全 文 ：基于生物热力学表达的大青叶活性部分初筛
武彦文１，２，肖小河１，高文远３，赵艳玲１，金 城１，刘 义４
（１解放军３０２医院 中药研究所，北京 １０００３９；
２天津科技大学 食品科学与生物工程学院，天津 ３００２２２；
３天津大学 药物科学与技术学院，天津 ３０００７２；
４武汉大学 化学与分子科学学院，湖北 武汉 ４３００７２）
［摘要］ 目的：从生物热力学角度出发，构建筛选中药活性部分的方法并探讨其可行性。方法：采用生物物理
化学中较先进的微量量热方法，测定大青叶水煎液及其不同化学萃取部分对大肠杆菌的代谢影响，通过大青叶对
大肠杆菌的热活性谱图（即热功率时间曲线，Ｐｔ图）分析，得到一系列生物热力学参数。结合中医药理论分析了
大青叶水煎液及其化学萃取部分的药效作用及差异。结果：大青叶水煎液对大肠杆菌的生长具有促进作用，且随
着药液含量的增加，该促进作用逐渐增强。大青叶水煎液的５个化学部分对大肠杆菌生长的影响存在显著差异，
其中水层部分能够刺激大肠杆菌的生长，而其他４个部分即石油醚部分、氯仿部分、醋酸乙酯和正丁醇部分对大肠
杆菌的生长有不同程度的抑制作用，其抑制作用的大小依次为正丁醇部分＞醋酸乙酯部分＞氯仿部分＞石油醚部
分。结论：生物热力学的研究手段微量量热方法具有适用性广，便捷快速的优点，该方法的运用为中药的药效物质
初筛提供了一个新的研究思路和方法。
［关键词］ 微量量热法；大青叶；化学萃取部分；大肠杆菌
［中图分类号］Ｒ２８５５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００６）０８０６７６０４
［收稿日期］ ２００５０５０８
［基金项目］ 国家自然科学基金项目（３９９７０９１１，３０３７１７２４）；国
家中医药管理局科研基金项目（２０００ＪＱ１）
［通讯作者］ 肖小河，Ｔｅｌ：（０１０）６６９３３３２２，Ｅｍａｉｌ：ｐｈａｒｍａｃｙ３０２
＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ
大青叶是我国传统中药，具有清热解毒、凉血消
斑的功效［１］。本研究以大肠杆菌作为测试菌，采用
微量量热法测量不同含量的大青叶药液对细菌生长
的 Ｐｔ曲线，得出大青叶不同提取物对大肠杆菌具
有促进和抑制的双重药效作用。
１ 材料
１１ 仪器
采用瑞典 Ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｒｉｃ公司产 ＴＡＭＡｉｒＩｓｏｔｈｅｒ
ｍａｌＣａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ测定。该热活性检测仪配置 ＰｉｃｏＴＣ
８０数据采集和分析软件。
１２ 材料
大肠杆菌（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＡＢ９１１１２）由武汉大学
中国典型培养物保藏中心提供；培养基采用 ＬＢ液
体培养基，取ＮａＣｌ５ｇ，酵母膏５ｇ，蛋白胨１０ｇ，溶解
于１０００ｍＬ蒸馏水中，调 ｐＨ７０～７２后分装。
１２１℃高压蒸气灭菌２０ｍｉｎ，冷却后置冰箱中备用。
大青叶 ＩｓａｔｉｓｉｎｄｉｇｏｔｉｃａＦｏｒｔ由安徽阜阳板蓝根
ＧＡＰ基地提供，经解放军 ３０２医院肖小河研究员鉴
定。所有试剂均为分析纯。氨苄青霉素（Ａｍｐ，ＡＭ
ＲＥＳＣＯ原装）：５０μｇ·ｍＬ
－１；硫酸链霉素（Ｓｔｒ，ＧＩＢＣＯ
分装）：５０μｇ·ｍＬ
－１；硫酸卡那霉素（Ｋａｎ，ＡＭＲＥＳＣＯ
分装）：５０μｇ·ｍＬ
－１；０４５μｍ水系和有机系滤膜；其
他试剂均为分析纯或生化试剂。
２ 方法
２１ 样品制备
２１１ 大青叶水煎剂的制备 取大青叶生药５０ｇ，
以１∶１０加入去离子水，加热回流提取 ２次，每次 １
ｈ，过滤，合并滤液，浓缩后冷冻干燥备用。测定时采
用无菌水溶解为２５～２５０ｍｇ·ｍＬ－１的药液，用０４５
μｍ的滤膜过滤除去杂菌后，加入接种了细菌的液体
培养基中。
２１２ 大青叶不同化学萃取部分的制备 取大青
叶生药１００ｇ，以１∶１０加入去离子水，加热回流提取
２次，每次１ｈ，合并滤液，冷却后，依次用石油醚、氯
仿、醋酸乙酯、正丁醇萃取３～５次，合并后浓缩、冷
冻干燥。分别得到石油醚部分 ０２３６ｇ，氯仿部分
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０８０４ｇ，醋酸乙酯部分２０９ｇ，正丁醇部分３４８ｇ和
水层部分 １２９５ｇ。测定时加入适量 ＤＭＳＯ和无菌
水溶解，配制为１０～１００ｍｇ·ｍＬ－１的药液，测定前用
０４５μｍ的滤膜过滤除去杂菌后，加入接种了细菌
的液体培养基中。
２２ 方法
２２１ 细菌生长的 Ｐｔ曲线测定 采用安瓿法。
在无菌条件下，精确加入 ５ｍＬ培养基，接种大肠杆
菌菌悬液，接种量为１×１０６ＣＦＵ·ｍＬ－１，之后迅速加
入不同剂量的药液，加盖瓶塞，密封。迅速放入微量
量热仪中跟踪记录细菌生长的 Ｐｔ曲线，当曲线重
新返回基线时，实验结束［２］。
２２２ 最小抑菌浓度（ＭＩＣ）的测定 采用试管稀释
法测定大青叶水煎剂及其不同化学萃取部分的
ＭＩＣ。连续双倍递减稀释的大青叶各提取物，将每
个稀释含量的提取物加入到 ＬＢ培养液中，分别取
０１ｍＬ大肠杆菌细菌（１×１０６ＣＦＵ·ｍＬ－１）的悬浮培
养液接种于试管中，塞好试管，置 ３７℃下培养 ２４ｈ
后观察细菌生长情况。肉眼检测菌株没有增殖的最
低浓度和菌株明显增殖的最高浓度的试管培养提取
物的平均值为提取物对大肠杆菌的ＭＩＣ［３］。
２３ 数据分析［４７］
在细菌的生长过程中，Ｐｔ曲线上的指数生长
期内的产热功率与培养时间之间符合公式：
Ｐｔ＝Ｐ０ｅｘｐ（ｋｔ）或 ｌｎＰｔ＝ｌｎＰ０＋ｋｔ （１）
其中 Ｐ０和 Ｐｔ分别是细菌的指数生长的初始点
和ｔ时的热功率。
药物对细菌生长过程的抑制率（Ｉ％）定义为：
Ｉ％＝（ｋ０－ｋｃ）／ｋ０×１００ （２）
式中，ｋ０和 ｋｃ分别为细菌未受到药物抑制和受
到含量为ｃ的药物抑制作用时的生长速率常数，抑
制率为 ５０％时所对应的药物含量为半抑制浓度
ＩＣ５０。ＩＣ５０越小，表示细菌对药物越敏感，即药物的
抑制作用越明显。
３ 结果
３１ 大肠杆菌生长的 Ｐｔ曲线
采用安瓿法可以同时测定大肠杆菌对照组和大
肠杆菌给药组在 ＬＢ培养基中的产热曲线。将 Ｐｔ
曲线上的指数生长期的Ｐｔ，ｔ值代入（１）式中，用计
算机进行线性拟合可以得到大肠杆菌的生长速率常
数 ｋ１，ｋ２值（见表１）。
表１ 大肠杆菌在３７℃
下的生长速率常数
实验组 ｋ１／ｍｉｎ－１ ｒａ１ ｋ２／ｍｉｎ－１ ｒａ２ 实验组 ｋ１／ｍｉｎ－１ ｒａ１ ｋ２／ｍｉｎ－１ ｒａ ２
１ ０．０２７８２ ０．９９６９ ０．００５２４ ０．９９８４ ５ ０．０２８０５ ０．９９ ００ ０．００５１１ ０．９９９７
２ ０．０２７２６ ０．９９３９ ０．００５０９ ０．９９９７ ６ ０．０２７６９ ０．９９ ０７ ０．００５２３ ０．９９９２
３ ０．０２６３０ ０．９９５４ ０．００５２６ ０．９９８５ ７ ０．０２７６４ ０．９９ ５９ ０．００５０７ ０．９９８６
４ ０．０２６４２ ０．９９０９ ０．００５２８ ０．９９８６ ８ ０．０２７２１ ０．９９０５ ０．００５１４ ０．９９９５
由表 １可知：ｋ１＝（００２７３０±００００８）ｍｉｎ－１，
ｋ２＝（０００５１８±００００１１）ｍｉｎ－１，ｒ均大于０９９５０，
可见细菌细胞的生长产热功率，在相同的实验条件
下，其结果有很好的重复性和相关性。
３２ 大青叶水煎剂对大肠杆菌生长的影响
将大肠杆菌对照组的热功率输出曲线及其在不
同含量大青叶提取物作用下的热功率曲线进行比较
（见表２），可以看出：随着药物含量的增加，大肠杆
菌的第一指数生长期的生长速率常数（ｋ１）显著增
大，其产热曲线上的第一个指数峰即最大发热功率
（Ｐｍ）随含量的增大而增高；同时大肠杆菌第一个生
长阶段的产热量 Ｑ１和总的产热值 Ｑｔ也呈现增加的
趋势，并随着药物含量的增大更加明显。说明大青
叶水煎剂对大肠杆菌的生长起刺激或促进作用。
同时从大肠杆菌的 Ｐｔ曲线看到：随着大青叶
水煎剂含量的增加，第一指数期的最大输出功率 Ｐｍ
出现的时间 ｔｍ逐渐向后延迟。相应地第二阶段的
生长峰也逐渐拖后出现，在大青叶水煎剂含量为
０～４ｍｇ·ｍＬ－１内，大青叶在大肠杆菌的第 ２个生长
阶段表现出促进作用，ｋ２值也随含量的增加而增加；
但由于安瓿瓶中各组培养基是统一的（均为 ５ｍＬ
ＬＢ培养基），在药液含量８～３０ｍｇ·ｍＬ－１时，由于第
一阶段的旺盛生长消耗养分过多，后一阶段的生长
速率 ｋ２由于养分的欠缺而降低。但从总的放热量
（Ｑｔ）随药液含量增大的结果来看：大青叶的水煎剂
对大肠杆菌有促进生长的影响。
３３ 大青叶不同化学萃取部分对大肠杆菌生长代
谢的影响
大青叶水煎剂的５个有机溶剂萃取部分对大肠
杆菌生长影响的实验结果（见图１）。图１为大青叶
各萃取部分的含量均为 １ｍｇ·ｍＬ－１时的热活性图
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表２ 不同含量大青叶水煎剂作用下的大肠杆菌生长代谢情况（３７℃）
剂量／ｍｇ·ｍＬ－１ ｋ１／ｍｉｎ－１ γ１ ｋ２／ｍｉｎ－１ γ２ Ｐｍ／μＷ ｔｍ／ｍｉｎ Ｑ１／Ｊ Ｑｔ／Ｊ
０ ０．０２７２１ ０．９９０５ ０．００５１４ ０．９９９５ ８０３．９ １９７ ６．０８ ５７．３３
０．５ ０．０２７４２ ０．９９３８ ０．００５２９ ０．９９８５ ８９１．６ ２０３ ７．０３ ５９．８１
１ ０．０２７８０ ０．９９４７ ０．００５８８ ０．９９６９ ９６７．１ ２１４ ７．４８ ５９．８２
２ ０．０３４１４ ０．９９２５ ０．００６８２ ０．９９１４ ９９６．４ ２２０ ７．６５ ５９．９９
４ ０．０３５５１ ０．９９０９ ０．００７２７ ０．９９４６ １２２１９ ２３５ ９．２１ ６０．１２
８ ０．０３５３３ ０．９９３２ ０．００７１４ ０．９９６２ １６４７９ ２８５ １２．１４ ６４．４０
１５ ０．０３６６２ ０．９９４１ ０．００６６４ ０．９９５９ １９０５１ ２９６ １７．４８ ６７．５７
３０ ０．０３７４０ ０．９９１９ ０．００２９８ ０．９９８４ １９２７５ ３５３ ２５．７４ ７１．８０
谱。结果表明：各部分对大肠杆菌的生长影响各异。
总的趋势为水层部分对大肠杆菌有促进作用，而其
他各部分均为抑制作用。
图１ 大肠杆菌在大青叶不同化学萃取
部分（１ｍｇ·ｍＬ－１）作用下生长代谢的 Ｐｔ曲线
ａ空白对照；ｂ石油醚部分；ｃ氯仿部分；ｄ醋酸乙酯部分；
ｅ正丁醇部分；ｆ水层部分
３４ 大青叶不同化学萃取部分对大肠杆菌的抑制
率和半抑制浓度
大肠杆菌在不同含量药物作用下的抑制率 Ｉ％
（见表３）。为了便于比较大青叶不同化学萃取部分
对大肠杆菌的抑制作用，将各样品的 ＩＣ５０和用传统
方法测定的ＭＩＣ的实验结果也列于表３。
由表３可见：随着溶剂极性的增强，所得到的萃
取物的抑菌能力逐渐增加，从大青叶各个化学萃取
物的抑制率和半抑制浓度结果可看出：抑制作用大
小顺序依次为正丁醇部分＞醋酸乙酯部分＞氯仿部
分＞石油醚部分。这一结果与用试管稀释法得到的
最小抑菌浓度的结果基本相符（见表３）。
４ 讨论
用微量量热仪的安瓿法可以同时测定大肠杆菌
对照组和加入药液的大肠杆菌在ＬＢ培养基中的 Ｐ
ｔ曲线。由于安瓿瓶中特殊生长环境，养分和氧气
的供应量有限［８］，大肠杆菌的 Ｐｔ曲线出现 ２个指
数生长期。有文献报道认为前一个峰为细菌利用新
鲜培养基及溶解氧迅速生长的结果，其生长速率较
快，可称为细菌细胞的第一指数生长期；随着细菌的
快速生长，培养基中的溶解氧迅速消耗，细菌的生长
表３ 大青叶水煎剂的不同化学萃取部分对
大肠杆菌生长代谢的影响（３７℃）
药物
Ｃ
／ｍｇ·ｍＬ－１
ｋ１
／ｍｉｎ－１
Ｉ
／％
ＩＣ５０
／ｍｇ·ｍＬ－１
ＭＩＣ
／ｍｇ·ｍＬ－１
对照 ０ ０．０２７２１ －
石油醚部分 ０．２５ ０．０２５８３ ５．０７ ２．３７ １０
０．５ ０．０２３７４ １２．７５
１ ０．０２０３２ ２５．３２
２ ０．０１５８９ ４１．６０
氯仿部分 ０．２５ ０．０２３１３ １４．９９ ２．１７ １０
０．５ ０．０２１９０ １９．５１
１ ０．０１８７２ ３１．２０
２ ０．０１４７６ ４５．７６
醋酸乙酯部分 ０．２５ ０．０２２５６ １７．０９ １．８１ ７．５
０．５ ０．０２０１７ ２５．８７
１ ０．０１６０１ ４１．１６
２ ０．０１３３５ ５０．９４
正丁醇部分 ０．２５ ０．０２１９２ １９．４４ １．４２ ５
０．５ ０．０２０１０ ２６．１３
１ ０．０１４９６ ４５．０２
２ ０．０１０２５ ６２．３３
Ａｍｐａ ０．００５
Ｓｔｒ ０．０１
Ｋａｎ ０．０１
出现暂时的停滞，这期间也是细菌细胞调整自身生
理活动以适应环境的过程，经过一段调整期后，细菌
重新开始稳步增长，即第二指数生长期，其生长速率
相对要比第一指数期的生长速率要低得多，但由于
细菌数量大，产热功率高，是细菌细胞的主要放热阶
段［９］；在细菌细胞的生长后期，培养基被消耗殆尽，
热功率曲线重新回到基线。因此大肠杆菌生长的
Ｐｔ曲线可以划分为４个阶段，即停滞期、第一指数
生长期、第二指数生长期和衰亡期。这种划分方法
与传统细菌４个生长时期的划分方法并不矛盾。实
际上细菌的第二个指数生长期属于稳定期的一部
分。
近年来有关大青叶药效成分的研究报道较多，
但大青叶清热解毒的真正物质还不清楚，影响了大
青叶的推广应用。现代药理认为中药清热解毒的药
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效之一是源于中药中含有抗病原微生物的活性部分
或化学成分［１０］。为此本研究以大青叶作为模式药，
根据生物热力学的理论和方法，采用微量量热仪研
究大青叶水煎剂及其不同化学萃取部分对微生物的
代谢影响。结果表明：大青叶水煎剂对大肠杆菌的
影响表现为促进生长作用。进一步的实验发现：大
青叶提取物的这种促进作用是基于其中不同活性部
分的抑菌和促菌综合作用的结果。该实验说明了中
药多成分、多靶点的药理药效作用特点。因此笔者
认为大青叶清热解毒的药效作用是通过多种途径的
方式达到预防和治疗疾病作用的。
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ｐａｒｔｓｏｆｆｏｌｉｕｍｏｆＩｓａｔｉｓｉｎｄｉｇｏｔｉｃａｂａｓｅｄｏｎｂｉｏｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ
ＷＵＹａｎｗｅｎ１，２，ＸＩＡＯＸｉａｏｈｅ１，ＧＡＯＷｅｎｙｕａｎ３，ＺＨＡＯＹａｎｌｉｎｇ１，ＪＩＮＣｈｅｎｇ，ＬＩＵＹｉ４
（１ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，３０２ＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＰＬＡ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００３９，Ｃｈｉｎａ；
２ＣｏｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＴｉａｎｊｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００２２２，Ｃｈｉｎａ；
３ＣｏｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＴｉａｎｊｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７２，Ｃｈｉｎａ；
４ＣｏｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＷｕｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７２，Ｃｈｉｎａ）
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ｏｆｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｓｗａｓｎＢｕＯＨｅｘｔｒａｃｔ＞ＥｔＯＡｃｅｘｔｒａｃｔ＞ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍｅｘｔｒａｃｔ＞ＰＥｅｘｔｒａｃｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｄｅｃｏｃｔｉｏｎ
ａｎｄｉｔｓｗａｔｅｒｅｘｔｒａｃｔｏｆＦＩｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆＥ．ｃｏｌｉＷｈｉｌｅｔｈｅｏｔｈｅｒｆｏｕｒｏｒｇａｎｉｃｓｏｌｖｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｓｏｆｔｈｅｔｏｔａｌｄｅｃｏｃｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｅｄ
ｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｔｅｓｔｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ．Ｔｈｅｍｉｃｒｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄｈａｓｍａｎｙｖｉｒｔｕｅｓｓｕｃｈａｓｅｘｔｅｎｓｉｖｅａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ，ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ，ｅｔｃ，ａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｓ
ａｎｅｗａｎｄｕｓｅｆｕｌｍｅａｎｓｆｏｒｐｒｉｍａｒｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇｔｈｅｂｉｏａｃｔｉｖｅｐａｒｔｓａｎｄｓｕｂｓｔａｎｃｅｓｏｆＴＣＭ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｍｉｃｒｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ；ｆｏｌｉｕｍｏｆＩｓａｔｉｓｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ；ｄｅｃｏｃｔｉｏｎａｎｄｉｔｓｂｉｏａｃｔｉｖｅｐａｒｔｓ；Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａｃｏｌｉ
［责任编辑 古云侠］
·９７６·
第３１卷第８期
２００６年４月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ３１，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２００６