全 文 ：河北道地药材连翘的高效液相色谱指纹图谱研究
崔 　洋 ,王 　巧 ,张兰桐 3 ,孔德志 ,段坤峰
(河北医科大学药学院 药物分析教研室 ,河北 石家庄 　050017)
摘 　要 :目的 　建立河北道地药材连翘的 HPLC2PDA 指纹图谱 ,得到对照图谱 ,与不同产地、不同采收部位连翘药
材指纹图谱相比较 ,并测定了各批药材中连翘苷和芦丁的量 ,为科学评价与有效控制连翘药材质量提供方法。方
法 　色谱柱为 Diamonsil TM C18柱 (250 mm ×416 mm ,5μm) ,流动相为乙腈2011 %磷酸溶液进行梯度洗脱 ,柱温 30
℃,检测波长为 235 nm ,体积流量 018 mL/ min ,定量测定中连翘苷与芦丁的检测波长分别为 210 和 254 nm。结果
建立了河北省连翘药材 HPLC2PDA 指纹图谱共有模式 ,对不同产地、不同采收部位药材进行了相似度比较 ,并结
合定量测定结果对各批药材进行评价。结论 　本方法操作简便、快速、准确 ,为连翘药材的鉴别和全面质量控制提
供了依据。另外 ,连翘叶和花中连翘苷和芦丁量非常高 ,对于叶和花能否替代果实或与果实合并用药有待于进一
步研究。
关键词 :连翘 ;指纹图谱 ;连翘苷 ;芦丁 ;高效液相色谱
中图分类号 :R28217 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670 (2010) 02 0297 05
　　连翘为木犀科植物连翘 Fors y t hi a sus pensa
( Thunb1 ) Vahl 的干燥果实 ,具有清热解毒、消肿散
结的功效 ,用于痈疽、瘰疠、乳痈、丹毒、风热感冒、温
病初起、温热入营、高热烦渴、神昏、发斑、热淋尿
闭[1 ] 。化学成分包括苯乙醇苷类、木脂素及其苷类、
五环三萜类、挥发油类等[2 ] ,其中连翘苷是连翘抗菌
和抗病毒作用的活性成分[3 ] 。河北为连翘药材的主
要产区。通过 H PL C 方法建立药材的指纹图谱已
有很多报道[ 4～6 ] ,本实验对来自不同产区和不同采
收部位的 29 批连翘药材 (其中包括老翘、青翘的茎、
叶、花)进行了 H PL C2PDA 指纹图谱分析 ,以 12 批
河北道地药材生成对照指纹图谱 ,并测定了各批药
材中连翘苷和芦丁。方法重现性与精密度良好 ,有
助于连翘药材的标准化种植与道地药材的质量控
制 ,同时为连翘药材的鉴别提供依据。
1 　仪器与试药
美国 Agilent —1200 高效液相色谱仪 (在线脱
气机 ,四元泵 ,自动进样器 , PDA 检测器) ; Agilent
Chem Office 色谱工作站 ; SCQ —200 超声波清洗器
(100 W ,25 k Hz) (上海声谱超声波设备厂) , Heal
Force2PWV F 超纯水制备仪 (香港力康发展有限公
司) 。甲醇、乙腈为色谱纯 (美国迪马公司) ,水为二
次重蒸水 ,其他溶剂均为分析纯。连翘苷对照品 (批
号 08212200104 ) 、芦 丁 对 照 品 ( 批 号 1000802
200306) 、连翘对照药材 (批号 1209082200613) 均由
中国药品生物制品检定所提供。不同产地连翘样品
来源见表 1 ,均经河北医科大学药学院生药学教研
室聂凤禔教授鉴定。
本研究收集了 29 批不同产地、不同采收部位的
连翘药材 ,晾干。将样品置于烘箱内 ,40 ℃烘干 8 h ,
取出 ,用粉碎机粉碎 ,过 3 号筛 ,置干燥器中 ,备用。
2 　方法与结果
211 　对照品溶液的制备 :取连翘苷、芦丁对照品适
量 ,精密称定 ,加甲醇溶解并稀释制成质量浓度分别
为 01535、01521 mg/ mL 的溶液 ,即得。
212 　供试品溶液的制备 :取药材粉末 (过 3 号筛) 015
g ,精密称定 ,置 25 mL 量瓶中 ,加 75 %甲醇至刻度 ,
摇匀 ,称定质量 ,超声提取 45 min ,取出 ,放冷 ,用 75 %
甲醇补足质量 ,摇匀 ,微孔滤膜 (0145μm)滤过 ,即得。
213 　指纹图谱的建立
21311 　色谱条件与系统适用性试验 :色谱柱为 Di2
amonsil TM C18柱 (250 mm ×416 mm ,5μm) (迪马公
司) ;乙腈2011 %磷酸溶液为流动相梯度洗脱 ,0～20
min ,5 %～18 %乙腈 ;20～48 min ,18 %～27 %乙腈 ;
48～60 min ,27 %～36 %乙腈 ;60～90 min ,36 %～
70 %乙腈 ;检测波长 235 nm ;体积流量 018 mL/
min ;柱温 30 ℃;进样量 10μL 。除未达到基线分离
的两峰合并外 ,其余各峰的分离度均大于 110。所
有组分均在 100 min 内检测完成 ,色谱图见图 1。
21 31 2 　精密度试验 :取10号连翘药材粉末制备供
·792·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
3 收稿日期 :2009204215　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :河北省科技支撑计划项目 (092764231D)
作者简介 :崔　洋 (1985 —) ,女 ,河北保定人 ,河北医科大学药学院 2007 级硕士研究生 ,从事中药质量控制与药代动力学研究。
E2mail :yangyang1985hanzhe @163. com3 通讯作者　张兰桐　Tel : (0311) 86266419 　Fax : (0311) 86266419 　E2mail :zhanglantong @2631 net
表 1 　连翘药材样品来源
Table 1 　Sources of Fructus Forsyt hiae samples
样品号 样品来源 采收部位 样品号 样品来源 采收部位
1 河北安国　　　　　　　 果实 16 四川　　 果实　　
2 河北承德　　　　　　　 果实 17 云南　　 果实　　
3 河北邯郸　　　　　　　 果实 18 湖南　　 果实　　
4 河北邯郸　　　　　　　 果实 19 山西　　 果实　　
5 河北邯郸　　　　　　　 果实 20 河南老翘 果实　　
6 河北邯郸　　　　　　　 果实 21 河北井陉 花　　　
7 中国药品生物制品检定所 果实 22 河北井陉 叶 (蒸过)
8 河北井陉青翘　　　　　 果实 23 河北井陉 叶　　　
9 河北井陉　　　　　　　 果实 24 河北井陉 叶　　　
10 河北涉县太行山　　　　 果实 25 河北井陉 叶　　　
11 河北石家庄　　　　　　 果实 26 河北井陉 叶　　　
12 河北辽城　　　　　　　 果实 27 河北井陉 叶　　　
13 河南新乡青翘　　　　　 果实 28 河北井陉 叶　　　
14 山西老翘　　　　　　　 果实 29 河北井陉 茎　　　
15 陕西西安　　　　　　　 果实
t/ min
图 1 　连翘药材( A)和连翘苷对照品( B)图谱对比
Fig11 　Comparison of f ingerprint between Fructus
Forsyt hiae ( A) and forsythin reference
substance ( B)
试品溶液 1 份 ,重复进样 6 次 ,记录指纹图谱 ,利用
中药色谱指纹图谱相似度评价系统 A 版软件计算
相似度 ,结果均大于 019 ;各主要色谱峰相对保留时
间 RSD 均小于 0117 % ,相对峰面积比值的 RSD 均
小于 116 %。
21313 　重现性试验 :取 10 号连翘药材粉末制备供
试品溶液 6 份 ,分别进样 ,记录指纹图谱 ,相似度计
算结果均大于 019 ;各主要色谱峰相对保留时间
RSD 均小于 0125 % ,相对峰面积比值的 RSD 均小
于 1127 %。
21314 　稳定性试验 :取 10 号连翘药材粉末 ,精密称
定 ,制备供试品溶液 ,分别于 0、2、4、6、8、10、12、24 h
检测指纹图谱。相似度计算结果均大于 019 ;各主要
色谱峰相对保留时间 RSD 均小于 115 % ,相对峰面积
比值 RSD 均小于 210 % ,说明样品在 24 h 内稳定。
21315 　河北道地连翘药材指纹图谱的建立 :取对照
药材及河北产连翘药材 (1～12 号样品) ,制备供试
品溶液 ,分别进样 ,进行 HPL C 分析 ,得道地连翘药
材指纹图谱及其 18 个共有峰 (图 2) ,并生成对照图
谱 ( R) ,见图 3 ;计算其相似度 ,结果见表 2。
21316 　不同产地连翘药材指纹图谱的建立 :取不同
t/ min
S2连翘苷
S2forsyt hin
图 2 　连翘药材指纹图及共有峰标识
Fig12 　Fingerprints of Fructus Forsyt hiae
and marking of common peaks
t/ min
S1～S122样品 1～12 　R2对照指纹图谱
S1 —S122samples 1 - 12 　R2reference fingerprint
图 3 　12 批道地连翘药材指纹图谱及生成的共有模式
Fig13 　Fingerprints of 12 batches of Fructus Forsyt hiae
and their plots of mutual modes
·892· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
来源的连翘药材 (13～20 号样品) ,制备供试品溶
液 ,分别进样 ,进行 HPL C 分析 ,得到 8 批不同来源
连翘药材的指纹图谱 ,见图 4 ;并计算其与对照指纹
图谱比较的相似度 ,结果见表 2。
t/ min
S1～S82样品 12～19
S1 - S82samples 12 - 19
图 4 　不同产地连翘药材指纹图谱
Fig14 　Fingerprints of Fructus Forsyt hiae
from different sources
表 2 　不同批次连翘药材与共有模式比较的相似度
Table 2 　Similarities among 29 batches of Fructus
Forsyt hiae samples compared
with reference f ingerprints
批号 相似度 批号 相似度
1 01954 16 01465
2 01968 17 01293
3 01974 18 01669
4 01959 19 01764
5 01891 20 01825
6 01902 21 01589
7 01853 22 01672
8 01865 23 01580
9 01938 24 01309
10 01874 25 01330
11 01886 26 01373
12 01850 27 01316
13 01752 28 01337
14 01768 29 01432
15 01541
21317 　不同采收部位连翘药材指纹图谱的建立 :取
不同采收部位的连翘药材 (21～29 号样品) ,制备供
试品溶液 ,分别进样 ,进行 H PL C 分析 ,得到 9 批不
同采收部位连翘药材的指纹图谱 ,见图 5 ;并计算其
与对照指纹图谱比较的相似度 ,结果见表 2。
21318 　相似度比较 :在 29 批药材中 ,12 批河北道
地药材相似度均在 0185 以上 ,批间差异较小。据文
献报道山西、河南也是连翘药材主产地[7 ] ,由表 2 可
看出 ,山西、河南产连翘药材相似度差异不大。但其
他产地药材与河北道地药材生成的对照指纹图谱相
t/ min
S12花　S2～S82叶　S92茎
S12flower 　S2 - S82leaf 　S92stem
图 5 　不同采收部位连翘药材指纹图谱
Fig15 　Fingerprints of Fructus Forsyt hiae
from different parts of plant
比 ,相似度差异较大 ,说明不同产地的连翘药材之间
存在较大差异。不同采收部位连翘药材(茎、叶、花)
相似度差异也较大 ,说明连翘不同采收部位化学成
分或各成分量不尽相同。
214 　连翘药材中连翘苷和芦丁的测定
21411 　色 谱 条 件 : 采 用 Diamonsil TM C18 柱
(250 mm ×416 mm ,5μm) (迪马公司) ;乙腈2011 %
磷酸为流动相梯度洗脱 ,0～5 min ,25 %～30 %乙
腈 ;5～8 min ,30 %～35 %乙腈 ;8～12 min ,35 %～
55 %乙腈 ;体积流量 110 mL/ min ;检测波长为 :连
翘苷 210 nm ,芦丁 254 nm ;柱温 30 ℃。
21412 　系统适用性实验 :在上述确定的色谱条件
下 ,吸取供试品溶液 10μL ,注入 HPL C 色谱仪 ,记
录 12 min 内的色谱图 ,理论板数按连翘苷和芦丁计
算分别为 25 000 和 4 800 ,与其他色谱峰的分离度
大于 115 ,色谱图见图 6。
21413 　标准曲线制备 :稀释连翘苷和芦丁对照品储
备液 ,使配制成连翘苷为 617～535μg/ mL 、芦丁为
615～521μg/ mL 的对照品溶液。吸取上述溶液 10
μL ,注入 HPL C 色谱仪 ,记录峰面积。以质量浓度
( Y) 为横坐标 ,峰面积 ( X) 为纵坐标 ,绘制标准曲线 ,
经回归处理得回归方程为 , 连翘苷 : Y = 01024 5
X - 181667 , r = 01999 2 ( n = 7) ;芦丁 : Y = 01108 5
X - 31586 3 , r = 01999 9 ( n = 7) 。
21414 　精密度试验 :取连翘药材 10 号样品适量 ,精
密称定 ,制备供试品溶液 ,吸取 10μL ,注入液相色
谱仪 ,重复进样 6 次 ,按确定的色谱条件记录峰面
积 ,连翘苷、芦丁质量分数的 RSD 分别为 114 %和
019 %。
21415 　稳定性试验 :取连翘药材 10 号样品适量 ,精
·992·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
t/ min
12连翘苷　22芦丁
12forsyt hin 　22rutin
图 6 　对照品连翘苷( A) 、芦丁( B)和 25 号样品连翘苷( C) 、芦丁( D)色谱图
Fig16 　Chromatograms of forsythin reference substance ( A) and rutin reference substance ( B) , forsythin
of sample ( C) , and rutin of sample ( D)
密称定 ,制备供试品溶液 ,分别于 0、2、4、6、8、10、
12、24 h ,吸取 10μL 进样 ,记录峰面积 ,连翘苷、芦
丁质量分数的 RSD 分别为 110 %和 0166 % ,说明供
试液在 24 h 内稳定。
21416 　重现性试验 :取连翘药材 10 号样品适量 ,精
密称取 6 份 ,制备供试品溶液 ,分别吸取 10μL ,注
入液相色谱仪 ,记录峰面积 ,连翘苷、芦丁质量分数
的 RSD 分别为 210 %和 117 %。
21417 　回收率试验 :取连翘药材 10 号样品约 0125
g ,共 6 份 ,精密称定 ,分别精密量取连翘苷、芦丁对
照品溶液 110 和 210 mL (约相当于连翘药材含连翘
苷、芦丁的 50 %) ,依次加入上述 6 份药材中 ,制备
供试品溶液 ,分别吸取 10μL ,注入液相色谱仪 ,记
录峰面积 , 连翘苷、芦丁的平均回收率分别为
99120 %和 96197 % ,RSD 分别为 114 %和 019 %。
21418 　最低检测限 :精密称取连翘苷、芦丁对照品 ,加
甲醇溶解并逐步稀释至所得色谱图中峰高为噪音的 3
倍 ,连翘苷、芦丁的最低检测限分别为 5 和 215 ng。
21419 　样品测定 :取河北道地 (1～12 号) 与不同产
地和不同采收部位连翘药材 (13～29 号) ,制备供试
品溶液 ,分别吸取 10μL ,注入液相色谱仪 ,记录峰
面积并计算质量分数 ,结果见表 3。
　　《中国药典》2005 年版规定连翘中连翘苷不得
低于 0115 %[1 ] ,在测定的 29 批药材中 ,有 19 批药
材中连翘苷的量高于 0115 % ,其中有道地的 ,也有
非道地的。四川采收的连翘药材相似度较低 ,实验
中基本检测不到连翘苷和芦丁所对应的色谱峰。不
同来源连翘药材中连翘苷和芦丁的量有很大差别。
连翘叶和花中连翘苷和芦丁的量都非常高 ,对于连
翘叶和花能否替代连翘果实入药值得进一步研究。
3 　讨论
本实验采用 HPL C2PDA 法 ,对来自不同产地
和不同采收部位的 29 批连翘药材进行了指纹图谱
表 3 　连翘药材中连翘苷和芦丁的测定结果
Table 3 　Contents of forsythin and rutin
in Fructus Forsyt hiae
批号 连翘苷/ % 芦丁/ % 批号 连翘苷/ % 芦丁/ %
1 01 569 7 01 447 1 16 0 　　　 0 　　　
2 01 061 7 01 170 0 17 01032 6 01183 1
3 01 628 3 01 488 3 18 01029 5 01394 0
4 01 509 9 01 623 6 19 01030 9 01527 0
5 01 113 6 01 214 9 20 01072 7 01355 7
6 01 183 5 01 299 4 21 11077 3 11679 8
7 01 246 4 01 284 3 22 21036 5 21698 5
8 01 414 9 01 818 2 23 11799 4 11252 1
9 01 329 5 01 349 5 24 11783 9 11469 2
10 01 188 3 01 335 1 25 21234 9 11259 8
11 01 836 6 01 554 4 26 11873 4 11224 0
12 01 186 5 01 116 4 27 11753 2 11270 1
13 01 857 3 01 577 1 28 11934 8 11384 3
14 01 129 7 01 225 7 29 01067 2 01088 6
15 01 070 3 01 109 9
分析 ,利用相似度软件以 12 批道地连翘指纹图谱生
成对照指纹图谱 ,并对不同产间药材的差异进行了
研究 ,同时对 29 批连翘样品中的连翘苷和芦丁进行
了测定 ,有助于连翘药材的标准化种植与质量控制。
研究结果表明 ,连翘苷和芦丁量的高低与其相
似度并非成对应关系。河北道地连翘药材中 ,除 2
号和 5 号样品连翘苷和芦丁的量较低外 ,其余各批
量均较高 ,相似度差异不大 ,质量相对稳定。河南、
山西产连翘药材相似度虽相差不大 ,但连翘苷的量
较低。陕西、四川、云南和湖南产连翘药材连翘苷和
芦丁量低同时相似度差异也很大 ,疑为非道地药材。
青翘中连翘苷和芦丁的量均高于老翘 ,与文献报道
一致[8 ] 。就不同采收部位的药材而言 ,连翘叶、花、
茎的相似度均较低 ,可能与化学成分以及成分量的
差异有关。连翘茎中连翘苷和芦丁量比果实低 ,但
花和叶中两种物质量均非常高 ,约为果实的 10 倍 ,
其中蒸过的叶 (22 号)与其他批次叶相比 ,量无显著
差别。因此 ,对于连翘叶、花的化学成分与果实有何
·003· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
差异值得深入研究 ,连翘叶和花的药用价值也需要
进一步验证。
本实验采用 PDA 检测器对最佳检测波长进行
选择 ,经 H PL C2PDA 在 200～400 nm 下进行全波
长扫描 ,在 235 nm 处出峰最多且整体信号明显 ,故
选择 235 nm 为检测波长。
本实验比较了不同提取溶剂 (甲醇、75 %甲醇、
50 %甲醇、30 %甲醇)的水浴回流和超声提取的提取
效果 ,同时还考察了不同提取时间的提取效果。结
果表明 ,以 75 %甲醇为提取溶剂 ,当超声提取 45
min 时 ,各色谱峰响应值不再增加 ,且方法稳定 ,重
现性好。
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高产绿原酸杜仲细胞悬浮培养体系优化研究
颜日明1 ,2 ,张志斌1 ,邱晓芳1 ,曾庆桂1 ,游 　海1 ,朱 　笃1 ,2 3
(11 江西师范大学生命科学学院 江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室 ,江西 南昌 　330022 ;
21 江西省天然药物活性成分研究重点实验室 ,江西 宜春 　336000)
摘 　要 :目的 　优化杜仲细胞悬浮培养及其产绿原酸的条件。方法 　研究基本培养基种类、激素质量浓度、碳源种
类及质量浓度、p H 值、接种量和摇床转速等因素对杜仲细胞生长和绿原酸产量的影响 ,建立了高产绿原酸的悬浮
细胞培养体系。结果 　B5 培养基 + 015 mg/ L NAA + 016 mg/ L 62BA、蔗糖 30 g/ L 、初始 p H 510～515、接种量 20
g ·FW/ L 以及摇床转速 110 r/ min 为杜仲细胞悬浮培养的适合条件。结论 　优化后的培养条件为杜仲细胞大规
模悬浮培养生产天然活性成分奠定了基础。
关键词 :杜仲 ;细胞悬浮培养 ;绿原酸
中图分类号 :R28211 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670 (2010) 02 0301 04
　　杜仲 Eucom mi a ul moi des Olive 为杜仲科杜仲
属多年生落叶乔木 ,其干燥树皮为我国特有名贵中
药 ,具有补肾健腰、强筋壮骨、提高机体缺氧耐力、改
善提高机体免疫功能、降低血脂、平衡调节血压等功
效。其药用成分包括木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素
类和黄酮类等。其中属于苯丙素类物质的绿原酸具
有广泛的抗菌、抗病毒、抗诱变、抗肿瘤作用[1 ] 。绿
原酸具有较强药理活性 ,对消化系统、血循环系统和
生殖系统均有作用[2 ] ,还可能作为抗 H IV 的先导化
合物 ,具有抗逆转录酶的活性[3 ] 。但是杜仲作为第
三纪孑遗的古老树种 ,其野生资源正在日益稀竭 ,同
时杜仲栽培周期长 ,商品药材的有效药用成分量极
低 ,产量质量都不稳定。运用细胞工程生产有用次
生代谢物质是目前全世界生物技术研究的三大潮流
之一 ,因此采用生物技术提高其活性成分的量势在
必行。目前 ,有关杜仲的组织培养、快繁及培养条件
对愈伤组织次生代谢产物合成影响的研究国内外已
有较多研究 ,但有关杜仲细胞悬浮培养研究仅有少
量报道[ 4 ,5 ] 。本实验通过对杜仲细胞悬浮培养及其
产绿原酸条件优化 ,为通过杜仲细胞大规模生产次
级代谢产物奠定基础。
1 　材料与方法
111 　材料 :杜仲种子 2005 年 11 月采于庐山 ,由南
昌大学生命科学学院黄兆祥教授鉴定。
112 　愈伤组织的诱导 :杜仲愈伤组织系由杜仲种子
萌发的无菌苗真叶诱导 ,诱导的培养基为含 110
mg/ L 2 , 42D + 11 0 mg/ L NAA (萘乙酸 ) + 110
mg/ L 62BA (62苄氨基嘌呤) 的 MS 培养基[ 6 ] 。置于
·103·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
3 收稿日期 :2009204208　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :教育部重点科技项目资助 (地方 204078)
作者简介 :颜日明 (1979 —) ,男 ,在读博士研究生 ,研究方向为发酵工程。E2mail :yanriming @yahoo1com1cn3 通讯作者　朱　笃　Tel : (0795) 3200616 　E2mail :zhudu12 @1631com