃ 221( (* ) ) 2 41 ∃ 049 ( (* ) )
50 20 37∃ 5 44 ( ( ) ) 924 ∃ 238( ( ) ) 2 20 ∃ 057 ( ( ) )
与对照组比较: ( (P< 0 01
与模型组比较: * P < 0 05 * * P < 0 01
与齐多夫定组比较: ) ) P< 0 01
( (P < 0 01 v s cont rol group
* P < 0 05 * * P< 0 01 v s m odel group
) )P < 0 01 v s AZT group
4 讨论
4 1 动物模型的选择: Fr. M uLV 病毒与 HIV 同
属逆转录病毒,其感染的小鼠会表现出脾肿大, 抗病
毒抗体阳性,免疫抑制, 脾脏的辅助性、抑制性和细
胞毒性 T 细胞功能障碍等类似于 H IV1 感染人的
症状。已有研究表明, 灵芝多糖及灵芝三萜类化合
物具有体外抗病毒、抗 HIV1 的活性[ 5, 6] 。因此,本
研究以 Fr. M uLV 病毒感染 BA LB/ C 雌性小鼠,初
步评价灵芝孢子油体内抗病毒的疗效, 同时考察其
对类似 HIV1 感染症状的影响。
4 2 疗效评价指标的确定:抗病毒疫苗及药物的筛
选研究,通常采用感染动物存活率和脾肿大程度来
评价其疗效。本实验中模型组小鼠脾脏明显肿大,
死亡 2只。而灵芝孢子油各剂量组及阳性药组均未
见动物死亡, 且对脾肿大均有明显抑制作用。表明
本模型造模成功, 灵芝孢子油各剂量对 Fr . MuLV
病毒感染小鼠均具有一定保护作用。
4 3 灵芝孢子油对细胞免疫的干预作用:体液免疫
和细胞免疫对于 Fr. MuLV 病毒感染的恢复都非常
425 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
重要, 缺一不可。成熟 T 细胞可按 CD 抗原分为两
个亚群 CD4 + 细胞和 CD8 + 细胞, CD4 + 细胞能协助
B细胞产生抗体和其他 T 细胞分化成熟, CD8 + T
细胞能抑制 B细胞产生抗体和其他 T 细胞分化成
熟。本研究显示, F r. MuLV 病毒感染小鼠的
CD 4 + 、CD8 + 、CD4 + / CD8 + 值均显著下降, 而灵芝孢
子油各剂量均能够改善胸腺萎缩, 升高 CD4 + 、
CD 8 + 细胞比例, 升高 CD4 + / CD 8 + 值。因此, 推测
灵芝孢子油可能是通过促进 T 淋巴细胞的成熟分
化增殖, 提高机体的免疫功能, 从而起到抗病毒
作用。
参考文献:
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川楝素提取物诱导 K562 细胞凋亡的实验研究
刘小玲, 王 进,张 伶,易 钢, 何於娟*
(重庆医科大学 医学检验系 临床检验诊断学教育部重点实验室,重庆 400016)
摘 要:目的 探讨川楝素提取物对人白血病 K562 细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用及其机制。方法 采用
MTT 法检测川楝素提取物对 K562 细胞增殖的影响; W right∗s 染色观察细胞的形态学改变; 流式细胞技术检测细
胞周期与凋亡率的变化; Annex in V/ PI 双标记法检测细胞的早期凋亡变化; DNA 琼脂糖凝胶电泳观察 DNA 片段
化;比色法检测 Caspase3、Caspase8、Caspase9 相对活性的改变; RTPCR 检测凋亡相关基因 p21、bcr/ abl、H ras
mRNA 表达水平的改变。结果 川楝素提取物显著抑制 K562 细胞的增殖 ,并呈剂量时间依赖性,作用 72 h 的
IC50值为 20 nmo l/ L ;处理组细胞可见典型的凋亡形态学改变;细胞周期和 Annex in V/ PI 双标记检测表明川楝素
提取物可诱导 K562 细胞凋亡, 并呈剂量时间依赖性; 处理组细胞 DNA 琼脂糖凝胶电泳出现明显的 DNA ladder;
处理组细胞 Caspase3、Caspase8、Caspase9 的活性均显著增加; p21、Hras mRNA 表达上调, bcr/ abl mRNA 表达下
调。结论 川楝素提取物对 K562 细胞具有增殖抑制和诱导凋亡的作用,其机制与 Caspase信号途径的活化有关。
关键词:川楝素提取物; K562 细胞; 细胞凋亡
中图分类号: R285 5; R329. 28; R733. 7 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 03042606
Experimental study on K562 cell apoptosis induced by toosendanin extracts
LIU Xiaoling, WANG Jin, ZHANG Ling, YI Gang, HE Yujuan
( Key Labor ator y of Clinical Diagnostics, Depar tment o f Labo rato ry M edicine, Chongqing
M edical University, Chongqing 400016, China)
Abstract: Objective T o study the effects of toosendanin ext racts on the apoptosis of human ery thro
leukem ia K562 cells. Methods MT T Assay w as used to examine the ef fects of toosendanin ext racts on the
pro liferat ion of K562 cells. Cell morpho logical changes w ere detected by Wright∗s stain and light micro
scope. A lterat ion of cel l cy cle and apoptosis rate w as defected by f low cytometry . DNA A garose gel elec
t rophoresis w as used to observe the cell apoptosis. Chromatometry w as used to detect the relat iv e act ivity
of caspases. Expr essions of p21, Hras, and bcr/ abl w ere analy zed by RTPCR. Results T oosendanin ex
t racts significant ly inhibited the grow th of K562 cells in a do set ime dependent manner, the IC50 o f 72 h
w as 20 nmo l/ L . T he K562 cells t reated w ith toosendanin ex t racts show ed morpho logical characterist ics of
apoptot ic cells. Cell cy cle and Annex in V / PI double labeling test indicated that toosendanin ex t racts
induced apopto sis o f K562 cells in a concentrat ion and t imedependent manner. The typical DNA ladder on
426 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
收稿日期: 20090721 基金项目:重庆市科委自然科学基金计划资助项目 ( CSTC, 2009BB5258)作者简介:刘小玲( 1978 # ) ,女,重庆人,硕士,研究方向为中药抗肿瘤的分子机制研究。
T el : 15086696914 Email: l yq253726575@ 126. com
* 通讯作者 何於娟 T el: ( 023) 68485216 Email: yjhemail@ 126. com