全 文 ：瘤细胞侵入机体时, 机体的细胞免疫是重要防御因
素。巨噬细胞的吞噬功能是衡量机体细胞免疫水平
的一个重要标志,是机体细胞免疫清除突变细胞、抑
瘤抗瘤的重要因素。T 淋巴细胞是介导机体细胞免
疫的免疫活性细胞, 在免疫应答全过程中起着重要
的调节、效应作用。但淋巴细胞只有转化为淋巴母
细胞才能发挥免疫调节作用, T 淋巴细胞转化率(增
殖指数)的高低直接反映机体细胞免疫的水平。NK
细胞是细胞免疫中的非特异性成分,不需预先活化
即可直接杀伤肿瘤细胞, 在机体肿瘤非特异免疫中
具有重要作用。TNF则具有直接抑制和杀伤肿
瘤细胞的功能, 且可诱导肿瘤细胞凋亡。因此,研究
上述 3种细胞的活性, 可较好地揭示机体细胞免疫
能力的变化。
在本实验中当小鼠接种了 H 22肿瘤细胞后, 胸
腺指数、脾脏指数、腹腔巨噬细胞的吞噬功能、脾淋
巴细胞的增殖指数均显著低于对照组小鼠。这是因
为小鼠接种肿瘤细胞后, 机体的免疫系统对外来抗
原物质出现应答,但是随着肿瘤的进行性生长,肿瘤
细胞不断的分泌免疫抑制因子, 抑制机体的免疫应
答。同时, 胸腺和脾脏等免疫器官呈现萎缩现象, 免
疫功能受到不同程度的抑制, 使肿瘤细胞能够逃避
机体免疫系统对其的杀伤作用, 有利于肿瘤的发生
和发展,并且随免疫抑制和器官萎缩程度、时间而逐
渐加剧,直至机体死亡。本实验中阳性对照物 CT X
在杀伤肿瘤细胞的同时, 对正常细胞也有很大的毒
性,使荷瘤机体整体免疫功能更加低下, 这将会对肿
瘤的后期治疗造成不利影响。而龙须菜藻红蛋白在
抑制 H 22肿瘤的同时,对荷瘤小鼠脾脏、胸腺具有保
护作用,能提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力,
对荷瘤小鼠脾淋巴细胞的增殖有显著促进作用, 甚
至可使 NK 细胞杀伤活性超过正常小鼠水平, 并能
提高荷瘤小鼠分泌 TN F的能力,增强机体对肿瘤
的杀伤力。本研究结果说明龙须菜藻红蛋白可通过
增强机体的细胞免疫活性和活化免疫细胞分泌细胞
因子而激发 NK 细胞、巨噬细胞或直接刺激巨噬细
胞活化,促进这些细胞对肿瘤细胞的杀伤作用, 这可
能是龙须菜藻红蛋白抗肿瘤效应机制之一。
据报道, 螺旋藻藻蓝蛋白能被肿瘤细胞选择性
吸收到细胞膜中 [ 14]。至于龙须菜藻红蛋白在小鼠
肠道中是否被水解,是以小肽或多肽形式, 还是以整
体分子被选择性吸收到细胞中发挥抑瘤作用和调节
细胞免疫功能,尚需进一步研究。
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藿香正气软胶囊提取物调节 DIBS模型鼠水液代谢的研究
吕 妍,金兆祥, 李 丹,唐 方*
(天津医科大学总医院 中医科, 天津 300052)
摘 要: 目的 探讨藿香正气软胶囊提取物对腹泻型肠易激综合征 ( DIBS) 模型大鼠水液代谢的影响。方法 以
1332 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
* 收稿日期: 20091230 基金项目:天津市科委科技创新专项基金项目 ( 07FDZDSH01001)基金项目:吕 妍( 1969 ! ) ,女,天津人,副主任医师,硕士,从事消化系统及变态反应的中医药治疗研究。
T el: ( 022) 60362617 60362435 Email: doctorydon gxiu@ 163. com
番泻叶 0 2 g/ mL ig 加四肢束缚应激 2 h,连续 6 d, 建立 DIBS 大鼠模型,采用考马斯亮蓝蛋白质测定法、酶联免
疫吸附法及高效液相色谱法测定 DIBS 模型大鼠肠黏膜 Na+ , K +ATP 酶活性和结肠组织水通道蛋白 4 ( AQP4)
水平变化,比较模型大鼠药物干预前后尿中乳果糖和甘露醇的量。结果 DIBS 模型大鼠小肠及结肠黏膜 Na+ ,
K+ AT P 酶活性较对照组显著降低 ( P< 0 01) ,结肠近端和远端组织内 AQP4 的表达明显减弱 ( P< 0 01) ,乳果
糖和甘露醇比值显著升高 (P< 0 01)。经藿香正气软胶囊提取物干预后, Na+ , K +AT P 酶活性、结肠组织近端和
远端 AQP4 的表达均明显提高 ( P< 0 05、0 01) ,乳果糖和甘露醇比值降低, 接近对照组水平 ( P < 0 01)。结论
藿香正气软胶囊提取物对 DIBS 模型大鼠水液代谢具有正向调节作用。
关键词:藿香正气软胶囊提取物; 腹泻型肠易激综合征; Na+ , K +ATP 酶; 水通道蛋白
中图分类号: R286 1 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 08133204
肠易激综合征 ( irritable bow el syndrome, IBS)
是较常见的消化系统疾病之一, 是一种具有特殊病
理生理基础的、独立的肠功能紊乱性疾病。本病主
要症状之一就是腹泻, 而诊断腹泻的标准是排便次
数增多、粪便稀薄、含水量增加。近年来研究发现,
位于上皮细胞基侧膜上的 Na+ , K+ AT P 酶通过促
进能量 A TP 利用, 调节 Na+ 、K + 分布而维持细胞
内外的水平衡。同时, 肠细胞质膜上还存在一种水
通道 ( Aquaporins, AQP) , 其形成小孔作为水通道
起作用[ 1]。其能显著增加水的通透性, 参与水的分
泌和吸收, 对保持细胞内外环境的稳态平衡起重要
作用[ 23] 。肠黏膜通透性的高低也是影响水代谢的
因素之一。藿香正气软胶囊提取物是从藿香正气软
胶囊中提取的, 藿香正气软胶囊目前广泛用于现代
医学的胃肠型感冒、急慢性肠炎等[ 45] 。本研究通过
测定腹泻型 IBS ( DIBS) 模型大鼠肠黏膜 Na+ ,
K+ AT P 酶的量和结肠组织 AQP4 水平以及比较
DIBS 模型大鼠药物干预前后尿中乳果糖 ( 4O
D吡喃半乳糖基D果糖) 和甘露醇的量, 来阐释藿
香正气软胶囊提取物参与 DIBS 模型大鼠水液代
谢的调节作用, 为藿香正气软胶囊的临床应用提供
理论依据。
1 材料
1 1 动物: SPF 级 Wistar 大鼠,体质量 ( 160 ∀ 10)
g,雌性,购于中国人民解放军军事医学科学院实验
动物中心, 许可证号 SCXK(军) 2002001, 实验大
鼠平衡饲养 3 d 后用于实验。
1 2 药物:番泻叶, 产地广西,由天津医科大学总医
院中药房提供; 藿香正气软胶囊提取物由中新药业
天津达仁堂制药厂提供。10%水合氯醛由天津医科
大学总医院制剂室提供。
1 3 试剂: Na+ , K + AT P 酶测定试剂盒、考马斯
亮蓝蛋白质测定试剂盒, 南京建成生物工程研究所
提供。水通道蛋白 4 ( AQP4) 酶联免疫吸附试剂
盒, ADL 公司生产。乳果糖、甘露醇对照品, Sigma
公司生产。甘露醇 (分析纯)、乙腈 (色谱纯)、甲醇
(色谱纯) 等均为国产试剂。实验用水为超纯水。
1 4 主要仪器: TU ! 1810 PC 型紫外可见分光光
度计, T L ! 18M 台式高速冷冻离心机, HZS ! H 水
浴振荡器, KHB ST ! 360酶标仪 (上海科学实验仪
器有限公司) , Ag ilent 1100 型高效液相色谱仪, 示
差检测器。
2 方法
2 1 药物制备:取番泻叶加水煮沸约 10 min,两层
纱布滤过,滤液浓缩得到含生药 0 2 g / mL 番泻叶
煎剂, 4 # 保存,临用前将药液温度升至室温。
2 2 分组与模型制备: 实验动物随机分为 3组, 每
组 8只,分别为对照组、模型组、藿香正气软胶囊提
取物组。对照组自由饮用蒸馏水,自由摄食,未做任
何处理。模型组及给药组参照文献方法[ 6]进行改良
造模:大鼠 ig 25 # 番泻叶水煎剂 2 mL, 5 min 后,
使用统一拉力强度橡皮筋 ( 5圈) ,将大鼠四肢末端
固定于 18 cm ∃ 25 cm 的木板上,大鼠仰面向上,使
其活动受限, 木板直立 90% 放置, 2 h 后解除束缚。
给药组于束缚应激结束后 ig 藿香正气软胶囊提取
物 536 mg/ kg (相当于成人临床剂量的 20 倍) , 1
次/ d,对照组与模型组 ig 同等剂量的蒸馏水。为消
除生物节律影响, 于每日同一时间进行应激 1次,连
续 6 d。
2 3 肠黏膜 Na+ , K + AT P 酶活性测定:末次给药
后禁食 12 h, 10% 水合氯醛 ip 麻醉大鼠, 剖开腹
腔,分别摘取幽门下 10 cm 处至回盲部的空肠、回
肠组织及回盲部下 10 cm 的结肠组织, 纵向剪开,
0 # 生理盐水清洁冲洗, 滤纸吸干水分, 载玻片
0 # 下刮取黏膜组织, 入冻存管内于液氮中保存,
移至 - 70 # 低温冰箱储存备用。取肠黏膜组织
200 mg,以冷生理盐水 0 # 下制成 1% 组织匀浆
液,严格按试剂盒说明书操作,用紫外可见分光光度
计于 636 nm 波长,以蒸馏水调零, 测定吸光度 ( A )
值。同时用考马斯亮蓝法进行组织匀浆蛋白定量,
并计算 Na+ , K + AT P 酶活力。
2 4 结肠及血清中 AQP4 水平的测定
1333 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
2 4 1 标本采集: 禁食 12 h 后, 10% 水合氯醛 ip
麻醉,剖开腹腔,分别剪取距回盲部、近直肠部结肠
组织 100 mg,纵向剪开, 0 # 生理盐水反复冲洗, 立
即放入冻存管内于液氮中保存, 储存于 - 70 # 低
温冰箱中备用。
2 4 2 组织匀浆制备:将蛋白酶抑制剂溶解于生理
盐水中, 配制成蛋白酶抑制剂 40 g/ mL 的混合溶
液,低温冷藏。取 100 mg 结肠组织加入该混合溶
液 2 mL, 4 # 条件下制成 10% 组织匀浆,在 4 #
低温离心机中离心 15 min ( 3 000 r/ min) ,提取组织
上清液待测。
2 4 3 血清制备: 模型制备结束, 各组大鼠禁食
12 h,经 10% 水合氯醛 ip 麻醉, 腹主动脉取血 2
mL, 4 # 静置 3 h, 4 # 、3 000 r/ min 离心 10 m in,
留取上清液。- 20 # 保存待测。
2 4 4 AQ P4 的测定: 使用 AQ P4 酶联免疫吸附
测试盒,在酶标仪 450 nm 波长处测定 A 值。
2 5 尿中乳果糖与甘露醇比值的测定
2 5 1 尿液收集:模型制备后 96 h 每只实验大鼠
ig 由乳果糖 100 mg、甘露醇 50 mg 加蒸馏水 2 mL
配制成的混合溶液, 2 h 后再 ig 蒸馏水 4 mL 以保
证充足的尿量。ig 前按压大鼠下腹部排空膀胱, 利
用代谢笼收集 ig 后 8 h 尿液,立即冰冻保存。收集
尿液期间禁食, 可自由饮水。
2 5 2 对照品溶液的配制:精密称取乳果糖及甘露
醇对照品各 100 mg, 分别置于 100 mL 量瓶中, 加
水溶解,稀释成含乳果糖及甘露醇对照品各 1 mg/
mL 储备液,于 4 # 冰箱保存。用时将储备液用流
动相稀释成所需质量浓度, 即得乳果糖及甘露醇工
作液。
2 5 3 色 谱 条 件: 色 谱 柱 Kromasil NH 2
( 250 mm ∃ 4. 6 mm, 5 m) , 柱温 30 # , 流动相为
乙腈水 ( 70& 30) , 体积流量为 1 mL/ min, 示差检
测器内加热 35 # ,进样量 10 L。
2 5 4 样品测定: 取大鼠尿液 0 4 mL 高速离心
( 4 000 r/ min) 5 m in,取上清液 0 25 mL 加入乙腈
1 mL, 漩涡混合器上混匀萃取 5 min, 高速离心
( 12 000 r/ m in) 10 min, 取上清进行色谱分析。记
录乳果糖及甘露醇的峰面积, 在标准曲线上求得样
品中乳果糖及甘露醇的质量浓度,计算乳果糖与甘
露醇质量浓度比值。
26 统计学处理: 采用 SPSS 13 0 软件对数据进行
统计分析,数据用 x ∀ s 表示,计数资料组间比较采用
单因素方差分析,组间两两比较采用 SNK 检验。
3 结果
3 1 肠黏膜 Na+ , K + AT P 酶活性的比较: 与对照
组比较, 模型组大鼠小肠黏膜、结肠黏膜的 N a+ ,
K + ATP 酶活性降低 ( P< 0 01) , 经藿香正气软胶
囊提取物干预后, 可以提高 DIBS 模型大鼠小肠黏
膜、结肠黏膜 Na+ , K + AT P 酶活性,与模型组比较
差异显著 ( P< 0 05、0 01)。结果见表 1。
表 1 藿香正气软胶囊提取物对 DIBS模型大鼠肠黏膜
Na+ , K+ATP 酶活性的影响 ( x∀ s, n= 8)
Table 1 Ef fect of Huoxiang Zhengqi Soft Capsula extract
on activity of Na+, and K+ ATPase in intestine
of DIBS model rats (x ∀ s, n= 8)
组别
剂量/
( mg kg- 1)
N a+ , K + ATP酶活性 / ( U mg- 1)
小肠 结肠
对照 - 1 807 26 ∀ 379 34 1 472 59 ∀ 292 74
模型 - 1 093 31 ∀ 296 01* * 932 43 ∀ 107 78* *
藿香正气软胶囊提取物 536 1 630 99 ∀ 395 28∋ 1 158 02 ∀ 129 21∋ ∋
与对照组比较: * * P< 0 01
与模型组比较: ∋P < 0 05 ∋ ∋P < 0 01 表 2同
* * P < 0 01 v s cont rol group
∋P < 0 05 ∋ ∋P< 0 01 v s cont rol g rou p Table 2 is same
3 2 结肠及血清中 AQP4 水平比较
3 2 1 结肠中 AQP4 水平比较:如表 2 所示,正常
大鼠结肠近端 AQ P4 水平较远端组织增强, 但二者
间未见统计学差异。DIBS 模型大鼠近端、远端结
肠 AQP4水平显著降低, 与对照组比较差异显著
( P< 0 01) ;藿香正气软胶囊提取物干预后, 近端、
远端结肠组织中 AQ P4 水平有所升高 ( P< 0 05、
0 01)。
3 2 2 血清中 AQP4 水平比较: 模型大鼠血清
AQP4水平明显升高,与对照组比较差异显著 ( P<
0 01) , 经藿香正气软胶囊提取物干预后, 血清
AQP4水平明显降低 ( P< 0 01)。见表 2。
表 2 藿香正气软胶囊提取物对 DIBS模型大鼠结肠、
血清 AQP4 水平的影响 (x ∀ s, n= 8)
Table 2 Ef fect of Huoxiang Zhengqi Soft Capsula extract
on level of serum AQP4 in colon of DIBS
model rats ( x∀ s, n= 8)
组别
剂量/
( mg kg- 1 )
AQP4/ ( ng mL- 1)
结肠近端 结肠远端 血清
对照 - 1 16 ∀ 0 22 1 08 ∀ 0 17 1 22 ∀ 0 33
模型 - 0 77 ∀ 0 14* * 0 79 ∀ 0 12* * 5 46 ∀ 0 60* *
藿香正气软胶囊提取物 536 1 04 ∀ 0 13∋ ∋ 0 95 ∀ 0 14∋ 1 33 ∀ 0 51∋ ∋
3 3 大鼠尿液乳果糖/甘露醇值比较: 经 HPLC 法
对尿液中乳果糖、甘露醇测定发现,模型组乳果糖/甘
露醇值为 16 50 ∀ 334, 明显高于对照组 ( 2 24 ∀
0 83, P< 001) ,藿香正气软胶囊提取物可显著降低
1334 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
尿液中乳果糖/甘露醇值, 降至 236 ∀ 0 97 ( P<
001)。
4 讨论
水在胃肠道内的吸收多继发于电解质主动转运
所产生的静水压和渗透压, 水在小肠内吸收还有一
种快速的细胞旁途径。由 Na+ , K+ AT P 酶作用所
产生的离子梯度是其他离子和营养物质跨膜转运的
驱动力。N a+ , K + AT P 酶(又称钠泵)是一种膜转
运蛋白[ 7] ,它从水解 AT P 获得能量, 逆化学梯度转
运 Na+ ,同时反方向转运 K + , 形成和维持了 Na+ 、
K
+ 在细胞膜内外正常的浓度差。保持此酶活性正
常,能产生并维持可兴奋细胞的膜电位, 以维持神经
细胞的兴奋性和传导性[ 8] 。Na+ , K + ATP 酶通过
促进能量 AT P 利用, 调节 Na+ 、K + 分布而维持细
胞内外的水平衡。
水的转运除以顺浓度梯度扩散外, 还可依靠水
通道蛋白 ( AQPs) 主动转运完成。AQ Ps是生物膜
上特异性转运水的整合蛋白[ 9] , 与水代谢密切相关,
结肠中的 AQP4 参与结肠对肠腔内水分的吸收,
AQP4 在结肠的高表达与肠道水吸收有关[ 10] 。如
果 AQP4 的表达超过或低于正常水平, 就会影响水
的分泌或吸收, 出现水平衡紊乱,引发排便异常。
肠黏膜通透性是指某一特定物质在肠黏膜表面
通过非易化扩散方式渗透的能力。一般以单位时间
内某种物质(如糖分子)从肠腔吸收入血并从尿液排
出的量来表示肠通透性。肠黏膜通透性增高可以反
映早期肠黏膜屏障的损伤。本实验通过测定尿液中
乳果糖/甘露醇的值来反映肠黏膜通透性的改变。
中医治疗泄泻是以健运脾胃, 分利水湿为基本
原则。但健运脾胃并非单纯补脾。而是意在恢复脾
胃运化水谷、运化水液的功能。所以凡能祛除影响
脾胃运化之邪, 有助于脾胃功能恢复的治疗法则均
可称之为健脾, 包括消积、芳香、清热、疏肝、补益、温
中、涩敛等。同样祛湿并非仅指淡渗利湿,通过利小
便而实大便,芳香化湿、苦温燥湿、辛散除湿均属于
利湿范畴。藿香正气复方是芳香化湿的代表方剂,
重在芳香化浊, 化湿和胃,来恢复脾胃运化及小肠泌
别清浊的功能。本研究结果显示, DIBS 模型大鼠
小肠及结肠黏膜 Na+ , K + ATP 酶活性较对照组显
著降低,结肠近端和远端组织内 AQP4 的表达明显
减弱,大鼠尿乳果糖/甘露醇值显著升高。经藿香正
气软胶囊提取物干预后, Na+ , K+ AT P 酶活性、结
肠组织近端和远端 AQ P4 的表达均有所改善,同时
还可显著降低 DIBS 模型大鼠尿液中乳果糖/甘露
醇值。表明藿香正气软胶囊提取物对 DIBS 的止
泻功效主要通过调整 DIBS 模型大鼠 Na+ , K +
AT P 酶活性,提高结肠组织 AQ P4 的表达, 改善肠
黏膜通透性, 保护肠机械屏障来完成正向调节肠道
水液代谢作用。
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