全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 10 期 2011 年 10 月

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冬凌草甲素注射剂诱导人胃癌 SGC-7901 细胞凋亡及其机制研究
季宇彬 1, 2，冮 剑 1, 2，高世勇 1, 2
1. 哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076
2. 国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076
摘 要：目的 研究冬凌草甲素注射剂诱导人胃癌 SGC-7901 细胞凋亡及与细胞内 Ca2+浓度（[Ca2+]i）的关系。方法 MTT
法检测冬凌草甲素注射剂对 SGC-7901 细胞的细胞毒活性；倒置显微镜观察冬凌草甲素注射剂对细胞形态学的影响；流式细
胞术测定细胞凋亡率；激光共聚焦显微术检测 SGC-7901 细胞[Ca2+]i 的变化；JC-1 单染，激光共聚焦显微术检测 SGC-7901
细胞中线粒体膜电位的变化。结果 冬凌草甲素注射剂对 SGC-7901 细胞的 IC50为 21.74 μmol/L；作用 48 h 后，细胞生长密
度变疏，细胞皱缩，其中冬凌草甲素注射剂高浓度组大部分细胞破碎。冬凌草甲素注射剂 5.5、11、22 μmol/L 作用 24 h 后
SGC-7901 细胞凋亡率分别为 7.07%、18.57%、22.96%；钙离子荧光强度高于对照组；线粒体膜电位荧光强度显著低于对照
组。结论 冬凌草甲素注射剂通过升高 SGC-7901 细胞[Ca2+]i 诱导细胞凋亡。
关键词：冬凌草甲素注射剂；人胃癌 SGC-7901 细胞；细胞凋亡；钙离子；线粒体膜电位
中图分类号：R282.71; R979.19 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)10 - 2051 - 05
Inducement of Oridonin Injection to SGC-7901 cell apoptosis and its mechanisms
JI Yu-bin1, 2, GANG-jian1, 2, GAO Shi-yong1, 2
1. Life Sciences and Environmental Sciences Research Center, Harbin Commerce University, Harbin 150076, China
2. Engineering Research Center of Natural Anticancer Drugs, Ministry of Education, Harbin 150076, China
Abstract: Objective To study the apoptosis of Oridonin Injection against human gastric carcinoma SGC-7901 cell line and its
relationship with intracellular calcium concentration([Ca2+]i ). Methods The cytotoxicy of Oridonin Injection against SGC-7901 cells
was evaluated by MTT assay. Morphology of SGC-7901 cells was observed by inverted microscope. Cell apoptosis rate was measured
by flow cytometry. [Ca2+]i of SGC-7901 cells and mitochondrial membrane potential (MMP)were determined by laser scanning
confocal microscope. Results IC50 of Oridonin Injection to SGC-7901 cells was 21.74 μmol/L. Cell density decrease, cell shrinkage,
and cell breakage in high-dose group were observed 48 h after administration. The apoptosis rate values of 5.5, 11, and 22 μmol/L
Oridomin Injection groups 24 h after administration were 7.07%, 18.57%, and 22.96%, respectively. Fluorescence intensity (FI) values
of [Ca2+]i were significantly higher than those in control group. And FI values of MMP were significantly lower than those in control
group. Conclusion Oridonin Injection could induce cell apoptosis by increasing [Ca2+]i of SGC-7901 cells.
Key words: Oridonin Injection; human gastric carginoma SGC-7901 cells; apoptosis; calcium; mitochondrial membrane potential
冬凌草甲素（oridonin）是从唇形科香茶菜属
[Rabdosia (Bl.) Hassk.]植物中分得的一种贝壳杉烯
二萜类化合物，主要来源植物有香茶菜 R.
amethystoides (Benth.) Hara、显脉叶香茶菜 R.
nervosa (Hemsl.) C. Y. Wu et H. W. Li、毛叶香茶菜
R. jabdsia (Burm. f.) Hara、冬凌草（亦称碎米亚）
R. rubescens (Hemsl.) Hara 以及延命草 Isodon
japonicus (N. Burman) H. Hara [1]。冬凌草中主要抗
癌活性成分是冬凌草甲素，其味道极苦[2]，具有清
热解毒、消炎止痛、抗肿瘤之功效，用于治疗扁桃
体炎、咽喉肿痛，对多种癌症有缓解症状和延长生
存时间的作用，也可作为增强放化疗疗效的辅药[3]。
研究表明，冬凌草甲素对 20 余种人癌细胞株生长均
有明显的直接抑制作用[4]，对多种肿瘤细胞如白血
病细胞 NB4[5]、肝癌细胞 BEL-7402[6]、膀胱癌细胞
MB49[7]、黑色素瘤细胞 A357-S2[8]等的增殖具有明

收稿日期：2011-04-10
基金项目：黑龙江省新世纪优秀人才支持计划（1251-NCET-019）；黑龙江省研究生创新基金项目（YJSCX2011-163HLJ）
作者简介：季宇彬（1956—），男，博士，教授，博士生导师，研究方向为中药药理、肿瘤药理及分子药理学。
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 10 期 2011 年 10 月

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显的抑制作用。然而由于冬凌草甲素不溶于水，口
服难吸收，静脉给药的剂型一直未得到很好地解决。
鉴于冬凌草甲素注射剂的细胞毒活性相关研究报道
很少，本课题组观察不同浓度的冬凌草甲素注射剂
对人胃癌 SGC-7901 细胞生长的抑制作用及凋亡诱
导作用，并观察细胞内 Ca2+浓度（[Ca2+]i）与冬凌
草甲素注射剂诱导 SGC-7901 细胞凋亡的关系，以
探讨冬凌草甲素注射剂诱导 SGC-7901 细胞凋亡的
作用机制。
1 材料与仪器
1.1 细胞株
人胃癌 SGC-7901 细胞株，由哈尔滨商业大学
生命科学与环境科学研究中心药物研究所博士后科
研工作站传代保种。
1.2 药品与试剂
冬凌草甲素注射剂（1 mg/mL，质量分数 98%），
由哈尔滨商业大学药物研究所制备提供；羟基喜树
碱（5 mg/支，批号 20110301），黄石飞云制药有限
公司产品，批号；RPMI 1640 细胞培养基，购自美
国Gibco公司；MTT购自北京索莱宝科技有限公司；
二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶、溴化丙啶（PI），
购自美国 Sigma 公司。Fluo-3/AM，购自美国
Molecular probe 公司。JC-1 试剂盒由碧云天生物技
术研究所提供。
1.3 仪器
CO—150 型二氧化碳培养箱（美国 NBS 公司），
EPICS—XL 型流式细胞仪（美国 Beckman Coulter
公司），CKX—41—32 型倒置显微镜（日本 Olympus
公司），SW—CJ—2F 型超净工作台（苏州净化设备
厂），680 型酶标仪（美国 Bio-Rad 公司），SP—2
型激光共聚焦扫描显微镜（德国 Leica 公司）。
2 方法
2.1 MTT 法检测冬凌草甲素注射剂的细胞毒活性
取对数生长期的 SGC-7901 细胞，胰酶消化后，
调整细胞浓度为 1×104/mL，按每孔 100 μL 接种于
96 孔板中，于 37 ℃、5% CO2 的培养箱中培养 24 h
后，分别加入终浓度为 3.125、6.25、12.5、25、50
μmol/L 冬凌草甲素注射剂药液 100 μL，每个浓度设
6 个平行孔，对照组加相同体积的培养液，阳性对
照组加 2.5、5、10、20、40 μmol/L 的羟基喜树碱
100 μL，于 37 ℃、5% CO2 培养箱中继续培养 72 h
后弃上清，每孔加入 0.5 mg/mL MTT 溶液 100 μL，
于 37 ℃、5% CO2 培养箱中继续培养 4 h，弃上清，
每孔加 DMSO 150 μL，振荡混匀后用酶标仪在检测
波长为 570 nm 条件下测吸光度（A）值，计算细胞
抑制率和 IC50。
抑制率＝（对照组 A 值－给药组 A 值）/对照组 A 值
2.2 倒置显微镜观察细胞形态学改变
取对数生长期的 SGC-7901 细胞，调整细胞浓
度为 1×105/mL，接种于培养瓶中，24 h 后分别加
入终浓度为 5.5、11、22 μmol/L 的冬凌草甲素注射
剂，18 μmol/L 的羟基喜树碱，于 37 ℃、5% CO2
培养箱中培养 24 h 后，倒置显微镜下（10×40 倍）
观察细胞形态。
2.3 流式细胞术测定细胞凋亡率
取对数生长期的 SGC-7901 细胞，培养 24 h 后
分别加入终浓度为 5.5、11、22 μmol/L 冬凌草甲素
注射剂，培养 24 h 后收集细胞，1 500 r/min 离心 5
min，PBS 洗 3 次，用 70%冰乙醇并于－20 ℃固定
过夜，然后 PBS 洗 3 次，加入 PI 染液（含 PI 50
mg/mL、RNase 1 g/L、0.1% TritonX-100）4 ℃避光
染色 30 min，调整细胞浓度至适当，300 目尼龙网
滤过后上机检测，激发波长 488 nm，发射波长 525
nm[9]，收集测定 10 000 个细胞。
2.4 激光共聚焦扫描显微镜检测细胞中游离 Ca2+
的变化
取对数生长期的 SGC-7901 细胞并调整细胞浓
度至适当，接种于 6 孔培养板中，每孔 1 mL，置
CO2 培养箱内培养 24 h 后，加入不同浓度的冬凌草
甲素注射剂，使冬凌草甲素终浓度分别为 1.25、2.50、
5.00 μmol/L，阳性对照组加羟基喜树碱（终浓度为
2.50 μmol/L），对照组加相同体积的 RPMI 1640 培养
液。置 37 ℃、5% CO2培养箱中培养 24 h，收集细
胞，加入终浓度为 1 μg/mL 的 Fluo-3/AM 荧光探针，
37 ℃避光培养 30 min，1 500 r/min 离心 5 min，弃
上清，收集细胞用 PBS 洗 3 次后调整细胞浓度至适
当，取 200 μL 用激光共聚焦扫描显微镜观察 Ca2+荧
光强度，激发波长 488 nm，发射波长 540～570 nm。
2.5 激光共聚焦扫描显微镜检测线粒体膜电位
取对数生长期的 SGC-7901 细胞调整浓度至适
当，接种于 6 孔培养板中，每孔 1 mL，置 37 ℃、5%
CO2培养箱内培养 24 h 后，加入不同浓度的冬凌草甲
素注射剂，使冬凌草甲素终浓度分别为 1.25、2.50、
5.00 μmol/L。阳性对照组加羟基喜树碱（终浓度为
2.50 μmol/L），对照组加相同体积的 RPMI 1640 培养
液，作用 24 h 后收集细胞，加入 0.5 mL 的 JC-1 染色
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试剂盒工作液混匀，37 ℃培养 20 min，1 500 r/min
激光共聚焦扫描显微镜观察线粒体膜电位荧光强度，
激发波长为 488 nm，发射波长为 540～570 nm[10-12]。
2.6 统计学处理
数据以 sx ± 表示，采用 t 检验法进行组间差异
比较。
3 结果
3.1 对 SGC-7901 细胞的细胞毒活性
冬凌草甲素注射剂对 SGC-7901 细胞的 IC50为
21.74 μmol/L，羟基喜树碱的 IC50为 17.46 μmol/L。
结果见图 1。
3.2 对 SGC-7901 细胞形态学的影响
对照组细胞贴壁生长，细胞膜完整。冬凌草素
注射剂各组细胞生长密度随给药浓度的增加而逐渐
变疏，细胞表面起皱，高浓度组大部分细胞破碎，
细胞形态不完整，贴壁细胞数量减少。羟基喜树碱
18 μmol/L 组给药后细胞表面起皱，大部分细胞破
碎，细胞形态不完整。结果见图 2。

图 1 冬凌草甲素注射剂对SGC-7901 细胞的细胞毒活性 (n=6)
Fig. 1 Cytotoxic activity of Oridonin Injection on SGC-7901 (n=6)

图 2 冬凌草甲素注射剂对 SGC-7901 细胞形态的影响
Fig. 2 Effect of Oridonin Injection on morphology of SGC-7901 cells
3.3 对 SGC-7901 细胞凋亡的诱导作用
冬凌草甲素注射剂 5.5、11、22 μmol/L 分别作
用于人胃癌 SGC-7901 细胞 24 h 后，出现细胞凋亡
的亚二倍体峰，细胞凋亡率分别为 7.07%、18.57%、
22.96%，羟基喜树碱组的细胞凋亡率为 27.25%，对
照组细胞凋亡率为 4.95%。结果见图 3。
3.4 对 SGC-7901 细胞[Ca2+]i 的影响
冬凌草甲素注射剂 1.25、2.50、5.00 μmol/L 对
SGC-7901 作用 24 h 后，以浓度正相关方式增强细
胞内 Ca2+的荧光强度，与对照组比较具有统计学意
义（P＜0.05、0.01），表明冬凌草甲素注射剂可升
高 SGC-7901 细胞[Ca2+]i。结果见表 1。
3.5 对 SGC-7901 细胞膜电位的影响
冬凌草甲素注射剂 1.25、2.50、5.00 μmol/L 对
SGC-7901 作用 24 h 后，细胞线粒体膜电位的荧光
强度均降低，且膜电位随冬凌草甲素注射剂浓度的
增加而降低，与对照组比较具有统计学意义（P＜
0.01），表明冬凌草甲素注射剂可降低 SGC-7901 细
胞线粒体膜电位。结果见表 2。
4 讨论
冬凌草中的主要抗癌活性成分是冬凌草甲素和
冬凌草乙素，其中冬凌草甲素占冬凌草抗癌活性成
分的 90%[13-14]。近 30 年来，国内外学者对冬凌草
甲素进行了多方面的研究，体外实验显示冬凌草甲
素对多种肿瘤细胞株，如小鼠成纤维细胞 L929、人
表皮癌细胞 A431、人肝癌细胞 HepG2、人肠癌细
胞 Lovo 等均有凋亡诱导作用，但作用机制因细胞
系的不同而各异，而对 SGC-7901 胃癌的研究较少。
此外，由于冬凌草甲素水溶性较差，增加了其注射
剂制备的难度，限制了其使用，冬凌草甲素注射剂
的药理研究也较少。本实验观察了冬凌草甲素注射
剂对 SGC-7901 细胞生长的抑制及凋亡诱导作用，
并通过检测细胞[Ca2+]i 研究冬凌草甲素注射剂诱导
SGC-7901 细胞凋亡的作用机制。
MTT 法检测显示，冬凌草甲素注射剂对
SGC-7901 细胞有很好的细胞毒活性。形态学观察
发现，冬凌草甲素注射剂组细胞生长密度逐渐变疏，
细胞变小、皱缩，细胞破碎，细胞形态不完整、贴
100
80
60
40
20
0
抑
制
率
/%

0 10 20 30 40 50 60
C / (μmol·L−1)
羟基喜树碱
冬凌草甲素注射剂

对照 羟基喜树碱 5.5 11 22
冬凌草甲素注射剂 / (μmol·L−1)
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图 3 冬凌草甲素注射剂对 SGC-7901 细胞凋亡的影响
Fig. 3 Effect of Oridonin Injection on apoptosis of SGC-7901 cells
表 1 冬凌草甲素注剂对 SGC-7901 细胞[Ca2+]i 的影响
( 50=± n , sx )
Table 1 Effect of Oridonin Injection on [Ca2+]i in SGC-7901
cells ( 50=± n , sx )
组别 C / (μmol·L−1) 荧光强度
对照 － 17.72±0.28
羟基喜树碱 2.50 19.00±0.49*
冬凌草甲素注射剂 1.25 28.06±0.45**
2.50 28.51±0.25**
5.00 29.80±0.31**
与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
*P<0.05 **P<0.01 vs control group
表 2 冬凌草甲素注射剂对 SGC-7901 细胞线粒体膜电位的
影响 ( 50=± n , sx )
Table 2 Effect of Oridonin Injection on mitochondrial membrane
potential in SGC-7901 cells ( 50=± n , sx )
组别 C / (μmol·L−1) 荧光强度
对照 － 35.99±0.13
羟基喜树碱 2.50 27.07±0.51**
冬凌草甲素注射剂 1.25 32.03±0.41**
2.50 28.21±0.18**
5.00 24.67±0.41**
与对照组比较：**P＜0.01
**P<0.01 vs control group
壁减少，且随给药浓度的增加作用增强，表明冬凌
草甲素注射剂对 SGC-7901 细胞有抑制作用。流式
细胞仪检测表明，不同浓度的冬凌草甲素注射剂作
用 SGC-7901 细胞 24 h 后，出现明显的凋亡峰，说
明该注射剂对 SGC-7901 细胞的抑制作用与其诱导
细胞凋亡有关。细胞凋亡有 3 个主要的信号传导通
路，即线粒体通路、死亡受体通路、内质网通路。
这 3 个信号转导通路都与 Ca2+关系密切。在正常情
况下，细胞质中 Ca2+维持在低水平，而在细胞外、
线粒体和内质网中的[Ca2+]i 要比细胞质中高得多，
因此轻微的Ca2+释放即可显著升高细胞质内Ca2+水
平。在诱导肿瘤细胞凋亡过程中，外界的刺激因素
与细胞表面受体相结合，引起 4, 5-磷脂酰肌醇二磷
酸水解产生 1, 4, 5-肌醇三磷酸，使细胞[Ca2+]i上升；
Ca2+水平的改变可触发线粒体通透孔道（permea-
bility transition pore，PTP）开放[15]，PTP 的开放允
许相对分子质量＞1 500 的分子通过，使离子和呼吸
链底物在线粒体基质和胞质之间达到平衡，导致线
粒体电子传递链与氧化磷酸化解偶联、膜电位降低、
ATP 合成与还原性谷胱甘肽减少、细胞内活性氧增
多，导致线粒体基质膨胀，外膜皱襞少，表面积小，
易于破裂，释放出膜间促凋亡蛋白，最终引起细胞
凋亡。本实验利用 Fluo-3/AM 荧光探针，采用激光
共聚焦扫描显微镜观察冬凌草甲素注射剂对




420
350
280
210
140
70
0
300
250
200
150
100
50
0
360
300
240
180
120
60
0
180
150
120
90
60
30
0
240
200
160
120
80
40
0
细
胞
数

细
胞
数

细
胞
数

细
胞
数

细
胞
数

0 32 64 96 128 160 192 224 256 0 32 64 96 128 160 192 224 256
0 32 64 96 128 160 192 224 256 0 32 64 96 128 160 192 224 256 0 32 64 96 128 160 192 224 256
DNA Content
对照 羟基喜树碱
冬凌草甲素注射剂
5.5 μmol·L−1
冬凌草甲素注射剂
11 μmol·L−1
冬凌草甲素注射剂
22 μmol·L−1
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SGC-7901 细胞[Ca2+]i 的影响，发现冬凌草甲素注射
剂可升高 SGC-7901 细胞[Ca2+]i，且随给药浓度的升
高作用增强。线粒体膜电位与细胞内钙库钙离子的
释放是相互关联的，因此细胞内钙库释放引起的胞
浆游离 Ca2+浓度升高必将导致线粒体膜电位的改
变。在本实验中采用激光共聚焦扫描显微术观察了
膜电位的变化，发现冬凌草甲素注射剂可降低
SGC-7901 细胞的线粒体膜电位。以上结果表明凌
草甲素注射剂通过升高 SGC-7901 细胞[Ca2+]i 诱导
细胞凋亡的发生。
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