全 文 ：01213 ? 01 025、01411 ? 01 054、01289 ? 01 032 和
01183 ? 01015、01 281 ? 01 021、01 245 ? 01018, 药物处
理组与对照组比较差异显著 ( P< 0105) ,其中 50 Lg/
mL 菱角提取物引起 Caspase-3、9 的活化程度最高。
3 讨论
菱角是我国南北均有分布的药用植物, 在民间
广泛用于治疗肝腹水、肝癌等,是对肿瘤有治疗和辅
助治疗作用的药物。前期研究表明菱角提取物含有
3, 4, 5-三羟基苯甲酸在内的多种活性物质, 对肿瘤
细胞具有较强的抑制作用。本实验表明菱角提取物
能抑制 HL-60 细胞增殖,并呈量效和时效关系。通
过对 HL-60细胞的形态学观察,发现细胞在不同浓
度的菱角提取物作用下表现出一系列凋亡形态特征
变化,如细胞核固缩、边缘化、凋亡小体形成等,结合
DNA 电泳呈现的典型梯状条带, 表明菱角提取物
能诱导 HL-60 细胞凋亡。通过流式细胞仪定量显
示细胞凋亡率。通过流式细胞仪定量显示细胞凋亡
率,菱角提取物在 25、50、100 Lg / mL 质量浓度下诱
导 HL-60 细胞凋亡呈浓度依赖性, 凋亡率分别为
( 71 54 ? 01 98) %、( 161 25 ? 31 13) % 和 ( 271 56 ?
41 87) %。
细胞凋亡是由基因调控的细胞主动死亡过程,
线粒体依赖性细胞凋亡通路是抗肿瘤药的诱导细胞
凋亡的核心通路 [ 4]。在凋亡诱导信号的作用下, 线
粒体膜通透性转运通道 ( m ito chondrial membrane
permeability t ransit io n po re, MMPT ) 开放, 或者
线粒体肿胀,导致线粒体膜电位下降,释放的细胞色
素 C与凋亡蛋白酶激活因子-1 ( apoptot ic protease
act ivating factor-1, Apaf-1) 和 Caspase-9形成复合
体,激活 Caspase 级联反应,导致细胞凋亡 [ 5]。
Hengarther 等[ 6] 研究认为线粒体膜电位的丧
失是诱导细胞凋亡的重要途径。本研究结果表明:
菱角提取物作用 HL-60 细胞 48 h 后, 弱荧光细胞
明显增多, 呈剂量依赖性。100 Lg/ mL 菱角提取物
作用 48 h 弱荧光细胞比率达到了 ( 851 25 ?
101 6) % ,提示线粒体功能已经严重受损。Caspase-
9 是线粒体凋亡途径的关键蛋白酶, 处于 Caspase
/瀑布式0激活的顶端; Caspase-3是细胞凋亡的主要
执行者,通过特异性地裂解一套底物而导致细胞凋
亡。实验结果表明, 不同浓度菱角提取物作用 48
h, Csapases-9、3 蛋白活性显著增加。
综上所述, 菱角提取物可诱导 HL-60 细胞凋
亡,其在诱导细胞凋亡过程中细胞线粒体膜电位下
降,并激活 Caspase-9、3。这些结果表明菱角提取物
可能通过线粒体信号传导通路诱导 HL-60 细胞凋
亡。但是,由于细胞凋亡是一个多系统参与、多阶段
的复杂生化反应, 菱角提取物诱导肿瘤细胞凋亡的
机制有待于进一步深入研究。
参考文献:
[ 1] Niu F L, Wang X D, Wan g Y L, et al . T rihydroxyb enzoic
acid dimer-indu ced apoptosis ef fect in v i tr o [ J]1 Chem R es
Chin U. , 2005, 21( 4) : 463-4671
[ 2] 吴国东, 周惠君1 青蒿琥酯诱导人脐静脉内皮细胞凋亡 [ J ]1
中国药理学与毒理学杂志, 2004, 18( 4) : 294- 2991
[ 3] 唐旭东, 周克元, 侯 敢, 等 1 白藜芦醇诱导鼻咽癌细胞
CNE- 2Z 凋亡的线粒体机制 [ J]1 中国药理学与毒理学杂志,
2004, 18( 3) : 171-1771
[ 4] Got t lieb R A. Mitoch on drial execut ion cent ral [ J]1 Febs L et ,
2000, 482( 1-2) : 6-121
[ 5] Evan G, Lit tl ew ood T1 A mat ter of lif e and cel l death [ J ]1
S cience, 1998, 282( 5381) : 1317-13221
[ 6] H engartner M O1 T he biochem ist ry of apoptos is [ J]1 N a-
ture, 2000, 407( 12) : 770- 7761
藿香正气提取物对腹泻型肠易激综合征大鼠免疫功能的调节作用
李 丹,吕 妍,唐 方*
(天津医科大学总医院 中医科, 天津 300052)
摘 要:目的 研究藿香正气提取物调节腹泻型肠易激综合征 ( IBS) 大鼠免疫功能机制。方法 30 只 Wistar 大
鼠随机分成 3 组:对照组、模型组和藿香正气提取物组,对照组未作任何处理, 余两组采用番泻叶水煎剂 ig 给药联
合肢体束缚应激的方法制备 IBS 模型。模型组大鼠给予高压灭菌蒸馏水, 藿香正气提取物组 ig 给予藿香正气提
取物,连续 6 d。通过放免法和酶联免疫吸附法测定各组大鼠 P 物质 ( SP)、白细胞介素-1B( IL-1B)、IL-2 的水平。
结果 模型组大鼠胸腺、脾脏指数、IL-2 水平下降, IL-1B、SP 水平显著升高,与对照组相比具有统计学差异 ( P <
#440# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 3 期 2009 年 3 月
* 收稿日期: 2008- 11-20作者简介:李 丹,硕士。E- mail : ech012 22@ 163. com
01 05) ;藿香正气提取物可改善模型大鼠的胸腺、脾脏指数, 调节 IL-1B、IL-2 和 SP 水平,与模型组相比较具有显著
差异 (P< 01 05)。结论 IBS 模型大鼠存在免疫器官萎缩, SP、IL-1B水平升高, IL-2 水平降低的病理状态,藿香正
气提取物可调控模型大鼠紊乱的激素水平,达到调节免疫功能的治疗目的。
关键词:藿香正气提取物; 腹泻型肠易激综合征; 免疫功能
中图分类号: R2851 5 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2009) 03-0440-03
肠易激综合征 ( irritable bow el syndrome,
IBS) 为消化道最常见的功能性疾病之一, 其主要症
状为腹部不适和 (或) 疼痛及慢性间歇性排便习惯
和大便性状的改变,有时伴随机体其他各系统变化
多样的一系列症状,而缺乏形态学和生化学的异常
改变。IBS 的病因至今尚未完全明了, 可能与心理、
精神、感染等因素有关。部分 IBS 患者肠黏膜中炎
性介质的表达增高 [ 1]。尽管 IBS 并不被人们认为
是一种炎症性疾病, 但常常可以在 IBS 患者的结肠
黏膜组织学研究中发现一些中度非特异性炎症改
变[ 2]。为了研究藿香正气对 IBS 的治疗作用并探
讨其作用机制, 本研究复制 IBS 大鼠模型, 观察藿
香正气提取物对大鼠免疫器官指数、免疫因子的影
响,探讨其调节免疫功能的作用机制,为其临床应用
提供实验依据。
1 材料
11 1 动物:清洁级 Wistar 大鼠 30 只, 平均体质量
( 160 ? 10) g ,雌性,购于军事医学科学院实验动物
中心,许可证号 SSXK-(军) 2002-001。实验大鼠适
应性平衡饲养 3 d 后用于实验。
11 2 药物:藿香正气提取物, 由中新药业天津达仁
堂制药厂提供, 质量浓度为 531 6 mg / mL; 番泻叶水
煎剂,由天津医科大学总医院中药房提供,质量浓度
为 01 2 g/ mL。
11 3 主要试剂和仪器:大鼠白细胞介素-1B( IL-1B)
酶联免疫吸附测试盒、大鼠 IL-2酶联免疫吸附测试
盒,美国 ADL 公司; P 物质 ( SP) 放免试剂盒,北京
普尔伟业生物科技有限公司。放射免疫 C计数器,
中国科大中佳公司; KHB, ST ) 360 酶标仪,上海科
学实验仪器有限公司; TL ) 18M 台式高速冷冻离
心机,上海;恒温振荡水浴箱, 上海;电子天平,日本。
2 方法
21 1 动物分组及模型建立:大鼠随机分为对照组、
模型组、藿香正气提取物组,每组 10只。模型建立
参照文献方法[ 3, 4] 略做改变,模型组、藿香正气组动
物分别 ig 予以 01 2 g / mL 番泻叶煎剂 (参照前期实
验结果按 1 mL/ 100 g ) , 1 次/ d, ig 完番泻叶煎剂 1
h 后, 使用统一拉力强度橡皮筋 ( 300 g, 相当环绕 5
圈) , 将大鼠四肢末端固定于 18 cm @ 25 cm 的木板
上,直立放置,使之不能活动,烦躁不安,造成一定应
激刺激,持续 2 h,连续 6 d。
21 2 各组用药:对照组和模型组每日予以高压灭菌
消毒饮用水 ig 1 mL/ 100 g ,藿香正气组于束缚应激
结束后 ig 给予 536 mg / kg 藿香正气提取物溶液, 1
次/ d, 连续 6 d。
21 3 检测指标
21 31 1 脏器指数的测定:剖开胸腹腔,摘取胸腺、脾
脏,滤纸拭去血迹,电子天平称质量, 计算胸腺指数
和脾脏指数。
21 31 2 血清和结肠黏膜匀浆制备: 腹主动脉取血 2
mL,静置 3~ 4 h, 4 e 、3 000 r/ min 离心 10 m in,分
离血清。- 20 e 保存待测。剖开腹腔摘取近端结
肠组织 100 mg,纵行剖开, 4 e 生理盐水冲洗, 滤纸
吸干,尽快加入 1 mL 生理盐水碾磨, 制成 10% 的
组织匀浆, 4 e 、3 000 r/ min 离心 15 min, 弃去沉
淀,取上清液, - 20 e 保存待测。
21 31 3 SP、IL-1B、IL-2测定:严格按照试剂盒说明
书操作测定。
21 4 统计学处理:采用 SPSS 131 0 统计软件,实验
数据以 x ? s 表示,多组间样本均数比较采用方差
分析。
3 结果
31 1 各组脏器指数比较: 大鼠造模后性情改变, 急
躁易怒;毛色失去光亮, 晦暗无光泽, 鼠毛竖起易脱
落,与对照组比较,脾脏指数下降 ( P< 01 05) ,胸腺
明显萎缩 ( P< 01 01) ; 藿香正气组大鼠性情较温和,
脾脏指数、胸腺指数均接近正常水平 ( P> 01 05) ,见
表 1。
表 1 各组脏器指数比较 ( x ? s, n= 10 )
Table 1 Comparison of organ index among groups
( x? s, n= 10 )
组 别 脾脏指数/ % 胸腺指数/ %
对照 0133 ? 01 03 01 24 ? 01 03
模型 0127 ? 01 06* 01 15 ? 01 02* *
藿香正气 0132 ? 01 03 v 01 22 ? 01 03 v v
与对照组比较: * P < 01 05 * * P < 01 01
与模型组比较: v P < 01 05 v v P < 01 01
* P < 01 05 * * P< 01 01 v s cont rol g rou p
v P < 01 05 v v P< 01 01 v s m odel group
#441#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 3 期 2009 年 3 月
31 2 各组 IL-1B水平比较: 模型组血清 IL-1B水平
显著高于对照组 ( P< 01 01) , 藿香正气提取物可以
有效降低升高的 IL-1B水平 ( P< 01 05) ,见表 2。
31 3 各组 IL-2 水平比较:如表 2所示,模型组大鼠
血清中 IL-2水平低于对照组,具有显著统计学差异
( P< 01 01) ;藿香正气提取物可有效改善 IL-2 水平
( P< 01 01)。
31 4 各组 SP 水平比较: 模型组结肠匀浆 SP 水平
较对照组显著升高 ( P< 01 01) ; 藿香正气提取物可
改善高水平的 SP,具有统计学差异 ( P< 01 05) , 见
表 2。
表 2 各组大鼠血清 IL-1B、IL-2 水平和结肠
匀浆中 SP 水平比较 (x ? s, n= 10 )
Table 2 Comparison of IL-1B and IL-2 level in serum
and SP level in colon homogenate of rats
among groups ( x? s, n= 10)
组 别 IL-1B/ ( ng# mL- 1 ) IL-2/ ( ng # mL - 1) SP/ ( pg# mL - 1 )
对照 1961 80 ? 221 48 7331 87? 1191 25 3671 61? 811 76
模型 2281 08 ? 251 02* * 5851 37? 691 51* * 9301 57? 1111 85* *
藿香正气 2031 28 ? 201 34v 6491 95? 1041 58 5041 26? 211 06v
与对照组比较: * * P < 01 01; 与模型组比较: v P< 01 05
* * P< 01 01 v s cont rol gr ou p; v P< 01 05 v s m odel group
4 讨论
IBS 的患病率为女性大于男性, 雌激素及其受
体在 IBS 的发病过程中起着重要的作用。因此为
了更能贴近人类 IBS 发病特点,本实验选取成年雌
性大鼠为研究对象,并对文献报道的模型制备方法
进行改良,降低致泻因素的作用,加大应激强度, 突出
精神因素的作用。鉴于较长的实验周期中高强度的
应激会造成大鼠应激性溃疡等病理性改变,有悖于
IBS 无明显器质性改变的特点,故缩短造模时间。
尽管 IBS 并不被人们认为是一种炎症性疾病,
但常常可以在 IBS 患者的结肠黏膜组织学研究中
发现一些轻中度非特异性炎症改变 [ 2, 5] , 提示 IBS
与免疫功能紊乱有关系。可能与神经内分泌系统紊
乱加重脑-肠轴对胃肠功能调节失衡,从而影响神经
免疫通路有关 [ 6]。胸腺和脾脏是重要的免疫器官,
不但可以产生 T、B细胞,还是进行免疫活动的重要
场所。本实验结果显示 IBS 大鼠存在免疫功能低
下的表现,提示应激能够抑制机体免疫功能, 与文献
报道[ 7] 相符。IL-1B是单核-巨噬细胞合成与分泌的
一种多肽,可在中枢内通过不同环节对免疫系统功
能起重要调节作用,是神经系统与免疫系统之间的
一种重要的中介物质, 可以诱发炎症反应。本实验
中模型组大鼠血清中 IL-1B水平较对照组显著升
高,与国内学者研究结果一致[ 8]。推测高水平的
IL-1B在 IBS 动物模型轻微炎症发生发展过程中起
到重要的促进作用。IL-2 是由 TH1 细胞和巨噬细
胞分泌的,具有调节机体免疫、增加机体抗感染的能
力,在应激状态下促进 NK 细胞的杀伤力, 提高免
疫应激能力,在一定程度上介导炎症细胞的浸润、趋
化及吞噬作用,促进修复细胞的增殖分化,产生免疫
效应[ 9]。本实验应用番泻叶 ig 联合肢体束缚应激
的方法制备 IBS 模型, 结果显示模型组血清中 IL-2
水平明显低于对照组。SP 广泛分布于神经系统和
胃肠系统的肠肌间神经丛和黏膜下神经丛,能够以
神经分泌的方法作用于各种免疫细胞, 参与免疫调
节促进免疫功能。本实验中,模型组大鼠表现的肠
道低水平炎症以及黏液分泌增多, 可能与其结肠组
织中较高的 SP 水平密切相关。用药后, SP 水平降
低,提示藿香正气提取物可能通过降低 SP 水平,发
挥其对 IBS 大鼠的免疫调节作用。
本研究结果显示芳香醒脾代表方药藿香正气能
有效抑制模型大鼠免疫器官的萎缩, 提高脏器指数,
抑制外周促炎因子 IL-1B、SP 水平, 提高抑炎因子
IL-2 的量,调节促炎与抑炎因子平衡, 从而发挥其
对免疫功能的调节作用。
参考文献:
[ 1] Neal K R, Hebden J, S piller R1 Prevalence of gast rointes t-i
nal symptoms six m on ths af ter bacterial gast roenterit is an d
risk factors for developmen t of the ir ritable bow el syndrome:
postal s urvey of pat ients [ J]1 BMJ , 1997, 314: 779-7821
[ 2] Gw ee K A, Collins S M , M arshal l J S, e t al . Evidence of in-
flamm atory pathogen esis in post in fect ious ir ritable bow el syn-
drome [ J]1 Gast roente rolog y, 1998, 114: A9301
[ 3] 徐海珍, 谢建群1 腹泻型肠易激综合征大鼠结肠粘膜炎性细
胞因子的表达及温中健脾方对其影响的研究 [ J]1 上海中医
药杂志, 2007, 41( 6) : 69-721
[ 4] 李冬华, 李春淼, 李伍善, 等1 痛泻要方对肠易激综合征模
型大鼠血管活性肠肽的影响 [ J]1 时珍国医药, 2007, 18
( 9) : 2098-20991
[ 5] Chadw ick V S , Ch en W, Shu D, et al . Act ivat ion of the mu-
cosal immun e sys tem in irrit able bow el syndrome [ J]1 Gas-
t roenterolog y, 2002, 122: 1778-17831
[ 6] 金杭斌1 神经-免疫-内分泌网络与肠易激综合征 [ J]1 国际
消化病杂志, 2006, 26( 1) : 40-431
[ 7] 鲁 洪, 宋德懋, 冯 娟, 等1 束缚应激上调小鼠脾脏淋巴
细胞钾离子通道 ( Kv1. 3) 的表达 [ J]1 中国神经免疫学和神
经病学杂志, 2006, 13( 2) : 113-1161
[ 8] 陈 浩, 柯美云1 肠易激综合征与炎症关系的研究现状 [ J ]1
国际消化病杂志, 2007, 27( 3) : 172- 1771
[ 9] 罗慈伟, 卓蕴雄, 欧阳可鉴1 脑外伤 SIRS 患者外周血中 IL-
2, IL-6 的临床观察 [ J]1 中国临床神经外科杂志, 2006, 11
( 1) : 34-351
#442# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 3 期 2009 年 3 月