全 文 ：
制剂与质量

基于微量量热法检测注射用双黄连冻干粉针质量波动性的研究
张雅铭1, 2 , 鄢
丹2* ,张
萍2 ,任永申2 ,张少峰2 ,冯
雪2 ,肖小河2*
( 1
军事医学科学院毒物药物研究所, 北京
100850; 2
中国人民解放军第 302 医院 全军中药研究所, 北京
100039)
摘
要:目的
从生物检定角度, 探索并建立表征注射用双黄连冻干粉针质量波动性的方法。方法
采用微量量
热法,建立基于痢疾杆菌的注射用双黄连冻干粉针质量波动评价方法,制备避光室温、高温( 60
)及光照( 4 500

500) lx 样品 S1~ S9。以生物热活性图谱的相似度和微量量热学参数如指数生长期速率常数( k1 ) , 最大发热功率
( P1 )、达峰时间( T 1 )、发热量(Q1 ) ,稳定期最大发热功率( P2 )、达峰时间(T 2)、发热量( Q2 )为评价指标, 进行定性定
量分析, 以生物热活性图谱相似度 S、参数 T
m、P
m 为指标进行聚类分析。结果
相似度分析结果显示, 与避光
室温( 22
)样品 S1~ S4 相比,光照( 4 500
500) lx 样品 S7~ S9 相似度较高( R> 0
85) ,而高温( 60
)样品 S5~
S6 的生物热活性图谱相似度较低( R
0
700)。结论
以相似度及微量量热学特征参数定性定量表征不同样品的
抑菌活性 ,所建立的生物热活性图谱全面反映模型生物的热生物学信息,提供了专属性较强的二维信息, 可作为化
学指纹图谱的有益补充,可以用于注射用双黄连冻干粉针的质量波动性检测。
关键词:注射用双黄连冻干粉针; 微量量热法;痢疾杆菌; 生物热活性图谱; 质量波动
中图分类号: R286
02


文献标识码: A


文章编号: 0253-2670( 2010) 07-1084-04
Investigation on quality fluctuation of Shuanghuanglian Freeze-dried Powder
used for Injection by microcalorimetry
ZHANG Ya-ming1, 2 , YAN Dan2 , ZHANG Ping 2 , REN Yong-shen2 , ZHANG Shao- feng2 ,
FENG Xue2 , XIAO Xiao-he2
( 1
Institute of T ox icolog y and Pharmacolog y, The Academ y of M ilitary Medica l Sciences, Beijing 100850, China;
2
China M ilitary Institut e o f Chinese Mater ia Medica, 302 M ilitary Hospital o f China, Beijing 100039, China)
Abstract: Objective
T o prov ide the methods for quality f luctuat ion of Shuanghuang lian Freeze-dried
Powder for Inject ion ( SFPI) including bioassay method
Methods
Biolog ical prof iles o f SFPI on Shig el la
dy senter iae had been established by microcalo rimetry
Samples 1
4 w ere kept at ro om temperature; Sam-
ples 5
6 w ere kept at storage at 60
; Samples 7
9 w ere kept under the condit ion of illuminat ion inten-
sity ( 4 500
500) lx . A ll samples w er e analyzed qualitat ively and quant itat iv ely by similarity values of
biolo gical prof iles and thermodynamics par ameters, such as T 1m, P1m , Q1 , k1 , T 2m , and I
The no rmal sam-
ples and special samples could be dist inguished by cluster analy sis w ith similar values ( S) , the main ther-
mal act ivity par ameters ( T 1m , P1m )
Results
Compared w ith samples 1
4, the similarity tendency of sam-
ples 7
9 w as similar, w hile similar v alues o f S5
S6 w as less than or equal to 0
700
Conclusion
All the
results show that the biot ic thermal act ivity o f differ ent samples could be evaluated qualitat ively and quan-
t itatively by sim ilar ity values of bio logical pro files and thermodynamics parameters
In conclusion, charac-
terized by tw o- dimension, micr ocalor imetry could supply thermogr ams as biolog ical pr ofiles character ized
to describe the bio act iv ity of drugs, w hich w ere benef icial supplement to chemical analysis. Bio logical pro-
f iles ar e proposed as an eff icient st rateg y for quality f luctuat ion of SFPIs

Key words: Shuanghuangl ian Fr eeze-dried Powder for Inject ion ( SFPI) ; m icrocalorimetry; Shig el la
dy senter iae; biological pr ofile; quality fluctuat ion

1084
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
* 收稿日期: 2009- 12-03





















基金项目:国家重大新药创制科技重大专项( 2009ZX09502-003, 2009ZX09502-022) ;国家自然科学基金资助项目( 30701109)作者简介:张雅铭( 1978
) ,女,山西平定人,主管药师,药剂学博士, 2007年获军事医学科学院药物分析学硕士学位,研究方向为中药制剂及质量控制。T el: ( 010) 66933324
E-mail: yam ing_52@ 126
com
* 通讯作者
肖小河
T el: ( 010) 66933322
E-mail: pharmacy302@ 126
com鄢
丹
T el: ( 010) 66933325
E-mail: yd277@ 126
com


中药注射剂是我国独创的中药新剂型, 在抢救
危重症过程中发挥着其他剂型难以替代的独特作
用,近年来不良反应报道较多,原因可以概括为两个
方面:一是临床合理用药问题;二是产品质量问题。
从生产质控环节入手保证中药注射剂质量的均一
性,减少不良反应发生。目前常规的分析方法中, 化
学指纹图谱通过对指纹图谱各色谱峰峰形、保留时
间、峰面积及相似度的描述, 反映了样品整体化学
组分的波动,与生物活性(尤其是不良生物活性)之
间不一定有直接的量效关系, 难以评价中药注射剂
疗效的大小,所以笔者建立生物活性检测方法,以弥
补目前检验指标仅仅能控制已知成分的不足, 从生
物活性角度控制药品的质量[ 1, 2] 。本实验以注射用
双黄连冻干粉针为模式药, 它是由金银花、黄芩、连
翘精制而成,是
中国药典
2005年版的一种静脉给
药中药粉针剂, 具有良好的抗菌、抗病毒、抗炎解热
的功效,尤其对金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、痢疾杆
菌等均有抑制作用。近年来不良反应报道较多, 以
呼吸系统、全身性损害为主,严重影响其临床的进一
步应用,所以对其进行质量控制和安全性评价非常
重要。本实验在现有中药注射剂质控方法基础上,
结合前期研究[ 3, 4] , 将微量量热法引入中药注射剂
生物检测评价体系。与管碟法相比,基于微量量热
法的生物热活性图谱, 不仅能够提供重要的微量量
热学参数定量的表征其质量, 其本身的
热-时
效应
曲线提供了专属性较强的二维特征图谱, 还可以作
为表征样品抑菌活性的
指纹图谱
,为该方法能够
提供全面的信息 [ 5, 6]。
1
仪器与材料
TAM
12 通道毫瓦级热导式量热仪(瑞典
Thermometric AB ) , 实验时系统控温 37
, YX-
Q LS
B全自动立式电热蒸汽灭菌器(上海降拓仪
器设备有限公司)。
痢疾杆菌 Shigella dy senter iae CMCC B51252
菌株由中国药品生物制品检定所提供。Luria-Ber-
tani培养基: 取蛋白胨 10
0 g, 酵母膏 5
0 g, N aCl
5
0 g, 加蒸馏水 1 000 mL 使溶解, 调pH7
0~ 7
2,
121
灭菌 30 min,置 4
冰箱中保存备用。注射
用双黄连冻干粉针购于哈尔滨中药二厂,样品批号:
S1 ( 0802101)、S2 ( 0805108 )、S3 ( 0802109 )、S4
( 0802112 )、S5 ( 0802101 )、S6 ( 0805108 )、S7
( 0802101)、S8( 0805108)、S9( 0802112) , 其中样品
S1~ S4、S5~ S6 及 S7~ S9 分别于避光室温、高温
( 60
)及光照( 4 500
500) lx 条件放置 10 d。
2
方法与结果
2
1
测定方法:在恒温 37
无菌条件下, 采用微量
量热仪的安瓿法测定,先将痢疾杆菌接种到蛋白胨培
养基中形成悬浮液(细胞浓度 1
106 cells/ mL) ,分别
与用灭菌水配制不同浓度的注射用双黄连(冻干)供
试品溶液混合, 一并加入安瓿瓶中,加盖瓶塞、密封,
放入微量量热仪中跟踪记录痢疾杆菌生长代谢的生
物热活性图谱, 当曲线重新返回基线时停止[ 7] , 通过
Origin 软件作图并提取微量量热学参数。
2
2
痢疾杆菌的生长热谱曲线:在密闭的安瓿瓶中
营养物和氧的供给是有限的, 结合微生物生长代谢
的一般规律, 痢疾杆菌的生长代谢的热谱曲线分为
4个期: 指数生长期 ( A-B)、停滞期 ( B- C)、稳定期
( C-D)、衰亡期( D-E ) [ 8]。以达峰时间 ( T )、发热功
率( P)、指数生长期生长速率常数 ( k )和总发热量
(Q t)等参数对其进行分析, 37
下安瓿法测定的痢
疾杆菌在未加药时生长代谢的热谱曲线见图 1。
图 1
痢疾杆菌的生长热谱曲线
Fig. 1
P-t Growth curve of S
dy senteriae


峰
、
的达峰时间和发热功率分别为( T 1m,
P
1
m)和( T 2m, P2m )。基于细菌细胞的多种热动力学模
型中以指数模型最为常用[ 9] , 指数模型认为在细菌
细胞的生长过程中的指数生长期有:
Pm= P 0exp( k t)或 lnPm = lnP0+ kt 公式( 1)
Pm 为生物热活性图谱中指数生长期内 t 时刻的输出热功率


将图谱的两个指数生长期 Pm、t 值代入公式
( 1)中, 进行线性拟合可得痢疾杆菌的指数生长期和
稳定期生长速率常数 k1 和 k2 值; 对图谱积分可以
求得曲线下面积即得总发热量( Qt) ; 从图谱上可以
直接读取指数生长期的最大发热功率( P1m )及达峰
时间( T 1m)和稳定期的最大发热功率( P2m )及达峰时
间( T 2m )。这些微量量热学参数均可反映样品的抑
菌活性。经计算, 未经药物干预时痢疾杆菌生长代
谢的指数生长期生长速率常数 k1 = ( 1
306

0
005) h- 1 , RSD 为 0
956% ( n= 5) ,说明实验结果

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中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
具有良好的重现性。
2
3
注射用双黄连冻干粉针作用于痢疾杆菌的量-
效关系考察: S1样品 5个浓度梯度的抑菌活性考察
结果见图 2。
图 2
不同浓度注射用双黄连冻干粉针的痢疾杆菌生长
热谱图
Fig. 2
P-t Growth curves of S. dy senteriae with dif ferent
concentations of SFPI


由微量量热学参数分析, 随着供试品溶液浓度
增加,抑菌作用增强,其表现为:相对于空白对照, 痢
疾杆菌生长曲线整体呈
下降、后延
趋势;细菌指数
生长期( P 1m)、( k1)、指数生长期发热量( Q1)、稳定期
( P
2
m )、稳定期生长速率常数( k2 ) 和稳定期发热量
(Q2)、(Qt)均相应减小,指数生长期( T 1m )、( T 2m ) , 且
均与剂量呈较好的线性关系 ( r 分别为 0
991、
0
982、0
939、0
941、0
854、0
927、0
927、0
998、
0
997)。
图2显示痢疾杆菌受药物作用下的生长状况与
指数生长期 T 1m 相关性最显著,可作为评价供试品溶
液抑菌活性强弱的客观指标,因此选择 T 1m 计算 I 为
注射用双黄连冻干粉针作用于痢疾杆菌生长代谢量
效关系的评价指标,按公式(2)进行计算,并且 I 与剂
量的量效关系重现性、稳定性均较好( r= 0
998)。


I= ( T 1m- T 10 ) / T 10
100% 公式( 2)
式中 T 10 为未经药物干预时痢疾杆菌生长代谢的指数生长
期的达峰时间, T 1m 为药物干预时痢疾杆菌生长代谢的指数
生长期的达峰时间
2
4
不同注射用双黄连冻干粉针样品生物热活性
图谱相似度分析
2
4
1
相似度分析:在以上系列浓度中, 选择合适
测试浓度,测定了注射用双黄连冻干粉针作用于痢
疾杆菌的生长曲线。采用向量余角法对不同样品生
物热活性图谱进行相似度分析, 确认了 3 个共有峰
a、b、c, 结果见表 1、图 3。
表 1
不同样品生物热活性图谱相似度结果
Table 1
Similarity values of biological profiles of S1
S9
编号 相似度 编号 相似度
S1 0
926 S6 0
695
S2 0
923 S7 0
895
S3 0
948 S8 0
894
S4 0
948 S9 0
892
S5 0
700
图 3
注射用双黄连冻干粉针相似度分析
Fig. 3
Similarity analysis of SFPI
2
4
2
微量量热学参数分析:提取注射用双黄连冻
干粉针各样品微量量热学参数见表 2。
表 2
注射用双黄连冻干粉针生物热活性图谱微量量热学参数及其抑制率( n= 3)
Table 2
Biothermodynamic parameters of SFPI on S. dy senteriae and their inhibitory rates (n= 3)
样品 T1m / s P1m /
W K 1 / h- 1 Q1 / J T2m / s P 2m /
W k2 / h- 1 Q2 / J Qt/ J I%
S1 11 330 98 1
03 0
36 16 182 160 0
769 1
49 2
27 0
35
S2 11 339 91 1
85 0
19 16 295 155 0
709 1
50 1
82 0
35
S3 11 887 93 1
24 0
33 18 016 156 0
666 1
50 1
83 0
42
S4 11 416 101 1
24 0
37 16 333 165 0
720 1
64 2
01 0
36
S5 12 172 87 1
36 0
29 19 468 160 0
665 1
63 1
92 0
45
S6 12 176 80 1
57 0
21 19 371 151 0
751 1
54 1
79 0
45
S7 11 809 92 1
37 0
30 16 798 154 0
732 1
50 1
81 0
40
S8 11 747 97 1
29 0
34 18 840 158 0
654 1
68 2
02 0
40
S9 11 260 97 1
64 0
29 16 131 160 0
715 1
60 1
90 0
34

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综合分析, 注射用双黄连冻干粉针剂量与参数
T
1
m、P1m、Q 1、k1、T 2m、I 均有较好的线性关系, 其中指
数生长期生长速率常数 T 1m 和发热功率 P 1m 更能表
征药物作用于细菌随时间生长变化特征和总体特
征,故选 T 1m、P 1m 作为基本评价参数。
以样品编号为因素变量, 微量量热学参数 T 1m、
P
1
m 为因变量,进行单因素方差分析( ANOVA)、组
间有显著性差异( P< 0
05) , 见表 3。提示注射用双
黄连冻干粉针各样品间有一定的差异。
表 3
单因素方差分析 ANOVA
Table 3
One-way ANOVA
项目 方差 自由度 离均差 F 值 显著性
T1m 4 458 380 8 557 297. 550 85. 616 0. 000
305 759. 6 36 8 493. 322
4 764 140 44
P1m 1 185. 174 8 148. 147 136. 239 0. 000
39. 436 36 1. 095
1 224. 640 44
2
4
3
综合聚类分析:以生物热活性图谱相似度 S、
参数T 1m、P1m 进行多指标聚类分析,见图4。所用样品
可以分为三大类, 其中 S1、S2、S3、S4被聚为一类, 为
室温避光放置样品; S7、S8、S9被聚为一类, 为光照
( 4 500
500) lx放置样品; S5、S6被聚为一类,为高温
60
放置样品,均与实际相符,抑菌作用已发生一定
的变化,提示质量发生了改变。
图 4
不同注射用双黄连冻干粉针样品聚类分析
Fig. 4
Cluster analysis of different samples of SFPI
2
4
4
综合分析: 与避光室温放置样品相比, 高温
( 60
)放置样品的生物热活性图谱指数生长期 T 1m
和稳定期T 2m 均后移, 指数生长期发热功率减小, 峰
形变得平缓, 其整个代谢过程的时间增加, 而光照
( 4 500
500) lx 放置样品的生物热活性图谱变化不
明显。结果表明高温( 60
)放置样品与避光室温
放置样品相比, 抑菌活性增强, 而光照( 4 500
500)
lx 条件放置样品与室温( 22
)条件放置样品相比,
抑菌活性差异不明显。
3
讨论
本研究从生产质控角度出发, 以注射用双黄连
冻干粉针为模型药, 建立了基于痢疾杆菌生物热活
性图谱的质量均一性评价方法, 可以辨识高温和光
照条件下样品产生的质量差异, 旨在模拟考察产品
在储存、运输过程中受光照和高温等因素影响导致
的微小质量变化, 为早期预警药源性不良反应提供
技术参考。对样品进行盲法编号, 以保证试验结果
的客观性和准确性。
微量量热法是基于生化反应中普遍存在的热交
换而建立的, 能在线、量化、动态地反映微生物生长
代谢过程中的动态整体信息, 其热谱曲线可直接全
面的反映微生物生长代谢热量变化的整体特征, 从
而有效的弥补常规方法信息单一的不足 [ 10, 11]。因
此,微量量热学方法有望为中药注射剂的质量控制
提供新的思路和技术平台。
本实验建立了生物热活性图谱,可以定性定量
地刻画注射用双黄连冻干粉针的合格样品及特殊样
品的质量信息,以期建立合格样品质量标准信息数
据库,采用模式识别技术,通过比对特殊样品质量信
息,筛选标准质量变化的关键信息, 设定其阈值范
围,建立判别函数,通过对样品质量检验过程中采用
模式识别、参数放行技术,以实现对注射用双黄连冻
干粉针质量波动的早期预警的目的。
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